CONFRONTO TRA QUATTRO TERRENI SELETTIVI PER L ... · 3.2.1 Bacilli Gram negativi 7 3.2.2 Le...

Lavoro di diploma di Sandra Jovic

Formazione tecnico in analisi biomediche

Scuola superiore medico tecnica, Locarno, 2009

CONFRONTO TRA QUATTRO TERRENI SELETTIVI PER L’IDENTIFICAZIONE

RAPIDA PRESUNTIVA DI ENTEROBATTERIACEAE PRODUTTRICI

DI ENZIMI ESBL

Lavoro svolto presso:

Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM), Bellinzona

Dipartimento Medicina di Laboratorio dell’Ente Ospedaliero Cantonale (EOC), Ospedale Regionale di Lugano (ORL),

sede Civico

Con la collaborazione di:

Supervisore Dr. Tiziano Balmelli

Dr. Antonella Demarta

2

INDICE

1. RIASSUNTO, ABSTRACT 4

2. ABBREVIAZIONI 5

3. INTRODUZIONE 6 3.1 Problematiche e obiettivi dello studio 6 3.2 Aspetti scientifici legati a ESBL 7 3.2.1 Bacilli Gram negativi 7 3.2.2 Le Enterobatteriaceae 8 3.2.3 Pseudomonas aeruginosa 8 3.2.4 Acinetobacter baumannii 8 3.2.5 Stenotrophomonas maltophilia 8 3.3 Gli antibiotici β-lattamici in medicina 8 3.4 Microrganismi multirestenti: MRSA e VRE 10 3.5 Meccanismi di azione delle β-lattamasi 10 3.6 Meccanismi di resistenza ai β-lattamici 10 3.7 Gli ESBL 11 3.7.1 Epidemiologia 11 3.8 Caratterizzazione degli ESBL: TEM, SHV, OXA, CTX-M 12 3.8.1 AmpC 12 3.8.2 K1 12 3.9 Rilevamento di ESBL all’ICM 13 3.9.1 Caratterizzazione fenotipica 13 3.9.2 Caratterizzazione genotipica 13

4. MATERIALI E METODI 14 4.1 Piastre 14 4.2 Microrganismi 15 4.3 Produzione della piastra CIVA Agar 16

4.4 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae produttori e non di ESBL e ceppi non Enterobatteriaceae 17

4.4.1 Organizzazione del lavoro per i ceppi batterici 17 4.5 Messa in evidenza di batteri produttori di ESBL a partire da materiali biologici 17 4.5.1 Uricult 17 4.5.2 Feci 18 4.5.3 Secrezioni respiratorie, puntati e strisci 18 4.5.4 Organizzazione del lavoro per i materiali biologici 18

5. RISULTATI 19 5.1 Caratteristiche delle colonie sulle piastre 19 5.2 Campioni 20 5.3 Tempo di incubazione 24 o 48 ore 22 5.4 Risultati ottenuti con le piastre 22 5.4.1 Risultati ottenuti con ChromIDTM ESBL Agar 23 5.4.2 Risultati ottenuti con BLSE Agar 23 5.4.3 Risultati ottenuti con EbSA Agar 24 5.4.4 Risultati ottenuti con CIVA Agar 24

6. DISCUSSIONE 25 6.1 Sensitività e specificità 25 6.2 PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive value) 25 6.3 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae 25 6.3.1 Interpretazione dei risultati ottenuti 25

3

6.3.2 Identificazione a livello di specie batterica 26 6.3.3 Possibilità di discriminare bacilli Gram negativi non Enterobatteriaceae 26 6.3.4 L’influenza di AmpC e K1 27 6.4 Materiale biologico 27 6.4.1 Interpretazione dei risultati ottenuti 27 6.4.2 Feci 28 6.4.3 Possibilità di discriminare le Enterobatteriace dalle non Enterobatteriaceae 28 6.5 Confronto con altri studi 28

7. CONCLUSIONI 30

8. BIBLIOGRAFIA 31

9. RINGRAZIAMENTI 33

10. ALLEGATI 34 Allegato 1: Skim Milk (BBL) 34 Allegato 2: Agar Sangue (Oxoid) 34 Allegato 3: Mac Conkey (Difco) 34 Allegato 4: Drigalski Agar (Biokar Diagnostics) 34 Allegato 5: Ossidasi (Sigma) 35 Allegato 6: E-Test (AB Biodisk) 35 Allegato 7: Phoenix Epicenter (BD) 37 Allegato 8: MALDI-TOF MS (AXIMA) 38 Allegato 9: Geni ESBL, risultati ottenuti all’ICM 39 Allegato 10: Influenza di AmpC e K1 40 Allegato 11: Classificazione degli antibiotici β-lattamici 41 Allegato 12: Fotografie piastre 42

4

1. RIASSUNTO 1. ABSTRACT

La resistenza batterica attribuita alle ESBL (β-lattamasi a spettro esteso) è stata riscontrata all’inizio degli anni ’80 per la prima volta nella pratica clinica in Europa e successivamente negli Stati Uniti dopo l’introduzione delle cefalosporine di terza generazione. Attualmente questo meccanismo di resistenza viene riscontrato ovunque e le Enterobatteriaceae produttrici di enzimi ESBL (E-ESBL) sono riconosciute in tutto il mondo come patogeni ospedalieri. Con questo lavoro si vuole determinare il terreno di crescita migliore per la messa in evidenza rapida di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL, allo scopo di individuare eventuali pazienti portatori di E-ESBL in breve tempo. Si è deciso quindi di testare quattro terreni selettivi, tre pronti per l’uso ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e uno da preparare all’ICM di nome CIVA Agar. Sono stati analizzati 49 ceppi batterici (colture pure) della famiglia Enterobatteriaceae e 32 materiali biologici risultati positivi tramite il metodo di referenza E-Test. La specificità e la sensitività delle quattro piastre sono state testate sia utilizzando i 49 ceppi che i 32 materiali biologici. Per i 49 ceppi batterici testati i valori di sensitività migliori sono stati ottenuti con le piastre ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar, e quelli di specificità con la EbSA Agar. Per i materiali biologici le piastre ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar hanno dato i risultati più soddisfacenti. Dal punto di vista del laboratorio di analisi microbiologiche, si può concludere che l’uso della piastra ChromIDTM ESBL Agar permetterebbe uno screening efficace e rapido per l’identificazione di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL.

The bacterial resistance attributed to the ESBL (Extended Spectrum β-Lactamases) was found at the beginning of the 80s for the first time in Europe and afterwards in the United States, after the introduction of third generation cephalosporins into clinical practice. Currently, this mechanism of resistance is widespread and the Enterobacteriaceae producing the enzymes ESBL (E-ESBL) are recognised all over the world as hospital pathogens. The aim of this study was to determine the culture medium most suitable for the rapid identification of Enterobacteriaceae-producing ESBL, in order to recognise in a short time probable patient carriers of E-ESBL. It was decided, therefore, to test four selective culture media, three of which are ready to use: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar and EbSA Agar and one which has to be prepared in ICM, namely CIVA Agar. A collection of 49 bacterial strains (pure culture) of the family Enterobacteriaceae and 32 biological samples which had resulted positive through the reference method E-Test, were analysed. The specificity and sensitivity of the four plates were tested either by using the 49 strains or the 32 the biological samples. For the 49 bacterial strains tested the best values of sensitivity were obtained using the plates ChromIDTM ESBL Agar and BLSE Agar, and those of specificity using the plate EbSA Agar. For the biological samples the plates ChromIDTM ESBL Agar and BLSE Agar gave the most satisfactory results. From the point of view of the microbiological laboratory of analyses, it can be concluded that the use of the plate ChromIDTM ESBL Agar would allow an effective and rapid screening for the identification of Enterobacteriaceae-producing ESBL.

5

2. ABBREVIAZIONI

AmpC Ampicillina C, gene di resistenza ATCC American Type Culture Collection BLSE Agar β-Lactamase-Spectrum-Extended Agar (Axon Lab AG) ChromIDTM ESBL Agar Chromogenic Identification ESBL Agar (Biomérieux) CIVA Agar Ceftazidime Inositol Vancomycin Amphotericin-B Agar CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMI Concentrazione minima inibente CT Cefotaxima CTL Cefotaxima e acido clavulanico CTX-M Cefotoximasi EbSA Agar ESBL Screening Agar (Alpha Omega Development-Production B.V.) EOC Ente Ospedaliero Cantonale ESBL Extended Spectrum β-Lactamases E-ESBL Enterobatteriaceae produttrici di enzimi ESBL ICM Istituto Cantonale di Microbiologia ID Identificazione KESC Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass

Spectrometry MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards NEG Negativo NPV Negative predictive value ORL Ospedale Regionale di Lugano OXA Oxacillinasi POS Positivo PBPs Penicillin Binding Proteins PCR Polymerase Chain Reaction PM Cefepima PML Cefepima e acido clavulanico PPV Positive predictive value K1 Gene K1 SHV Sulphydryl Variable TEM Temoniera TZ Ceftazidima TZL Ceftazidima e acido clavulanico VRE Vancomycin-Resistant Enterococcus

6

3. INTRODUZIONE

3.1 Problematiche e obiettivi dello studio

Questo lavoro nasce dalla sempre maggiore consapevolezza che la capacità di riconoscere le farmacoresistenze batteriche, conseguenti allo svilupparsi di meccanismi di resistenza, è un problema di grande rilevanza per la sanità pubblica [1].

L’EOC sta valutando un test rapido selettivo per l’identifcazione degli ESBL da introdurre nella pratica quotidiana, allo scopo di prevenire eventuali epidemie ospedaliere.

Con questo lavoro si vuole determinare il terreno di crescita migliore, per sensitività e specificità, per la messa in evidenza di E-ESBL in materiali biologici.

In funzione dei dati presentati in letteratura [2, 3, 4, 5] i Dr. Tiziano Balmelli e Dr. Antonella Demarta hanno scelto i seguenti quattro terreni selettivi:

1. ChromIDTM ESBL Agar (Chromogenic Identification ESBL Agar) [2], 2. BLSE Agar (β-Lactamase-Spectrum-Extended Agar) [3], 3. EbSA Agar (ESBL Screening Agar) [4], 4. CIVA Agar (Ceftazidime Inositol Vancomycin Amphotericin-B Agar) [5].

Figura 1 ChormIDTM ESBL Agar Figura 2 BLSE Agar Figura 3 EbSA Agar Figura 4 CIVA Agar

Il metodo di riferimento ritenuto come Gold Standard per la determinazione dei ceppi produttori di ESBL è l’E-Test [Allegato 6].

Sapendo che alcuni generi di batteri hanno normalmente una resistenza conosciuta agli antibiotici contenuti nelle piastre per il rilevamento degli ESBL (ceftazidima, cefotaxima), e presumendo la possibilità per questi batteri di crescere sulle piastre scelte, si è voluto verificarne il comportamento di crescita e la possibilità di distinguerli macroscopicamente da ceppi della famiglia Enterobatteriaceae. Si sono perciò analizzati 6 ceppi batterici della famiglia Xanthomonadaceae, 6 ceppi batterici della famiglia Moraxellaceae e 5 ceppi batterici della famiglia Pseudomonadaceae [Tabella 2].

In previsione di un’eventuale possibilità di utilizzo delle piastre per uno screening dei pazienti tramite striscio anale con lo scopo di evidenziare eventuali portatori di ESBL, si sono presi in considerazione 6 campioni di feci [Tabella 3]. L’importanza di questa analisi è di verificare l’incidenza della flora commensale sulla messa in evidenza di ESBL.

7

Figura 5 Batterio bacillo Gram negativo [7]

a = fimbria: struttura tubolare piena che consente al batterio di aderire alla superficie b = pilo: appendice filamentosa di batteri Gram negativi c = capsula: strato mucoso che circonda la parete di alcune specie batteriche; può avere potere immunogeno d = parete cellulare: strato cellulare che circonda la membrana plasmatica e = membrana plasmatica: barriera selettivamente permeabile tra il citoplasma e l’ambiente extracellulare f = flagello: appendice flessibile che serve per il movimento g = plasmide: DNA extracromosomico circolare e contenente informazioni accessorie. Può replicarsi indipendentemente dal cromosoma principale e nella coniugazione può essere trasferito da una cellula all’altra (trasformazione). h = nucleoide: conosciuto come regione nucleare o corpo della cromatina, è una regione dalla forma irregolare che contiene materiale genetico

Figura 6 Struttura esterna dei batteri Gram negativi [7]

a = strato esterno / b = strato interno / c = membrana plasmatica d = parete lipoproteica / e = complesso polare di trasporto f = lipide A: lipopolisaccaride / g = glicide

3.2 Aspetti scientifici legati a ESBL

3.2.1 Bacilli Gram negativi

Le famiglie di batteri appartenenti ai bacilli Gram negativi sono le Enterobatteriaceae, le Pseudomonadaceae, le Moraxellaceae, le Xanthomonadaceae e altre famiglie. Sono di piccole dimensioni con lunghezza da 0.5-1.5 μm a 2-4 μm. Possono essere anaerobi o aerobi. Possiedono dei pili e alcuni presentano flagelli per la loro mobilità e una capsula. Lo strato esterno, tipico dei batteri Gram negativi, è costituito prevalentemente da lipopolisaccaridi collegati tra loro da proteine che attravesano lo spazio periplasmatico. Alla frazione glicidica si deve il potere immunogeno dei Gram negativi. Il lipide A forma una struttura rigida che rende la cellula batterica impermeabile a molte sostanze, antibiotici o disinfettanti. Nello strato esterno si trovano le porine che delimitano dei canali di selezione di sostanze in entrata nella cellula. Per questo motivo i Gram negativi risultano meno sensibili dei Gram positivi nei confronti di alcuni antibiotici, in quanto le porine ne impediscono l’ingresso. All’interno della parete vi sono complessi molecolari di trasporto, responsabili del pompaggio verso l’esterno di sostanze nocive eventualmente penetrate nella cellula. Lo strato interno della parete possiede pompe proteiche di efflusso collegate a proteine periplasmatiche di fusione che continuano in canali nello strato esterno. La loro funzione è di pompare le sostanze direttamente nell’ambiente

esterno, per evitare che si accumulino nel periplasma e tornino nuovamente nel citoplasma batterico. Molti componenti della parete sono immunogeni e come tali inducono nell’ospite una reazione immunitaria ai batteri. La conoscenza della struttura della parete, oltre che per caratterizzare il tipo antigenico dei batteri, è importante per la terapia, in quanto diversi antibiotici agiscono proprio sui costituenti o sui processi di sintesi della parete. I bacilli Gram negativi sono i più comuni costituenti della flora endogena umana del cavo orale, tratto gastrointestinale e vaginale e risultano i più frequenti agenti eziologici di una vasta

gamma di infezioni, come per esempio infezioni urinarie, ginecologiche, polmonari [6, 7].

f

g

d

a b c

e

8

Figura 7 Anello β-lattamico [11]

I bacilli Gram negativi utilizzati per questo studio sono stati della famiglia Enterobatteriaceae, batterio Pseudomonas aeruginosa, batterio del genere Acinetobacter e batterio Stenotrophomonas maltophilia.

3.2.2 Le Enterobatteriaceae

Le Enterobatteriaceae sono bacilli Gram negativi anaerobi facoltativi. Sono ossidasi negativi, utilizzano il glucosio con un metabolismo di tipo fermentativo con o senza produzione di gas.

Le Enterobatteriaceae si trovano nell’intestino, come commensali, dell’uomo e degli animali. Sono la famiglia batterica più importante in medicina. Diversi generi sono patogeni per l’uomo perché provocano infezioni soprattutto di tipo gastroenterico e urinario. I principali batteri della famiglia Enterobatteriaceae di interesse ospedaliero appartengono ai generi Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Proteus, Morganella e Providencia [8].

3.2.3 Pseudomonas aeruginosa

I batteri del genere Pseudomonas sono molto diffusi nel suolo, nelle acque, sulle piante e in piccolo numero anche nell’intestino dell’uomo e degli animali. Pseudomonas aeruginosa è strettamente aerobica e ossidasi positiva. Questa specie batterica è stata isolata in ambiente ospedaliero da infezioni delle vie aeree. Questo batterio rimane problematico in ambito nosocomiale per la resistenza intrinseca a differenti classi di antibiotici e per la capacità di acquisire rapidamente resistenze per effetto di mutazioni in caso di trattamento [8].

3.2.4 Acinetobacter baumannii I batteri del genere Acinetobacter sono immobili, aerobi stretti, ossidasi positivi. La specie più importante per le infezioni ospedaliere è Acinetobacter baumannii. Questa specie causa infezioni delle vie respiratorie ed urinarie, setticemie, ascessi cerebrali ed altre manifestazioni cliniche più deboli. Gli isolati clinici di Acinetobacter presentano spesso un elevato livello di resistenza ai β-lattamici dovuto alla produzione dell’enzima β-lattamasi o ad una ridotta permeabilità della membrana esterna [9].

3.2.5 Stenotrophomonas maltophilia

La specie più importante del genere Stenotrophomonas in ambiente ospedaliero è Stenotrophomonas maltophilia. È aerobico ed ubiquitario (acqua, suolo, animali e piante). Frequentemente ritrovato a livello della flora commensale dell’uomo. Può essere isolato, come contaminante, nel cibo, nelle macchine per la fabbricazione del ghiaccio, negli umidificatori e in diversi apparecchi ospedalieri. Può causare polmonite, meningite, sovrainfezione di ferite chirurgiche, come pure infezioni urinarie, gastrointestinali e ossee. Anche Stenotrophomonas maltophilia può diventare resistente a numerosi antibiotici. Il batterio riesce a produrre una β-lattamasi e la sua membrana esterna è poco permeabile, conferendo la resistenza agli antibiotici [10].

3.3 Gli antibiotici β-lattamici in medicina

Tutti gli antibiotici β-lattamici hanno in comune lo stesso anello β-lattamico [Figura 7], [11]; la penicillina è stato il primo antibiotico β-lattamico scoperto nel 1928 [12].

La funzione dei β-lattamici è quella di inibire la sintesi della parete della cellula batterica, interferendo nella formazione dei legami peptidici tra le molecole del peptidoglicano (proteina che costituisce la parete dei batteri

Gram negativi) che conferisce alla parete rigidità e resistenza alla lisi osmotica. La struttura sulla quale agisce l’anello β-lattamico è

9

chiamato proteina legante la penicillina (Penicillin Binding Protein, PBP) e contiene il sito attivo in grado di legare l’antibiotico β-lattamico [13]. Nei batteri Gram negativi, tra la membrana esterna e quella citoplasmatica, si trova lo spazio periplasmatico che è sede sia della parete del peptidoglicano sia degli enzimi β-lattamasici, come penicillasi e cefalosporinasi, capaci di idrolizzare l’anello β-lattamico degli antibiotici. L’organizzazione strutturale dei Gram negativi rende difficile l’attacco da parte degli antibiotici β-lattamici, perché questi devono diffondere attraverso porine presenti sulla membrana esterna per poter raggiungere le maglie di peptidoglicano e la membrana citoplasmatica dove si trovano i siti bersaglio.

Gli antibiotici β-lattamici sono suddivisi in sei gruppi con le rispettive sottoclassi [Tabella 1] [14].

Tabella 1 Classificazione degli antibiotici β-lattamici [14]

CLASSE SOTTOCLASSE

Penicilline

Penicilline Aminopenicilline Ureidopenicilline

Carbossipenicilline Peniccillasi

Amidinopenicilline

Cefemici

Cefalosporine di prima generazione Cefalosporine di seconda generazione

Cefalosporine di terza generazione Cefalosporine di quarta generazione

Cefamicine Oxacefemici

Cefemici (orali) Cefalosporine Carbapenemici

Monobattamici -

Penemici Carbapenemici

Penemici β-lattamasi inibitori -

10

3.4 Microrganismi multirestenti: MRSA e VRE

La diffusione di microrganismi patogeni multiresistenti costituisce un fenomeno in continua evoluzione e rappresenta una crescente minaccia per l’ambiente ospedaliero. Tra i batteri multiresistenti agli antibiotici, hanno assunto particolare rilevanza nell’ultimo decennio gli MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), i VRE (Vancomycin-Resistant Enterococcus) e gli enterobatteri ESBL (Extended Spectrum β-Lactamases) [8]. Questi microrganismi sono oggetto di una sorveglianza epidemiologica per limitarne la disseminazione. In tutti i casi l’applicazione delle misure standard di prevenzione, eseguita secondo il servizio Igiene Ospedaliera EOC [13] come l’igiene delle mani, è essenziale. In situazioni epidemiche sono messe in atto misure supplementari quali l’isolamento del paziente e la decontaminazione selettiva dei pazienti [14, 15, 16].

Gli MRSA sono ceppi di Staphylococcus aureus che hanno sviluppato una resistenza alle penicilline (meticillina, oxacillina, flucloxacillina). Sono responsabili di infezioni invasive (endocarditi, meningiti, polmoniti, altro), cutaneo-mucose, urinarie e colonizzazione di corpi estranei (cateteri, pace-makers, altro) [15, 16].

I batteri del genere Enterococcus sono riconosciuti sempre più come agenti patogeni causanti infezioni urinarie, setticemie, infezioni di ferita ed endocarditi. Il problema delle infezioni nosocomiali causate da Enterococchi è aggravato dal fatto che sempre più ceppi diventano resistenti agli antibiotici glicopeptidici, come la vancomicina, e sono quindi difficili da curare. La vancomicina, antibiotico appartenente a questa classe ed ottenuta da Streptomyces orientalis, è utilizzata in caso di resistenza o allergia ad altri antibiotici, ma è inattiva contro batteri Gram negativi e micobatteri [17].

3.5 Meccanismi di azione delle β-lattamasi

In presenza di β-lattamasi, i β-lattamici sono idrolizzati nel sito attivo dell’enzima per la presenza di un gruppo ossidrile presente nella serina terminale della catena laterale della β-lattamasi. Si forma così un legame covalente e l’anello β-lattamico è idrolizzato in presenza di una

molecola d’acqua, provocando l’apertura dell’anello β-lattamico e quindi inattivando l’antibiotico [Figura 8], [19].

Sulla base delle sequenze aminoacidiche il sistema di classificazione di Ambler divide le β-lattamasi in quattro gruppi. Il processo mediante serina terminale avviene con le β-lattamasi del gruppo A, C e D. Per quanto riguarda il gruppo B l’enzima presenta nel sito attivo uno ione di zinco, ma il principio è simile [20].

3.6 Meccanismi di resistenza ai β-lattamici

I più importanti e comuni meccanismi della resistenza agli antibiotici β-lattamici nei microrganismi Gram negativi sono [19, 21, 22]:

1. diminuzione dell’assorbimento dell’antibiotico a livello citoplasmatico dovuta alla mutazione delle proteine di membrana, questa modifica riduce il grado di penetrazione del β-lattamico,

2. alterazione del bersaglio dell’antibiotico, causato dalle alterazioni delle PBPs che portano ad una minore affinità tra la proteina e l’antibiotico,

Figura 8 Idrolisi da parte delle β-lattamsi [18]

11

3. produzione di enzimi capaci di degradare o alterare il β-lattamico, le β-lattamasi, che rappresentano il meccanismo principale della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici [19, 21].

3.7 Gli ESBL

Come le VRE e MRSA anche gli ESBL, che tradotto in italiano significa beta lattamasi a spettro esteso (o allargato), hanno un’importanza particolare a causa dell’elevata probabilità d’insuccesso del trattamento antibiotico. Questo conduce ad una mortalità elevata, il prolungamento dell’ospedalizzazione ed un aumento dei costi [8].

Data l’importanza a livello terapeutico ospedaliero di ceppi produttori di ESBL, il CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, da www.clsi.org), raccomanda che i pazienti che hanno sviluppato un’infezione da E-ESBL, siano documentati in modo tale da trasmettere questa informazione alle strutture presso le quali il paziente dovrà essere trasferito o ricoverato in futuro [8].

Gli enzimi che idrolizzano l’anello β-lattamico degli antibiotici β-lattamici sono oggigiorno molto importanti perché sono frequenti nei batteri Gram negativi, ed in particolare nelle Enterobatteriaceae [21].

Questi enzimi idrolizzano e conferiscono resistenza agli antibiotici oximino-cefalosporine di seconda e terza generazione. I geni che codificano per gli ESBL includono geni presenti in molti batteri anche ambientali che hanno subito mutazioni, conferendo all’enzima la capacità di idrolizzare le oximino-cefalosporine. Questi geni si trovano su plasmidi e sono designati dalle sigle blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaCTX-M [21].

Esistono altre importanti forme di resistenza ai β-lattamici che devono essere distinte da ESBL:

• iperproduzione di AmpC (ampicillinasi C) cromosomica (Enterobacter spp.),

• iperproduzione di AmpC plasmidico (Escherichia coli),

• iperproduzione di K1 cromosomica (Klebsiella oxytoca),

• resistenza efflusso-mediata (Pseudomonas aeruginosa),

• resistenza con vari meccanismi (Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia) [21].

3.7.1 Epidemiologia

Gli ESBL sono osservati negli ospedali, in particolare nei servizi di cure intense, ma anche in strutture di cura a lunga degenza. Secondo gli studi, la durata media del soggiorno di un paziente dal momento di un’infezione da E-ESBL si allunga di 10-17 giorni. Uno studio del 2004 [8] dimostra che gli ESBL possono anche essere responsabili di colonizzazioni ed infezioni comunitarie. Nel corso di un periodo di 16 mesi sono stati isolati dei ceppi di Escherichia coli produttori di ESBL da 49 pazienti ambulatoriali che mostravano sintomi di un’infezione comune. Si trattava prevalentemente di persone anziane con infezioni urinarie. Il 22% era portatore di una sonda e il 57% presentava ripetute infezioni urinarie. Il 67% dei pazienti aveva ricevuto un antibiotico nei due mesi precedenti la diagnosi. I fattori di rischio per Escherichia coli produttrici di ESBL erano l’età avanzata, il diabete, infezioni urinarie ripetute ed un’ospedalizzazione nel corso dell’anno precedente. Non sono disponibili dati europei o svizzeri per questo gruppo di pazienti, anche se il tasso di colonizzazione in Svizzera e in Europa sembrerebbe più basso che altrove [8].

12

3.8 Caratterizzazione degli ESBL: TEM, SHV, OXA, CTX-M

BlaTEM, blaSHV, blaOXA e blaCTX-M sono geni che conferiscono al batterio il fenotipo ESBL. Si riscontrano soprattutto in microrganismi della famiglia Enterobatteriaceae e sono responsabili della resistenza ai β-lattamici.

• TEM β-lattamasi: conferiscono resistenza all’ampicilina, alle penicilline ed alle cefalosporine e sono spesso riscontrate in ceppi di Klebsiella pneumoniae.

• Il tipo SHV dà resistenza agli antibiotici ceftazidima e cefotaxima, entrambe cefalosporine di terza generazione, ed è predominante in ceppi di Klebsiella pneumoniae.

• Le β-lattamasi tipo OXA conferiscono al batterio una resistenza all’ampicillina e alle cefalotine, come pure all’oxacillina e alla cloxacillina. Sono riscontrate in ceppi di Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.

• Le CTX-M β-lattamasi danno resistenza a cefotaxima e ceftazidima, e sono riscontrate soprattutto in ceppi di Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae [12].

3.8.1 AmpC

Le AmpC β-lattamasi sono delle cefalosporinasi clinicamente importanti. Sono codificate nei cromosomi di molte Enterobatteriaceae e pochi altri microrganismi (Actinobacteria, Proteobacteria, Oceanospirillales, Pseudomonadaceae e Xanthomonadaceae) [23]. In molti batteri gli enzimi AmpC sono inducibili e possono essere espressi a livelli elevati in seguito a mutazioni nel promotore del sistema di regolazione. La sovraespressione conferisce resistenza oltre che alle cefalosporine di terza generazine, fra cui cefotaxima, ceftazidima e cefotriaxone anche alle cefalosporine di quarta generazione (cefamicine). Questo rappresenta un problema soprattutto nel caso di infezioni causate da Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae. In queste specie, infatti, un ceppo inizialmente sensibile può divenire resistente in seguito a terapia con gli antibiotici sopracitati. Esistono plasmidi trasmissibili che hanno acquisito i geni per gli enzimi AmpC e che possono essere espressi in batteri come Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis nei quali il gene blaAmpC non è presente sul cromosoma o è solo scarsamente espresso. Per definizione i batteri resistenti ai β-lattamici tramite l’enzima AmpC non sono considerati ESBL in quanto il gene blaAmpC stesso non è mutato [24].

3.8.2 K1

Anche il gene K1 viene sovraespresso per deregolazione del gene cromosomico K1 o per acquisizione di un gene trasferibile K1 su un plasmide o su altri elementi mobili. Quindi, quando la β-lattamasi K1 iperprodotto (come l’AmpC), il batterio è resistente ai β-lattamici, ma, normalmente, sensibile alla ceftazidima. L’iperproduzione di K1 viene espressa per la maggior parte in ceppi di Klebsiella oxytoca. Come per l’AmpC, i batteri resistenti ai β-lattamici tramite il gene K1 non sono definiti ESBL [12].

13

Figura 9 Zona fantasma solo con PM/PML [25]

3.9 Rilevamento di ESBL all’ICM

3.9.1 Caratterizzazione fenotipica

Il metodo che applica l’ICM per la conferma della diagnosi fenotipica dei batteri produttori di ESBL è l’E-Test. È un metodo commerciale quantitativo per la determinazione della CMI (concentrazione minima inibente) di un singolo agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi e per la determinazione della presenza di ESBL [Allegato 9]. Lo stipite sospetto per ESBL è generalmente segnalato in automatico dall’apparecchio Phoenix [Allegato 7]. Nel caso di un antibiogramma manuale, vi sono alcuni antibiotici che servono da indicatori per ESBL, come ceftazima (≤ 22 mm), cefotaxima (≤ 27 mm), cefpodoxima (≤ 17 mm), ceftriaxone (≤25 mm) e aztreonam (≤ 27 mm). La conferma viene eseguita con E-Test per ESBL, una combinazione di strisce contenenti un antibiotico cefotaxima (CT), cefepime (PM), ceftazidima (TZ) ed una combinazine degli stessi antibiotici con un inibitore, l’acido clavulanico: CTL, PML, TZL.

L’interpretazione dei valori delle CMI si basa, in linea di principio, sui criteri emessi dal CLSI. La CMI va letta nel punto di completa inibizione della crescita, considerando anche piccole colonie e colonie isolate. Il risultato emesso è dato in µg/ml con l’interpretazione sensibile, intermedio o resistente. Il rapporto tra l’antibiotico e antibiotico con acido clavulanico deve essere ≥ 8 µg/ml. La produzione di enzimi ESBL è confermata quando nel test appare una zona “fantasma”, così chiamata in quanto assume la forma di un fantasma [Allegato 6].

Nella figura 9 si nota che ceftazidima (TZ) e cefotaxima (CT) non sono attivi sul ceppo batterico testato, come pure la combinazione degli stessi antibiotici con l’inibitore di β-lattamasi acido clavulanico (TZL e CTL rispettivamente). Nel caso della cefepime (PM) il rapporto tra i valori di CMI letti con e senza acido clavulanico (striscio centrale nella figura) dà un valore superiore a 8 µg/ml. Il ceppo batterico viene quindi considerato essere produttore di ESBL.

3.9.2 Caratterizzazione genotipica

Il metodo che è stato applicato all’ICM per la diagnosi genotipica dei batteri produttori di ESBL è una PCR Multiplex che permette di determinare la presenza ed il tipo di gene di resistenza tramite primer specifici [26].

14

4. MATERIALI E METODI

4.1 Piastre

Qui di seguito vengono elencate le piastre utilizzate in questo lavoro:

• ChromIDTM ESBL Agar [2]

Piastra pronta per l’uso della ditta Biomérieux, Avenue Banc 51, 1211 Genève, ref. 43481, lotto 827027801/828522501.

Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata): peptoni (suini o bovini) (17.2 g), l. triptofano (0.9 g), tampone Hepes (0.4 g), miscela cromogena (6.87 g), miscela selettiva (0.38 g), agar (18.0 g), miscela di antibiotici tra cui cefpodoxima (0.004 g).

• BLSE Agar [3]

Doppia piastra pronta per l’uso della ditta Axon Lab AG, Täfernstrasse 15, 5405 Baden, ref. AEB525770, lotto 830437/900718.

Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata): Mac Conkey agar [Allegato 3] (50.0 g), ceftazidima (0.002 g) / Drigalski agar [Allegato 4] (51.0 g), cefotaxima (0.0015 g).

• EbSA Agar [4]

Doppia piastra pronta per l’uso della ditta Alpha Omega Development-Production B.V, Gentsestraat 225-2587 HR’Gravenhage, Netherlands, ref. 120990, lotto 69924/6010.

Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata): Mac Conkey agar (14.0 g), cefotaxima (0.001 g), cloxacillina (0.4 g), vancomincina (0.064 g) / Mac Conkey agar (14.0 g), ceftazidima (0.001 g), cloxacillina (0.4 g), vancomicina (0.064 g).

• CIVA Agar [5]

Piastra preparata all’istituto cantonale di microbiologia, Bellinzona.

Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata con Milli-Q Academic System): peptone di caseina digerita con pancreas (ditta Fluka Analytical, 500 g, ref. 70169, lotto 1398993) (11.0 g), estratto di carne bovina (ditta BD, 500 g, ref. 212610, lotto 7088076) (3.0 g), Myo – inositolo (ditta Fluka Analytical, 500 g, ref. 57570, lotto 1250799) (12.0 g), cloruro di sodio (ditta Fluka Biochemika, 1 kg, ref. 71376, lotto 1344323) (8.5 g), blu di bromotimolo (ditta Riedel-de Haen, 5 g, ref. 32714, lotto 61080) (0.03 g), agar batteriologico (Agar no. 1) (ditta Oxoid, 500 g, ref. LP0011, lotto 994025-02) (17.0 g), Fortam (ceftazidima) (ditta GlaxoWellcome, 1 g, ref. E0759301, lotto 6N941) (0.002 g), vancomycin hydrocloride from Streptomyces orientalis (ditta Fluka Analytical, 250 mg, ref. 94747, lotto 1406533) (0.01 g), amphotericin B from Streptomyces ssp (ditta Fluka Analytical, 50 mg, ref. 10042, lotto 1348127) (0.0045 g).

I costi di materiale per le piastre sono: • ChromIDTM ESBL Agar CHF 2.40 • BLSE Agar CHF 4.03 • EbSA Agar CHF 3.00 • CIVA Agar CHF 1.00

15

4.2 Microrganismi

I ceppi batterici ed i materiali biologici sono elencati nella tabella 2 e 3.

• Collezione di 49 ceppi della famiglia Enterobatteriaceae, Xanthomonadaceae specie Stenotrophomonas maltophilia, Moraxellaceae specie del genere Acinetobacter e Pseudomonadaceae specie Pseudomonas aeruginosa.

Tabella 2 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, Xanthomonadaceae, Moraxellaceae e Pseudomonadaceae provenienti dall’ICM. I ceppi numero ATCC 25922 e ATCC 700603 sono considerati controlli di qualità e la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) li raccomanda nei test di conferma per ESBL. Sono del marchio ATCC (American Type Culture Collection) [2].

CEPPO SPECIE CEPPO SPECIE CEPPO SPECIE

10/07 Escherichia coli 0S62 Escherichia coli 51/08 Proteus mirabilis

05/07 Escherichia coli 0S184 Escherichia coli Amp73 Proteus mirabilis

27/07 Escherichia coli 78/08 Klebsiella oxytoca 0S14 Citrobacter freundii



94/07 Escherichia coli 55/07 Klebsiella oxytoca 65/06 Stenotrophomonas maltophilia

100/07 Escherichia coli 56/07 Klebsiella oxytoca E8137 Stenotrophomonas maltophilia

84/07 Escherichia coli 87/07 Klebsiella pneumoniae 10/09 Stenotrophomonas maltophilia



13/07 Escherichia coli ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae 13/09 Stenotrophomonas maltophilia

14/07 Escherichia coli 72/06 Enterobacter sakazakii 132/06 Acinetobacter baumannii

16/07 Escherichia coli 0S688 Enterobacter aerogenes AC49 Acinetobacter spp.

22/07 Escherichia coli 93/05 Enterobacter cloacae AC48 Acinetobacter johnsonii

32/07 Escherichia coli 0S46 Enterobacter cloacae AC43 Acinetobacter iwoffi

40/07 Escherichia coli 0S128 Enterobacter cloacae AC39 Acinetobacter baumannii

51/07 Escherichia coli 50/07 Bacillo gram negativo NE AC37 Acinetobacter baumannii

88/07 Escherichia coli 74/07 Salmonella spp. U7904 Pseudomonas aeruginosa

58/07 Escherichia coli 0S91 Hafnia alvei 7881 Pseudomonas aeruginosa

U34313 Escherichia coli 0S29 Serratia liquefaciens 7885 Pseudomonas aeruginosa

ATCC 25922 Escherichia coli 0S453 Serratia marcescens 7543 Pseudomonas aeruginosa

0S438 Escherichia coli U31142 Proteus mirabilis 8395 Pseudomonas aeruginosa

16

• 32 materiali biologici inseminati all’ICM, provenienti da strutture sanitarie del canton Ticino.

Tabella 3 Materiali biologici inseminati all’ICM.

4.3 Produzione della piastra CIVA Agar [5]

Sono state pesate le sostanze indicate nel capitolo 4.1 con la bilancia analitica (Mettler Toledo PG6002-S) per versarli in una bottiglia da un litro contenente il miscelatore magnetico senza l’aggiunta di antibiotici. È stato preriscaldato una certa quantità d’acqua demineralizzata inferiore ad un litro per 4 minuti nel microonde. L’acqua è stata versata nella bottiglia. Il contenuto è stato mescolato con l’agitatore magnetico per 15 minuti, allo scopo di sciogliere i reagenti. La soluzione è stata poi portata alla quantità di un litro e con la sua striscia TST Control [Figura 10] collocata nell’autoclave. L’autoclave (Fedegari Autoclavi SPA, serie FOB) ha mantenuto la temperatura di 121 °C per 15 minuti poi la temperatura è diminuita fino a 80°C. Dopo circa un’ora, alla fine del ciclo di sterilizzazione, è stato controllato che l’indicatore TST Control sia virato da giallo a blu, indicando che il processo di sterilizzazione è avvenuto correttamente [Figura 11].

Figura 10 TST Control prima della sterilizzazione

Figura 11 TST Control dopo la sterilizzazione

La soluzione è stata mescolata con l’agitatore magnetico fino a raggiungere una temperatura inferiore a 50°C. I tre a antibiotici sono stati pesati e disciolti in 3 mL di acqua sterile demineralizzata, per essere poi versati nella bottiglia da un litro, sterilizzando ogni volta il bordo della bottiglia e coprendo con carta alu.

NUMERO MATERIALE NUMERO MATERIALE

R7819 Espettorato VA9018 Ferita profonda

R5119 Espettorato VA3868 Striscio ulcera

R40108 Espettorato indotto G3431 Striscio uretrale

R40103 Espettorato indotto G7278 Striscio vaginale

R37476 Aspirato bronchiale U4979 Uricult



VA34331 Puntato easy flow drenaggio U4944 Uricult

VA38021 Puntato ginocchio U4397 Uricult

VA38020 Puntato drenaggio U4931 Uricult

VA8758 Puntato F5177 Feci

VA3068 Ferita superficiale F5088 Feci



VA7259 Striscio ferita profonda F5199 Feci

VA5620 Striscio ferita profonda F5016 Feci

17

La bottiglia è stata lasciata raffreddare con l’agitatore magnetico per un’ora circa. Le piastre sono state riempite con l’aiuto dell’apparecchio e tubo sterile e lasciate solidificare fino al giorno seguente.

4.4 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae produttori e non di ESBL e ceppi non Enterobatteriaceae

Nella prima parte del lavoro è stata testata una collezione di 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae [Tabella 2], provenienti da pazienti ospedalizzati in Ticino, con fenotipo ESBL positivo o negativo precedentemente testati tramite E-Test [Allegato 6] e conservati nella ceppoteca all’ICM. È stata pure testata una collezione di 17 ceppi non Enterobatteriaceae (Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa e specie del genere Acinetobacter) provenienti dalla ceppoteca dell’ICM non testati con E-Test.

Per avere colture fresche i 66 ceppi batterici, congelati a -80 °C nel terreno di conservazione Skim Milk [Allegato 1], sono stati scongelati e trapiantati su piastre non selettive Agar sangue [Allegato 2] ed incubate a 37°C per 24 ore, prima di iniziare il confronto delle quattro piastre.

Di ogni ceppo batterico è stata presa una colonia dall’Agar sangue ed inseminata direttamente sulle quattro differenti piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar.

4.4.1 Organizzazione del lavoro per i ceppi batterici

• Produzione della piastra CIVA Agar. • Coltivazione dei 66 ceppi batterici su Agar sangue. • Inseminazione di una colonia batterica, prelevata da Agar sangue, sulle quattro differenti

piastre: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar. • Prima incubazione in aereobiosi a 37°C. • Prima lettura delle piastre dopo 24 ore. • Seconda incubazione in aereobiosi a 37°C. • Seconda lettura delle piastre dopo 48 ore.

4.5 Messa in evidenza di batteri produttori di ESBL a partire da materiali biologici

In un secondo tempo, le piastre di coltura selezionate sono state testate utilizzando un totale di 32 materiali biologici [Tabella 3] di diversa natura provenienti da strutture sanitarie del canton Ticino, cioè 9 strisci, 4 puntati, 7 campioni di secrezioni respiratorie, 6 campioni uricult e 6 campioni di feci, nei quali le analisi precedentemente eseguite dal reparto di batteriologia dell’ICM hanno messo in evidenza la presenza di ceppi batterici produttori di ESBL.

4.5.1 Uricult

Dall’uricult, dal terreno Agar Cled [27] è stata presa un’ansata di colonie batteriche, sospese e vortexate in 5 ml di NaCl 0.9%. La sospensione di colonie è stata inseminata sulle quattro piastre in esame: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar e EbSA Agar.

18

4.5.2 Feci

Si sono presi in considerazione 6 campioni di feci [Tabella 3], dal reparto di batteriologia, per verificare l’influsso di eventuali batteri della flora commensale sul rilevamento di E-ESBL nelle varie piastre.

Dapprima i campioni sono stati inseminati direttamente sulle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar. Dopo incubazione di 24 e 48 ore i quattro terreni presentavano diverse colonie. Le colonie morfologicamente diverse sono state isolate su Agar sangue [Allegato 2] e Mac Conkey [Allegato 3] e messe ad incubare a 37°C per 24 ore per ottenere colonie pure. Dopodiché è stato eseguito il test dell’ossidasi [Allegato 5] dall’Agar sangue, allo scopo di distinguere le Enterobatteriaceae da non Enterobatteriaceae. In seguito i singoli ceppi batterici sono stati analizzati mediante Phoenix Epicenter (BD) [Allegato 7] per l’identificazione rapida e la determinazione della sensibilità antimicrobica dei batteri. Per l’identificazione della specie batterica i batteri sono stati pure analizzati con MALDI-TOF MS (AXIMA) (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry) [Allegato 8] mediante la spettrometria di massa. L’E-Test [Allegato 6] è stato eseguito come da direttive ICM.

4.5.3 Secrezioni respiratorie, puntati e strisci

L’inseminazione è stata eseguita applicando il materiale biologico direttamente sulle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar e EbSA Agar.

4.5.4 Organizzazione del lavoro per i materiali biologici

• Produzione della piastra CIVA Agar. • Sospensione del materiale dal terreno Cled dei 6 campioni di Uricult in NaCl. • Inseminazione dei rispettivi materiali biologici direttamente sulle quattro differenti piastre:

ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar. • Prima incubazione in aereobiosi a 37°C. • Prima lettura delle piastre dopo 24 ore. • Seconda incubazione in aereobiosi a 37°C. • Seconda lettura delle piastre dopo 48 ore.

19

5. RISULTATI

5.1 Caratteristiche delle colonie sulle piastre

Nella tabella 4 sono elencate le caratteristiche delle colonie che crescono sulle piastre ChromIDTM ESBL Agar [2], BLSE Agar [3] e CIVA Agar [5], secondo i prospetti forniti dalle rispettive ditte.

La piastra EbSA Agar [4] non possiede alcuna particolarità che può differenziare un particolare ceppo batterico. Le colonie, se presenti, sono di colore rosa.

Tabella 4 Caratteristiche delle colonie per le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar e CIVA Agar

COLORE E CARATTERISTICA COLONIE GENERE-SPECIE BATTERIO

Ch

rom

IDTM

ESB

L A

gar Rosa-bordeaux Escherichia coli

Verde, verde tendente al marrone o blu

GRUPPO KESC: Klebsiella

Enterobacter Serratia

Citrobacter

Marrone chiaro a marrone scuro Proteus

Providencia Morganella

BLS

E A

gar

Drigalski Agar Giallo

Escherichia coli Klebsiella spp.

Enterobacter spp.

Blu Altre Enterobatteriaceae

Pseudomonas

Mac Conkey Agar

Rosa Escherichia coli Klebsiella spp.

Enterobacter spp.

Bianco a incolore Altre Enterobatteriaceae

Pseudomonas

CIV

A A

gar

Giallo - Estremamente mucose Klebsiella spp. Incolore - Larghe, piatte Escherichia coli

Giallo Enterobacter spp. Giallo pallido Serratia spp.

Incolore - Opache Citrobacter koseri Incolore - Larghe Proteus vulgaris

20

24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE10/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS05/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS27/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS90/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS89/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS94/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS100/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS84/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS NEG POS POS POS47/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS12/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS13/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS14/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS16/07 Escherichia coli POS NEG POS POS POS NEG NEG POS POS22/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS32/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS40/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS51/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS88/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS58/07 Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POS

U34313 Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEGATCC 25922 Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

0S438 Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG0S62 Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG0S184 Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG78/08 Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS123/08 Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS34/08 Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS55/07 Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS56/07 Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS NEG POS POS POS87/07 Klebsiella pneumoniae POS POS POS POS POS POS POS POS POS04/07 Klebsiella pneumoniae POS POS POS POS POS POS POS POS POS73/07 Klebsiella pneumoniae POS POS POS POS POS POS POS POS POS

ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae POS POS POS POS POS POS POS POS POS72/06 Enterobacter sakazakii POS POS POS POS POS POS POS POS POS0S688 Enterobacter aerogenes NEG POS POS POS POS POS POS POS POS93/05 Enterobacter cloacae POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG0S46 Enterobacter cloacae NEG NEG POS POS POS NEG NEG NEG NEG0S128 Enterobacter cloacae NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG50/07 Bacillo Gram negativo NE POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG74/07 Salmonella spp. POS NEG POS NEG POS NEG NEG NEG NEG0S91 Hafnia alvei NEG NEG POS POS POS POS POS NEG NEG0S29 Serratia liquefaciens NEG NEG POS POS POS NEG NEG NEG NEG0S453 Serratia marcescens NEG NEG POS NEG POS NEG NEG NEG NEGU31142 Proteus mirabilis NEG POS POS POS POS POS POS NEG NEG51/08 Proteus mirabilis POS POS POS POS POS POS POS POS POSAmp73 Proteus mirabilis NEG POS POS POS POS POS POS POS POS0S14 Citrobacter freundii NEG POS POS POS POS POS POS NEG NEG0S255 Citrobacter freundii NEG POS POS POS POS POS POS NEG NEG0S565 Citrobacter freundii NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

CIVA Agar EbSA AgarE-TESTCEPPO SPECIE BATTERICA ChromIDTM ESBL Agar BLSE Agar

5.2 Campioni

Nelle tabelle 5 e 6 sono riportati i risultati ottenuti dalle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar che sono state inoculate con la collezione di 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae e con i 32 materiali biologici.

Tabella 5 Risultati delle piastre utilizzando una collezione di ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae dell’ICM

ROSSO positivo per ESBL NERO negativo per ESBL

21

24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORER7819 Espettorato Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

R5119 EspettoratoEscherichia coli Proteus mirabilis POS POS POS POS POS POS POS POS POS

R40108 Espettorato indottoEscherichia coli

Providencia stuartii POS POS POS POS POS POS POS POS POS

R40103 Espettorato indotto Providencia stuartii POS POS POS POS POS POS POS POS POS

R37476 Aspirato bronchialeEscherichia coli (POS)

Citrobacter freundii (NEG)POS POS POS POS POS NEG POS NEG NEG

R5961 Aspirato bronchiale Proteus mirabilis POS POS POS POS POS NEG POS POS POSR3329 Aspirato bronchiale Enterobacter cloacae NEG POS POS POS POS POS POS POS POS

VA34331Puntato easy flow

drenaggio

Stenotrophomonas maltophilia

Enterobacter cloacaePOS POS POS POS POS POS POS POS POS

VA38021 Puntato ginocchio Klebsiella oxytoca POS NEG NEG POS POS NEG NEG NEG NEGVA38020 Puntato drenaggio Klebsiella oxytoca POS POS POS POS POS POS POS POS POSVA8758 Puntato Enterobacter cloacae NEG POS POS POS POS NEG POS POS POSVA3068 Ferita superficiale Citrobacter freundii NEG NEG NEG NEG NEG NEG POS NEG NEGVA7727 Ferita superficiale Citrobacter freundii NEG NEG NEG POS POS NEG NEG NEG NEGVA8741 Ferita superficiale Enterobacter cloacae NEG POS POS POS POS POS POS POS POS

VA7259 Striscio ferita profondaEscherichia coli (POS) Morganella morganii

(NEG)POS POS POS POS POS NEG NEG POS POS

VA5620 Striscio ferita profonda Enterobacter aerogenes POS POS POS POS POS POS POS POS POS

VA9018 Ferita profondaAchromobacter xyloxians Staphylococcus aureus NEG POS POS POS POS POS POS POS POS

VA3868 Striscio ulcera Escherichia coli POS POS POS POS POS POS POS POS POSG3431 Striscio uretrale Enterobacter aerogenes NEG POS POS POS POS POS POS POS POSG7278 Striscio vaginale Escherichia coli NEG POS POS POS POS POS POS POS POSU4979 Uricult Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEGU4403 Uricult Escherichia coli NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEGU4370 Uricult Citrobacter freundii NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEGU4944 Uricult Enterobacter cloacae NEG POS POS POS POS POS POS POS POSU4397 Uricult Enterobacter cloacae POS POS POS POS POS POS POS POS POS

U4931 UricultHafnia alvei

Klebsiella pneumoniae NEG NEG NEG POS POS POS POS NEG NEG

F5177 Feci Enterococcus faecium NEG NEG POS NEG NEG NEG NEG NEG NEG

F5088 Feci

Hafnia alvei Citrobacter freundii Stenotrophomonas

maltophilia Pseudomonas aeruginosa

NEG POS POS POS POS POS POS POS POS

F5086 FeciHafnia alvei

Morganella morganii NEG NEG NEG NEG POS NEG NEG NEG NEG

F5169 FeciMorganella morganii Citrobacter freundii NEG POS POS POS POS POS POS NEG NEG

F5199 Feci Pseudomonas aeruginosa NEG POS POS POS POS POS POS POS POSF5016 Feci Enterobacter cloacae POS POS POS POS POS POS POS POS POS

BLSE Agar CIVA Agar EbSA AgarE-TESTNUMERO MATERIALE SPECIE ISOLATA

ChromIDTM ESBL Agar

Tabella 6 Risultati delle piastre utilizzando 32 materiali biologici testati all’ICM


22

24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE65/06 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS POS POS NEG NEGE8137 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG10/09 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS POS POS NEG NEG11/09 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS POS POS POS POS12/09 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS POS POS NEG NEG13/09 Stenotrophomonas maltophilia POS POS POS POS POS POS POS POS132/06 Acinetobacter baumannii POS POS POS POS POS POS POS POSAC49 Acinetobacter spp POS POS POS POS POS POS POS POSAC48 Acinetobacter johnsonii NEG NEG POS POS NEG NEG NEG NEGAC43 Acinetobacter iwoffi POS POS POS POS POS POS POS POSAC39 Acinetobacter baumannii POS POS POS POS POS POS POS POSAC37 Acinetobacter baumannii POS POS POS POS NEG NEG NEG NEGU7904 Pseudomonas aeruginosa POS POS POS POS POS POS POS POSR7881 Pseudomonas aeruginosa POS POS POS POS POS POS POS POSR7885 Pseudomonas aeruginosa POS POS POS POS POS POS POS POSR7543 Pseudomonas aeruginosa POS POS POS POS POS POS POS POSR8395 Pseudomonas aeruginosa POS POS POS POS POS POS POS POS

SPECIE BATTERICACEPPOChromIDTM ESBL Agar BLSE Agar CIVA Agar EbSA Agar

Nella tabella 7 sono riportati i risultati ottenuti dalle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar che sono state inseminate con la collezione di 17 ceppi batterici della famiglia non Enterobatteriaceae [Tabella 2] dell’ICM senza confrontarli con il metodo di referenza E-Test in quanto non si esegue di routine per questi microrganismi.

Tabella 7 Risultati delle piastre utilizzando una collezione di ceppi batterici della famiglia non Enterobatteriaceae dell’ICM.


5.3 Tempo di incubazione 24 o 48 ore

Su 49 ceppi batterici Enterobatteriaceae, la piastra ChromIDTM ESBL Agar ha mostrato 6 ulteriori batteri positivi dopo 48 ore; la BLSE Agar e CIVA Agar ne ha mostrato 2 e la EbSA Agar non ha mostrato nessun cambiamento.

Su 32 materiali biologici, la piastra ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar hanno dato entrambe un ulteriore positività dopo 48 ore; la CIVA Agar ne ha date 4 e la EbSA Agar, ancora una volta, nessun cambiamento.

La piastra EbSA Agar è l’unica che non è influenzata dopo un maggiore tempo di incubazione.

5.4 Risultati ottenuti con le piastre

Per analizzare i terreni di coltura, è stata valutata la specificità e sensitività e sono state calcolate le rispettive PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive value), ossia le valutazioni predittive positive e negative concernenti i 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae [Tabella 8, 10, 12, 14] e i 32 materiali biologici [Tabella 9, 11, 13, 15], il tutto confrontato con il metodo di referenza E-Test. La specificità è calcolata dividendo i veri negativi per la somma di veri negativi e falsi positivi. La sensitività è calcolata dividendo i veri positivi per la somma di veri positivi e falsi negativi. Il PPV è calcolato dividendo i veri positivi per la somma di veri positivi e falsi positivi. L’NPV è calcolato dividendo i veri negativi per la somma di veri negativi e falsi negativi.

23

Positivi Negativi

Veri positivi Falsi positivi

24h / 48h 24h / 48 h

31 / 33 5 / 9

Falsi negativi Veri negativi

24h / 48h 24h / 48h

2 / 0 11 / 7

E-Test

Chr

omID

TM

ESB

L A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

12 / 12 10 / 11


24h / 48h 24h / 48h

1 / 1 9 / 8Chr

omID

TM

ESB

L A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

E-Test

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

32 / 33 8 / 9


24h / 48h 24h / 48h

1 / 0 8 / 7

E-Test

BLS

E A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

13 / 13 12 / 13


24h / 48h 24h / 48h

0 / 0 7 /6

E-Test

BLS

E A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

5.4.1 Risultati ottenuti con ChromIDTM ESBL Agar

Tabella 8 Tabella di specificità e sensitività per la piastra Tabella 9 Tabella di specificità e sensitività per la piastra ChromIDTM ESBL Agar riguardanti i ceppi batterici ChromIDTM ESBL Agar riguardanti i materiali biologici

Specificità: 24 ore: 69% 48 ore: 44% Specificità: 24 ore: 47% 48 ore: 42% Sensitività: 24 ore: 94% 48 ore: 100% Sensitività: 24 ore: 92% 48 ore: 92% PPV: 24 ore: 86% 48 ore: 79% PPV: 24 ore: 55% 48 ore: 52% NPV: 24 ore: 85% 48 ore: 100% NPV: 24 ore: 90% 48 ore: 89%

5.4.2 Risultati ottenuti con BLSE Agar

Tabella 10 Tabella di specificità e sensitività per la piastra Tabella 11 Tabella di specificità e sensitività per la piastra BLSE Agar riguardanti i ceppi batterici BLSE Agar riguardanti i materiali biologici


24

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

30 / 30 2 / 2


24h / 48h 24h / 48h

3 / 3 14 / 14

E-Test

EbSA

Aga

r

Pos

itiv

iN

egat

ivi

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

11 / 11 9 / 9


24h / 48h 24h / 48h

2 / 2 10 / 10

E-Test

EbSA

Aga

r

Pos

itiv

iN

egat

ivi

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

24 / 26 6 / 6


24h / 48h 24h / 48h

9 / 7 10 / 10

E-Test

CIV

A A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

Positivi Negativi


24h / 48h 24h / 48h

9 / 11 10 / 12


24h / 48h 24h / 48h

4 / 2 9 / 7

E-Test

CIV

A A

gar

Pos

itiv

iN

egat

ivi

5.4.3 Risultati ottenuti con EbSA Agar

Tabella 12 Tabella di specificità e sensitività per la piastra Tabella 13 Tabella di specificità e sensitività per la piastra EbSA Agar riguardanti i ceppi batterici EbSA Agar riguardanti i materiali biologici


5.4.4 Risultati ottenuti con CIVA Agar

Tabella 14 Tabella di specificità e sensitività per la piastra Tabella 15 Tabella di specificità e sensitività per la piastra CIVA Agar riguardanti i ceppi batterici CIVA Agar riguardanti i materiali biologici


25

ChromIDT M ESBL Agar BLSE Agar EbSA Agar CIVA AgarCosto (CHF) per piastra 2.40 4.03 3.00 1.00Tempo di incubazione

consigliato da ditte/pubblicazioni

18 / 24 ore 24 ore 18 / 24 ore 24 ore

Tempo di incubazione eseguito per questo studio

24 / 48 ore 24 / 48 ore 24 / 48 ore 24 / 48 ore

Specificità 69% / 44% 50% / 44% 88 % / 88% 63% / 63%Sensitività 94% / 100% 97% / 100% 91% / 91% 73% / 79%

PPV 86% / 79% 80% / 79% 93% / 93% 80% / 82%NPV 85% / 100% 89% / 100% 82% / 82% 53% / 59%

6. DISCUSSIONE

6.1 Sensitività e specificità

Dal punto di vista diagnostico di laboratorio, per questo studio la sensitività e la specificità sono parametri impiegati per valutare la capacità di individuare l’esistenza di un terreno di crescita migliore tra le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar, come pure valutare la reale presenza di batteri produttori di ESBL nei materiali biologici di pazienti.

La sensitività rappresenta la probabilità che il test sia positivo in caso di effettiva presenza di ceppo batterico di ESBL: più alta è la sensitività, meno falsi negativi esistono.

La specificità rappresenta la probabilità che il test sia negativo in caso di effettiva non presenza di ceppo batterico di ESBL e più alta è la specificità, meno falsi positivi ci sono.

6.2 PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive value)

I parametri PPV e l’NPV sono stati calcolati per avere i risultati completi dello studio anche dal punto di vista della diagnosi di laboratorio. Infatti il PPV e l’NPV aiutano a valutare da un punto di vista statistico i terreni selettivi di studio.

6.3 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae

6.3.1 Interpretazione dei risultati ottenuti

La collezione dei 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae dell’ICM sono state testate con le quattro piastre di studio e confrontate con metodo di referenza E-Test dell’ICM.

La seguente tabella rappresenta un riassunto dei risultati ottenuti con le quattro piastre:

Tabella 16 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti con le piastre per i ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae

La sensitività della piastra ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar sono ottime, in quanto riescono ad evitare tutti i falsi negativi dopo 48 ore di incubazione. Queste due piastre riescono a rilevare tutti i veri positivi di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL. La piastra EbSA Agar risulta avere una buona sensitività e la piastra CIVA Agar è quella che mostra maggior numero falsi negativi rispetto alle altre tre piastre.

La piastra EbSA Agar è l’unica che presenta una buona specificità. Le altre tre piastre hanno dato più falsi positivi rispetto alla EbSA Agar, abbassando in modo elevato la specificità.

26

Gli ulteriori meccanismi di resistenza agli antibiotici presenti nelle piastre hanno permesso la crescita delle colonie sulle piastre, facendo diminuire la specificità.

6.3.2 Identificazione a livello di specie batterica

Oltre al rilevamento di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL, le ditte fornitrici di piastre ChromIDTM ESBL Agar [2], BLSE Agar [3] e uno studio che concerne la piastra CIVA Agar [5] confermano la possibilità di identificare la specie o genere batterica macroscopicamente.

Dei 49 ceppi della famiglia Enterobatteriaceae le colonie cresciute sulle piastre hanno dato il seguente risultato:

• 92% per la ChromIDTM ESBL Agar; 37 ceppi sono cresciuti, di cui 34 hanno presentato le caratteristiche di crescita da poterle identificare a livello di genere o gruppi di generi batterici. Sono stati individuati 18 ceppi batterici Escherichia coli, 13 ceppi batterici gruppo KESC, 3 ceppi batterici genere Proteus.

• 85% per la BLSE Agar; 40 ceppi sono cresciuti, di cui 34 hanno presentato le caratteristiche di crescita da poterle identificare a livello di genere o gruppi di generi batterici. Sono stati individuati 29 ceppi batterici del gruppo Escherichia coli, Klebsiella e Enterobacter, 5 ceppi batterici di altri germi appartenenti alla famiglia Enterobatteriaceae e della famiglia Pseudomonadaceae.

• 43% per la CIVA Agar; 30 sono cresciuti, di cui 13 hanno presentato le caratteristiche di crescita da poterle identificare a livello di specie o genere batterica. Sono stati individuati 9 ceppi batterici della specie Escherichia coli e 4 ceppi batterici del genere Klebsiella.

La piastra che ha dato maggiore possibilità di identificare il tipo di batterio è stata la ChromIDTM ESBL Agar.

6.3.3 Possibilità di discriminare bacilli Gram negativi non Enterobatteriaceae Abbiamo pure analizzato alcuni ceppi batterici della famiglia Xanthomonadaceae, Moraxellaceae e Pseudomonadaceae [Tabella 2], per verificare la possibilità di discriminare bacilli Gram negativi non Enterobatteriaceae. Sono stati presi in esame 6 ceppi di Stenotrophomonas maltophilia, 5 ceppi di Pseudomonas aeruginosa e 6 ceppi del genere Acinetobacter della collezione dell’ICM.

Una volta inclusi i risultati di questi tre gruppi di batteri, la specificità delle piastre è diminuita, passando:

• per la ChromIDTM ESBL Agar da 69% a 38% dopo incubazione di 24 ore, da 44% a 25% dopo incubazione di 48 ore,

• per la BLSE Agar da 50% a 25% dopo incubazione di 24 ore, da 44% a 22% dopo incubazione di 48 ore,

• per la EbSA Agar da 88% a 63% dopo incubazione di 24 e 48 ore,

• per la CIVA Agar da 63% a 41% dopo incubazione di 24 e 48 ore. Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa e specie del genere Acinetobacter sono cresciuti su tutti e quattro i terreni selettivi.

La piastra ChromIDTM ESBL Agar è riuscita a differenziare i tre generi non Enterobatteriaceae. Secondo le direttive fornite dalla Biomérieux, il colore delle loro colonie risulta bianco, mentre le colonie che fanno parte della famiglia Enterobatteriaceae normalmente si colorano rosa, verde o marroncino [2].

Tuttavia sono stati descritti alcuni ceppi di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL che formano colonie bianche, in particolare alcuni ceppi di Escherichia coli che non possiedono la

27

ChromIDT M ESBL Agar BLSE Agar EbSA Agar CIVA AgarCosto (CHF) per piastra 2.40 4.03 3.00 1.00Tempo di incubazione

consigliato da ditte/pubblicazioni

18 / 24 ore 24 ore 18 / 24 ore 24 ore

Tempo di incubazione eseguito per questo studio

24 / 48 ore 24 / 48 ore 24 / 48 ore 24 / 48 ore

Specificità 47% / 42% 37% / 32% 53% / 53% 47% / 37%Sensitività 92% / 92% 100% / 100% 85% / 85% 69% / 85%

PPV 55% / 52% 52% / 50% 55% / 55% 47% / 48%NPV 90% / 89% 100% / 100% 83% / 83% 69% / 78%

β-glucuronidasi ed alcuni ceppi di Proteus mirabilis che presentano una debole crescita, associata ad una debole espressione di ESBL. La differenziazione di questi ceppi dalle non Enterobatteriaceae, anch’esse di colore bianco sulla piastra, può avvenire tramite il test dell’ossidasi [2].

6.3.4 L’influenza di AmpC e K1

Dalla letteratura [18] si conosce che oltre alle ESBL esistono altri meccanismi di resistenza come l’iperproduzione della β-lattamasi K1 in Klebsiella oxytoca e l’iperproduzione del gene AmpC per Enterobacter e Citrobacter che danno uno spettro di resistenza simile all’ESBL. Per tutte le quattro piastre la diminuita specificità è soprattutto dovuta quindi alla iperproduzione di AmpC e K1. Per i ceppi riconosciuti iperproduttori di AmpC o K1 non sono stati messi in evidenza tramite la PCR i geni (blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaCTX-M) che normalmente conferiscono il fenotipo ESBL. Se nell’analisi prendiamo in considerazione anche i ceppi iperproduttori di AmpC e K1, ceppi non considerati ESBL, la specificità e sensitività diminuisce sostanzialmente [Allegato 10].

La specificità delle piastre passa dopo incubazione di 24 ore: • per la ChromIDTM ESBL Agar da 69% a 57%, • per la BLSE Agar da 50% a 52%, • per la EbSA Agar da 88% a 75%, • per la CIVA Agar da 63% a 67%.

La sensitività delle piastre passa dopo incubazione di 24 ore: • per la ChromIDTM ESBL Agar da 94% a 93%, • per la BLSE Agar da 97% a 93%, • per la EbSA Agar da 91% a 67%, • per la CIVA Agar da 73% a 88%.

6.4 Materiale biologico

6.4.1 Interpretazione dei risultati ottenuti

I 32 materiali biologici sono stati studiati con le quattro piastre e confrontate con E-Test.

La seguente tabella rappresenta un riassunto dei risultati ottenuti con le quattro piastre:

Tabella 17 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti con le piastre per i materiali biologici

28

La sensitività di BLSE Agar è ottima, con nessun falso negativo dopo 48 ore di incubazione. Molto buona la sensitività della piastra ChromIDTM ESBL Agar. EbSA Agar e CIVA Agar risultano avere comunque una buona sensitività.

EbSA Agar è l’unica che presenta una buona specificità. Le altre tre piastre hanno dato più falsi positivi rispetto alla EbSA Agar, abbassando in modo elevato la specificità. Questo lo si è visto analizzando i ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, inseminando direttamente i materiali biologici sulle piastre di studio, ci sono stati diversi fattori che hanno favorito la crescita delle colonie, facendo diminuire la specificità.

Dalla pratica eseguita per questo studio si può affermare che i microrganismi diversi dalle Enterobatteriaceae, come per esempio le Xanthomonadaceae, Moraxellaceae e Pseudomonadaceae possono crescere sui terreni ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar. Questo causa molti falsi positivi ed influenza sensibilmente il risultato, abbassando automaticamente la specificità dei quattro terreni selettivi.

6.4.2 Feci

Per quanto riguarda la possibilità di effettuare degli screening di pazienti tramite striscio anale bisogna tenere in considerazione che tra la flora commensale normalmente presente vi siano dei ceppi batterici iperproduttori di AmpC o K1 che saranno in grando di svilupparsi sulle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar.

Sono stati esaminati 6 campioni di feci, di cui 5 sono risultati negativi e 1 positivo per ESBL con l’E-Test. Le piastre invece hanno dato il seguente risultato dopo 48 ore di incubazione:

• ChromIDTM ESBL Agar 1 vero positivo, 1 vero negativo e 4 falsi positivi

• BLSE Agar 1 vero positivo, 1 vero negativo e 4 falsi positivi

• EbSA Agar 1 vero positivo, 3 veri negativi e 2 falsi positivi

• CIVA Agar 1 vero positivo, 2 veri negativi e 3 falsi positivi

Gli isolati batterici sono identificati come Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii e Enterobacter cloacae.

La piastra che ha mostrato meno falsi positivi è la EbSA Agar.

6.4.3 Possibilità di discriminare le Enterobatteriace dalle non Enterobatteriaceae L’unica piastra che è riuscita a distinguere colonie batteriche che non appartenessero alla famiglia Enterobatteriaceae è stata la ChromIDTM ESBL Agar, tramite la presenza di colonie bianche ed eseguendo il test dell’ossidasi [2].

6.5 Confronto con altri studi

Altri studi con le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar sono stati eseguiti nel corso degli anni.

Secondo i risultati ottenuti in questo studio, la EbSA Agar ha mostrato una sensitività di 91% e una specificità di 88%, mentre la BLSE Agar una sensitività di 100% e una specificità di 44%. In uno studio simile presentato al “18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases” svoltosi a Barcellona, Spagna nel 2008, dove sono stati utilizzati 208 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, si sono ottenuti una sensitività di 100% sia per EbSA Agar che per BLSE Agar e una specificità di 85% per la EbSA Agar, mentre 57% per la BLSE Agar [28].

29

In uno studio effettuato all’Ospedale di Santa Monica (Vila Velha, ES, Brasile) nel 2008 sono state confrontate la CIVA Agar e la piastra Mac Conkey Agar con l’aggiunta di ceftazidima. Analizzando 126 campioni di feci non si sono viste sostanziali differenze tra le due piastre [5].

Per quanto riguarda la ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar sono stati effettuati più studi. Ad esempio uno studio effettuato in Francia ha confrontato le due piastre utilizzando 765 campioni di diversa natura. La ChromIDTM ESBL Agar è risultata essere migliore in sensitività (94%) ed in specificità (90%), rispetto la BLSE Agar (sensitività di 85%, specificità di 74%) [29].

In un altro studio eseguito in Belgio, la ChromIDTM ESBL Agar è stata comparata all’uso di Mac Conkey agar impregnato di antibiotico ceftazidima. Il test è stato eseguito con 173 prelievi di diversa natura, testando solo la sensitività. Ancora una volta la ChromIDTM ESBL Agar è stata la migliore (sensitività del 100%) rispetto alla Mac Conkey più ceftazidima (68%) [2].

Al laboratorio di microbiologia dell’Ospedale Universitario di Basilea hanno testato la ChromIDTM ESBL Agar e la BLSE Agar, utilizzando 88 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, testando unicamente la sensitività. La ChromIDTM ESBL Agar è stata la migliore (100%) rispetto alla BLSE Agar (93%) [30].

30

7. CONCLUSIONI

Le Enterobatteriaceae produttrici di ESBL sono attualmente riconosciute in tutto il mondo come patogeni ospedalieri di primaria importanza. La individuazione di portatori di E-ESBL è particolarmente importante per la prevenzione ed il monitoraggio epidemiologico di queste infezioni.

Per questo studio sono stati testati quattro differenti terreni selettivi, ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar, utilizzabili per l’identificazione rapida presuntiva di stipiti E-ESBL.

In conclusione i risultati di questo studio mostrano che la ChromIDTM ESBL Agar è il terreno selettivo migliore per lo screening di E-ESBL eseguendo l’individuazione direttamente dal materiale biologico. Oltre alla soddisfacente sensitività e specificità, dal punto di vista di laboratorio, questa piastra ha il vantaggio di discriminare differenti colonie e quindi ceppi batterici, guardando semplicemente il loro colore. Inoltre il prezzo sembra essere buono rispetto alle BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar.

Quindi consiglio all’Ente Ospedaliero Cantonale di introdurre la piastra ChromIDTM ESBL Agar per lo screening di batteri produttori di ESBL. Questa scelta è stata presa nel 2007 dal laboratorio centrale dell’Ospedale Cantonale di Basilea [31]. Sarebbe interessante, magari in un futuro lavoro di diploma, testare i terreni selettivi per quanto riguarda i pazienti ospedalizzati conosciuti come portatori di ESBL (striscio inguinale e anale), allo scopo di continuare ed ampliare il lavoro fin qui svolto e studiare ancora più a fondo le potenzialità e i difetti di queste piastre.

31

8. BIBLIOGRAFIA

1 http://www.tesionline.it/default/tesi.asp?idt=19168, consultato il 14 aprile 2009

2 http://www.marigoitalia.it/file/CHROMID_ESBL.pdf, consultato il 24 novembre 2008

3 http://microgenbioproducts.com/pdf/Product%20Brochures_Individual/BLSE%20Agar.pdf, consultato il 24 novembre 2008

4 http://www.alpha-omega-diagnostics.com/reagents/bacteriology/index.php, consultato il 24 novembre 2008

5 Pessôa de Menezes Silva C. H., 2000, Elaboration and evaluation of a new screening medium for detection and presumptive identification of extended-spectrum β-lactamase-producing organisms (ESBL), Brazilian Journal of Microbiology, 31:271-274

6 Kaiser F. H., Bienz K. A., Eckert J., Lindenmann J., 1993, Handbook di Microbiologia Medica 8a edizione Mediserve, 197-218

7 Praglia C., 1999, Microbiologia prima edizione, Atlanti Scientifici Giunti

8 http://www.chuv.ch/swiss-noso/i114a2.htm, consultato il 27 febbraio 2009

9 http.//www.chuv.ch/swiss-noso/vol7nu1i.pdf, consultato il 27 febbraio 2009

10 http.//www.chuv.ch/swiss-noso/vol6nu3i.pdf, consultato il 27 febbraio 2009

11 http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/Images/PathogenImages/BetaLactam.gif, consultato il 14 aprile 2009

12 Milnar D., 2008, ESBLs: Molecular Mechanisms of Penicillin Resistance. Microbial Pathogenicity, Summary Report 12.3

13 Servizio Igiene Ospedaliera EOC, 2001, Misure precauzionali per i germi multiresistenti agli antibiotici (escluso bacillo di Koch), scheda A.6

14 Gaia V., De Benedetti A., Valsangiacomo C., Poloni C., 2009, Prevalenza di Staphylococcus aureus meticilino-resistente (MRSA) negli istituti a lunga degenza in Canton Ticino: studio multicentrico 2008, Tribuna medica ticinese

15 http://www.unilabs.ch/Global/Italian/Area%20Medici/Informazioni%20scientifiche/31-MRSA_I.pdf, consultato il 14 aprile 2009

16 http://www.iss.it/binary/publ/cont/07-54.1204714542.pdf, consultato il 14 aprile 2009

17 Rossetti A., 2007-2008, Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR

18 http://194.119.197.4/~alcaro/f1/aa_04_05/tesine/carbapenemi#11, consultato il 14 aprile 2009

19 Siu L.K., 2002, Antibiotics: Action and resistance in gram-negative bacteria, J. Microbiol. Immunol., Infect. 35:1-11

20 Ferron A., 1989, Bactériologie Médicale à l’usage des étudiants en médecine 13e édition, Editions C. et R., Quatrième Partie, 397-403

21 Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, 2002, Ricerca e refertazione di laboratorio dei batteri produttori di beta-lattamasi a spettro esteso, HPA (www.hpa-standardmethods.org.uk), QSOP 51:1-15

22 Fernandez Parra F. M., 2007-2008, Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico

32

23 http://fad.italbioforma.it/P3.asp?varIdNws=3461, consultato il 14 aprile 2009

24 Jacoby G. A., 2009, AmpC β-Lactamases, American Society for Microbiology, p. 161-182

25 http://www.biolifeit.com/biolife/upload/file/Documenti/NPLWKS-AMATO.PDF, consultato il 14 aprile 2009

26 Colom K., Pérez J., Alonso R., Fernàndez-Aranguiz A., Lariño E., Cisterna R., 2003, Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM, blaSHV and blaOXA-1 genes in Enterobacteriaceae, FEMS Microbiol,. Lett. 223:147-151

27 http://www.cscq.ch/com/publi/uricult-i.pdf, consultato il 14 aprile 2009

28 http://www.blackwellpublishing.com/eccmid18/abstract.asp?id=68771, consultato il 18 maggio 2009

29 Réglier-Poupet H., Naas T., Carrer A., Cady A., Adam J.M., Fortineau N., Poyart C., Nordmann P., 2008, Perforemance of chromID ESBL, a chromogenic medium for detection of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases, Journal of Medical Micorbiology, 310-315

30 Bruderer T., Vesco R., Schneider R., Oezcan S., Frei R., 2008, Comparison of two different selective plates for screening of Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) producing Enterobacteriaceae, 67th Annual Assembly of the Swiss Society for Microbiology, P09

31 Graf S., 2008, ESBL Screening in urine, 67th Annual Assembly of the Swiss Society for Microbiology, P25

33

9. RINGRAZIAMENTI

Vorrei ringraziare coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. I miei ringraziamenti vanno al dottor Tiziano Balmelli ed Antonella Demarta per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma, per avermi seguito durante lo svolgimento dandomi consigli e per la lettura delle bozze. Ringrazio il direttore dell’Istituo Cantonale di Microbiologia, dottor Orlando Petrini per avermi permesso di svolgere il lavoro di diploma presso un istituto all’avanguardia nella ricerca e per la lettura delle bozze. Un ringraziamento particolare per la tecnica in analisi biomediche Nadia Ruggeri, del reparto Metodologie e Formazione, per avermi aiutata dall’inizio alla fine nello svolgimento soprattutto pratico del mio lavoro, per aver avuto tanta pazienza, dedicandosi al mio lavoro, per la raccolta dei campioni, aiutandomi nella stesura del lavoro e per la lettura delle bozze. Ringrazio Fabio e Daniele per l’aiuto nella preparazione del terreno di coltura e tutto il laboratorio di routine dell’ICM per la raccolta dei campioni. Ringrazio i miei responsabili Giorgio Dal Bo ed Elia Cattani del laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano per la loro collaborazione. Inoltre ringrazio il direttore Andrea Boffini della Scuola Medico Tecnica, il docente di chimica clinica Giovanni Togni ed il docente di metodologia Claudio Naiaretti per gli insegnamenti metodologici ricevuti durante tutto il periodo scolastico. Ringrazio le docenti Sonja Marci, Daniela Marcacci, come pure Nicole, Pamela e Miguel per il loro sostegno e Susan Gilbert per la parte in inglese. Ringrazio la mia famiglia e la mia amica Samuela per il supporto morale ed gli aiuti ricevuti durante tutto il periodo scolastico.

34

10. ALLEGATI

Allegato 1: Skim Milk (BBL) Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.

Materiale Skim Milk (BBL) 10.0 g Sterilizzare a 121°C per 15 minuti Calf serum (Sigma) 10.0 ml Glicerolo (Fluka) 20.0 ml Acqua demineralizzata 70.0 ml

Allegato 2: Agar Sangue (Oxoid) Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 0.3. 2007. Approvato: Dolina Marisa.

Materiale Columbia Agar Base (Oxoid) 312.0 g Acqua demineralizzata 7600.0 ml Sterilizzare a 121°C per 15 minuti Sangue di montone (Mischler) 400.0 ml

Allegato 3: Mac Conkey (Difco) Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 0.1. 2005. Approvato Dolina Marisa.

Materiale Mac Conkey (Difco) 400.0 g Acqua demineralizzata 8000.0 ml Sterilizzare a 121°C per 15 minuti

Allegato 4: Drigalski Agar (Biokar Diagnostics)

Tratto:http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf/0/ECC0A6C7FB8376DC12574B1004E37BD/$file/BK036%20Drigalski%20lactose%20Agar%20BK036%20%v.6.pdf.

Materiale Volume totale 1000.0 ml Peptone 15.0 g Estratto di carne bovina 3.0 g Estratto di lievito 3.0 g Desossicolato di sodio 1.0 g Tiosulfato di sodio 1.0 g Lattosio 15.0 g Cristalli violetto 0.005 g Blu di bromotimolo 0.08 g Agar 15.0 g

35

Allegato 5: Ossidasi (Sigma) Tratto: garanzia della qualità dei risultati. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.

Il test viene utilizzato per distinguere gli Enterobatteri da Pseudomonas.

Materiale Polvere N,N-Dimethyl-p-Phenylenediamine (Sigma) Acqua demineralizzata Carta assorbente Anse sterili

Procedimento

Diluire un’ansata di polvere N,N-Dimethyl-p-Phenylenediamine (Sigma) in circa 10 ml di acqua demineralizzata. Bagnare la carta assorbente con la soluzione diluita. Prelevare con l’ansa sterile una colonia batterica dal terreno Agar e appoggiarla sulla carta assorbente, premendo leggermente. Attendere 30 secondi.

Lettura

Positivo Comparsa di una colorazione rosa scuro entro 30 secondi, (batteri non fanno parte delle Enterobatteriaceae). Negativo La mancata comparsa della colorazione entro 30 secondi, (batteri fanno parte delle Enterobatteriaceae).

Allegato 6: E-Test (AB Biodisk) Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbioogia. Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.

È un metodo quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibente (CMI) di un singolo agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi e per la determinazione dei meccanismi di resistenza.

Materiale Piastre di agar (4-5 mm spressore mantenute a 2-8°C) Müller Hinton (MH) NaCl 0.9% sterile in tubi mantenuti a 2-8°C

Strisce E-Test di differenti antibiotici mantenute a temperatura indicata dal fabbricante (cefotaxima, cefepime, ceftazidima) Standard di torbidità McFarland 0.5 Anse sterili (platino o plastica), batuffoli sterili, pinzette, vortex, lampada Incubatore 37°C aereobiosi

Procedimento

Prendere 4-5 colonie isolate da una piastra fresca (24 ore) e inseminare in NaCl. Vortexare la sospensione, aggiustare la torbidità per ottenere il McFarland necessario.

Entro 15 minuti dal momento in cui si è ottenuto la torbidità corretta immergere un batuffolo sterile nella sospensione e in seguito ruotarlo contro la parte del tubo per eliminare l’inoculo in eccesso. Spatolare la piastra tre volte, ruotando ogni volta di circa 60 gradi. In questa maniera si ottiene una crescita batterica uniforme e confluente. Per ultimo fare un giro sul bordo dell’agar. Lasciare riposare la piastra 3-15 minuti prima di mettere le strisce impregnate di antibiotico.

Con l’aiuto di una pinzetta o dell’applicatore apposito appoggiare la striscia facendo attenzione che la scala CMI (concentrazione minima inibente) sia rivolta verso l’alto e che l’estremità della striscia senza antibiotico (segnata con E) sia il più possibile vicino al bordo della piastra. Una volta

36

appoggiata non più rimuovere la striscia. Per meglio farla aderire si può passare leggermente la punta della pinzetta dalla concentrazione più bassa a quella più alta. Piastre 140 mm massimo 6 strisce, piastre 90 mm massimo 2 strisce. Diminuire il numero se si tratta di batteri molto sensibili (Figura 12, 13, 14, 15).

Incubare le piastre entro 15 minuti dal momento in cui si sono messe le strisce. Girare le piastre e impilarle. Nel limite del possibile non mettere più di 5 piastre per pila (il calore e l’aria non passano in maniera sufficiente) e incubarle nell’atmosera più appropriata. Controllare che la coltura sia pura. Leggere il valore della CMI dove l’ellisse interseca la scala. Per gli antibiotici batteriostatici leggere la CMI all’analogo della zona fine, al cosiddetto 80% di inibizione, cioè il primo punto di inibizione significativa giudicato a occhio nudo. Per gli antibiotici battericidici leggere la CMI al punto di completa inibizione di cresicta. In caso di dubbio leggere il punto nella zona di completa inibizione della crescita incluso le zone di crescita fine e le singole colonie. - Inibitori della β-lattamasi possono estendere la loro ellisse al di sotto del valore della CMI a causa di attività intrinseca. Estrapolare la curva superiore verso la striscia. - Se l’ellisse interseca la striscia a due livelli differenti tenere in considerazione quello più alto. - Ignorare la leggera linea di crescita lungo il bordo della striscia causata dal microrganismo cresciuto in un tunnel di acqua. - Ignorare la zona di emolisi e leggere l’inibizione della crescita. Il valore della CMI può situarsi fra due diluizioni (two-fold dilution), in questo caso arrotondare alla diluizione più alta. Esempio: valori per ampicillina sono S≤1, 1=2, R≥4, se il valore letto è 1.5 µg/ml lo si arrotonda a 2 µg/ml e il risultato sarà Intermedio (I).

L’interpretazione dei valori delle CMI si basa, in linea di principio, sui criteri emessi dal CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Il risultato emesso è dato in µg/ml con l’interpretazione sensibilie, intermedio o resistente. Se questi non fossero accessibili viene dato solo il valore della CMI.

Figura 12, 13 Schema di posizionamento delle strisce

Figura 12 Piastra 140 mm – 6 strisce Figura 13 Piastra 140 mm – 5 strisce

Figura 14, 15 Schema di posizionamento delle strisce

Figura 14 Piastra 140 mm – test ESBL Figura 15 Piastra 90 mm – 2 strisce

37

Allegato 7: Phoenix Epicenter (BD) Tratto: apparecchi. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 1.0. 2009. Approvato: Bagutti Claudia.

Il sistema serve per l’identificazione rapida e la determinazione della sensibilità antimicrobica dei batteri.

Materiali Pannelli Phoenix (in base al tipo di battere) Brodo ID Phoenix Brodo AST Phoenix Indicatore AST Phoenix Tappi specifici per chiusura pannelli (forniti unitamente ai pannelli) Stazione di inoculo Phoenix Nefelometro Pipette da 25 µl e punte apposite (fornite dalla ditta) Tamponi ovattati sterili Piastra di controllo (in base al tipo di battere) Anse sterili

Procedimento

Scegliere il pannello da utilizzare e seminare la busta. Se quest’ultima risulta forata o aperta non utilizzare il pannello. Estrarre il pannello tenendolo lateralmente e porlo nell’apposita stazione di inoculo. Attenzione: reggere i pannelli solo di lato. Evitare di lasciare impronte o macchie sui pozzetti in quanto potrebbero influire sulla lettura. Con l’aiuto di un tampone sterile inoculare un brodo ID Phoenix con il germe in esame fino a raggiungere una torbidità di 0.5 (0.5-0.6) McFarland mediante nefelometro. Se si dovesse superare la torbidità desiderata segnare con il pennarello il livello esatto del liquido, diluire con NaCl sterile o con brodo ID Phoenix, miscelare e, una volta raggiunto il McFarland desiderato gettare tanto liquido quanto basta per ritornare al livello segnato. Con lo stesso tampone strisciare il primo settore della piastra di controllo e con un’ansa sterile procedere alla semina completa della piastra. Tenendo il flaconcino dell’indicatore in verticale dispensare una goccia su un batuffolo che verrà gettato (questo permette che le gocce seguenti siano tutte di uguale quantità), e senza più girare il flaconcino dispensare una goccia nella provetta contenente AST Broth (senza toccare il vetro). Chiudere la provetta AST e mescolare capovolgendo due volte (non vortexare). Il tubo AST con l’indicatore può essere tenuto al massimo due ore a temperatura ambiente alla luce, oppure otto ore a temperatura ambiente allo scuro prima di essere inoculato. Trasferire 25 µl di soluzione ID nell’AST Broth. Chiudere e mescolare capovolgendo alcune volte (non vortexare). Versare l’inoculo della provetta ID nell’accesso sinistro del pannello. Versare l’inoculo della provetta AST nell’accesso destro del pannello. Nota: i pannelli devono essere inoculati entro 30 minuti dalla preparazione dell’AST Broth. Lasciar scorrere il liquido lungo il percorso a serpentina. Chiudere con il tappino apposito precedentemente numerato con il numero corrispondente all’analisi (nell’apparecchio questo numero sarà preceduto dalla sigla del reparto e l’anno). Verificare che la chiusura a scatto del tappino sia completamente inserita. Porre il pannello nel vassoio portapannelli, registrare ed introdurre il campione nell’apparecchio Phoenix.

38

Allegato 8: MALDI-TOF MS (AXIMA) Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time Of Flight Mass Spectrometry Tratto: istruzioni operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia. Versione 1.0. 2009. Approvato: Bagutti Claudia.

Preparazione di ceppi batterici per analisi MALDI-TOF MS

Questa procedura indica le modalità per la preparazione di ceppi batterici per l’identificazione mediante la spettrometria di massa MALDI-TOF MS (apparecchio: AXIMA-Confidence Linear and Reflectron, Shimadzu; con banca dati e software SARAMIS, Anagnostec). I batteri gram negativi non pongono particolari problemi. Colture incubate per 24 ore sono idonee per un’applicazione della tecnica MALDI-TOF MS e i batteri possono essere analizzati senza necessitare di trattamenti (estrazioni) particolari. Bisogna ricordarsi sempre che: • La prima riga A di ogni lama (A1-A4) deve rimanare sempre vuota. • Su ogni lama deve essere inseminato un ceppo di Escherichia coli (sempre in posizione G3+G4)

per eseguire una calibrazione automatica dell’apparecchio. • Ogni ceppo viene analizzato in doppio.

A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 C1 C2 C3 C4 D1 D2 D3 D4 Ceppi da analizzare E1 E2 E3 E4 F1 F2 F3 F4 G1 G2 G3 G4 Escherichia coli per calibrazione H1 H2 H3 H4 I1 I2 I3 I4 J1 J2 J3 J4 Ceppi da analizzare K1 K2 K3 K4 L1 L2 L3 L4 Figura 16 Schema di trasferimento dei ceppi su una lama FlexiMass per MALDI-TOF MS

Una colonia di batteri è trasferita su una lama d’acciaio FlexiMass, mediante un ago in plastica, al centro di un pozzetto. La quantità di batteri inoculata deve essere tale da essere appena visibile a occhio nudo. Non appena i batteri sono stati depositati sulla lama, essi vengono ricoperti da 0.5 µl di matrice DHB o CHCA. La gocciolina deve essere depositata delicatamente sulla lama grazie a una micropipetta da 2 oppure 10 µl in modo che non fuoriesca dal bordo del pozzetto. Dopo una breve asciugatura di qualche minuto a temperatura ambiente, si formano dei cristalli. La qualità dei cristalli (cristalli lunghi e facilmente visibili a occhio nudo per DHB e cristalli puntiformi per alfa-cyano) è di primaria importanza per ottenere una buona identificazione del ceppo batterico. I dati relativi ad ogni ceppo analizzato vengono registrati a mano su una scheda (Foglio Analisi MALDI-TOF MS) e vengono inseriti nel software Target Manager di Anagnostec. L’analisi viene effettuata dalle persone abilitate dall’Area Biosicurezza. Il software Saramis Premium restituisce per ogni pozzetto analizzato una percentuale di identificazione e un’indicazione di colore (verde scuro se maggiore di 99.9%, verde chiaro se compreso tra 99.9 e 95%, giallo tra 95 e 80%, bianco tra 80 e 70%. Il colore rosso indica che il ceppo è stato assegnato a due o più taxa diversi.

39

blaTEM blaOXA blaSHV blaCTX-M

10/07 Escherichia coli POS05/07 Escherichia coli POS27/07 Escherichia coli POS90/07 Escherichia coli POS89/07 Escherichia coli POS94/07 Escherichia coli POS100/07 Escherichia coli POS84/07 Escherichia coli POS47/07 Escherichia coli POS12/07 Escherichia coli POS13/07 Escherichia coli POS14/07 Escherichia coli POS16/07 Escherichia coli POS22/07 Escherichia coli POS32/07 Escherichia coli POS40/07 Escherichia coli POS51/07 Escherichia coli POS88/07 Escherichia coli POS58/07 Escherichia coli POS

U34313 Escherichia coli NEGATCC 25922 Escherichia coli NEG

0S438 Escherichia coli NEG0S62 Escherichia coli NEG0S184 Escherichia coli NEG78/08 Klebsiella oxytoca POS123/08 Klebsiella oxytoca POS34/08 Klebsiella oxytoca POS55/07 Klebsiella oxytoca POS56/07 Klebsiella oxytoca POS87/07 Klebsiella pneumoniae POS04/07 Klebsiella pneumoniae POS73/07 Klebsiella pneumoniae POS

ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae POS72/06 Enterobacter sakazakii POS0S688 Enterobacter aerogenes NEG93/05 Enterobacter cloacae POS0S46 Enterobacter cloacae NEG0S128 Enterobacter cloacae NEG50/07 Bacillo Gram negativo NE POS74/07 Salmonella spp. POS0S91 Hafnia alvei NEG0S29 Serratia liquefaciens NEG0S453 Serratia marcescens NEGU31142 Proteus mirabilis NEG51/08 Proteus mirabilis POSAmp73 Proteus mirabilis NEG0S14 Citrobacter freundii NEG0S255 Citrobacter freundii NEG0S565 Citrobacter freundii NEGNEGATIVO

NEGATIVO

AmpC plasmidicoIperproduzione di AmpCIperproduzione di AmpC

NEGATIVO

NEGATIVONEGATIVONEGATIVO

ESBL POSITIVO

Iperproduzione di AmpC

Iperproduzione di AmpCNEGATIVO

Iperproduzione di K1Iperproduzione di K1Iperproduzione di K1Iperproduzione di K1

NEGATIVONEGATIVO

NEGATIVOIperproduzione di K1

CEPPO SPECIE BATTERICAGENI ESBL

E-TEST

Allegato 9: Geni ESBL, risultati ottenuti all’ICM Tabella 18 Risultati dei geni ESBL ottenuti all’ICM che concernono la collezione di ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae


blaTEM da Temoniera, gene di resistenza blaOXA da Oxacillasi, gene di resistenza blaSHV da Sulphydryl Variable, gene di resistenza blaCTX-M da Cefotoximasi, gene di resistenza AmpC plasmidico da ampicillinasi C, plasmide che ha acquisito il gene per l’enzima AmpC Iperproduzione di AmpC da ampicillinasi C, sovraespressione del gene Iperproduzione di K1 K1, sovraespressione del gene

presenza del gene di resistenza

40

Allegato 10: Influenza di AmpC e K1

Tabella 19 Influenza di AmpC e K1 che concernono i ceppi batterici

INCUBAZIONE: 24 ORE VERI POSITIVI VERI NEGATIVI FALSI POSITIVI FALSI NEGATIVI

ChromIDTM ESBL Agar AmpC 0 1 4 0

ESBL 25 0 0 2

K1 0 0 5 0

BLSE Agar AmpC 0 0 5 0

ESBL 26 0 0 2

K1 0 0 5 0

CIVA Agar AmpC 0 1 4 0

ESBL 18 0 0 9

K1 0 5 0 0

EbSA Agar AmpC 0 3 2 0

ESBL 22 0 0 3

K1 0 0 5 0

E-Test AmpC 0 5 0 0

ESBL 27 0 0 0

K1 0 0 5 0

DEFINIZIONE AmpC 0 5 0 0

ESBL 27 0 0 0

K1 0 5 0 0 Tabella 20 Riassunto della tabella 19

INCUBAZIONE: 24 ORE VERI POSITIVI VERI NEGATIVI FALSI POSITIVI FALSI NEGATIVI ChromIDTM ESBL Agar 25 12 9 2 BLSE Agar 26 11 10 2 CIVA Agar 18 12 4 9 EbSA Agar 22 14 7 3 E-Test 27 16 5 0 Tabelle 21 Specificità e sensitività influenzata da AmpC e K1

SPECIFICITÀ SENSITIVITÀ

ChromIDTM ESBL Agar 57% 93%

BLSE Agar 52% 93% EbSA Agar 75% 67% CIVA Agar 67% 88%

41

Antimicrobial Class Antimicrobial Subclass Agents Included; Generic NamesPenicillin Penicillin

AmoxicillinAmpicillinAzlocillinMezlocillinPiperacillinCarbenicillinTicarcillinCloxacillinDicloxacillinMethicililnNafcillinOxacillin

Amidino penicillin MecillinamAmoxicillin-clavulanic acidAmpicillin-sulbactamPiperacililn-tazobactamTicarcillin-clavulanic acidCefazolinCephalothinCephapirinCephradineCefamandoleCefonicidCeftarolineCefuroxime (sodium)CefoperazoneCefotaximeCeftazidimeCeftizoximeCeftriaxone

Cephalosporin IV CefepimeCefmetazoleCefotetanCefoxitin

Oxacephem MoxalactamCefaclorCefadroxilCefdinirCefditorenCefetametCefiximeCefpodoximeCefprozilCeftibutenCefuroxime (axetil)CephalexinCephradine

Carbacephem LoracarbefMonobactams Aztreonam

DoripenemErtapenemImipenemMeropenem

Penem Faropenem

Penicillins

β-lactam/b-lactamase inhibitor combinations

Cephalosporin I

Aminopenicillin

Ureidopenicillin

Carboxypenicillin

Penicillinase-stable penicillins

CarbapenemPenems

Cephalosporin II

Cephalosporin III

Cephamycin

Cephems (parenteral)

CephalosporinCephems (oral)

Allegato 11: Classificazione degli antibiotici β-lattamici [14]

Tabella 22 Classificazione degli antibiotici β-lattamici

42

Allegato 12: Fotografie piastre ChromIDTM ESBL Agar

Figura 17 1 - Ceppo 0S255 - Specie Citrobacter freundii (iperproduzione di AmpC) - Colonie bianche 2 - Ceppo 55/07 - Specie Klebsiella oxytoca - Colonie verdi 3 - Ceppo 05/07 - Specie Escherichia coli - Colonie rosa-bordeaux

BLSE Agar

Figura 18 1 - Ceppo 51/08 - Specie Proteus mirabilis - Mac Conkey Agar: colonie incolore - Drigalski Agar: colonie blu / terreno blu 2 - Ceppo 05/07 - Specie Escherichia coli - Mac Conkey Agar: colonie rosa - Drigalski Agar: colonie gialle

1 2

1 2

3

43

EbSA Agar

Figura 19 Ceppo 05/07 Specie Escherichia coli La piastra non possiede alcuna particolarità che può differenziare un particolare ceppo batterico. Le colonie, se presenti, sono di colore rosa.

CIVA Agar

Figura 20 1 - Ceppo 0S14 - Specie Citrobacter freundii (iperproduzione di AmpC) - Colonie gialle 2 - Ceppo 10/07 - Specie Escherichia coli - Colonie verdi 3 - Ceppo 05/07 - Specie Escherichia coli - Colonie incolore, terreno blu

1 2

3

CONFRONTO TRA QUATTRO TERRENI SELETTIVI PER L ... · 3.2.1 Bacilli Gram negativi 7 3.2.2 Le...

Documents

Transcript of CONFRONTO TRA QUATTRO TERRENI SELETTIVI PER L ... · 3.2.1 Bacilli Gram negativi 7 3.2.2 Le...