Univerisità degli Studi di Pisa Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-Ambientali - Anno Accademico 2011-2012

Tesi di Laurea Magistrale Biotecnologie Vegetali e Microbiche

Relatore Prof. Enrico Bonari Correlatore Dott.ssa Lucia Guidi

Tesista Elisa Corneli

Concorso Migliori Tesi di Laurea - BioEnergy 2013 Cremona 28 febbraio 2013

Biogas Miscela di gas ottenuta attraverso un processo

biochimico noto come digestione anaerobica di biomasse vegetali e animali (residui agricoli e colture dedicate) e della parte biodegradabile dei rifiuti.

Università degli Studi di Pisa 02/10/2012

Introduzione

• Il biometano può essere utilizzato al posto dei combustibili fossili; può essere impiegato come bio-carburante nel settore dei trasporti e per produrre energia e/o calore.

Produzione di biogas → processo biotecnologico per la valorizzazione energetica delle biomasse

Bonari et al., 2009; Weiland, 2010, Piccinini e Fabbri, 2011

Digestione anaerobica

IDROLISI

Batteri anaerobi obbligati e facoltativi

→ idrolisi dei carboidrati, proteine e lipidi

ACIDOGENESI

Batteri anaerobi obbligati e facoltativi

→ biosintesi degli acidi organici

ACETOGENESI Batteri acetogenici

→ biosintesi dell’acido acetico, H2 e CO2

METANOGENESI Archea metanigeni

→ metano

Università degli Studi di Pisa 02/10/2012 Deublein et al., 2008; Weiland, 2010

Introduzione

Archea metanigeni e metanogenesi

• Dominio: Archaea • Phylum: Euryarcheota • Ordini: Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales e Methanopyrales.

Università degli Studi di Pisa 02/10/2012 Deublein et al., 2008; Nettmann et al., 2010; Lim et al., 2011

ACETOCLASTICI

• CH3COOH → CO2 e CH4

IDROGENOTROFI

• H2 e CO2→ CH4

70% 30%

Introduzione

Digestato

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• Residuo del processo di DA: miscela di sostanza organica parzialmente degradata, biomassa microbica e composti inorganici (10-98% di H2O).

Alburquerque et al., 2012; Möller et al., 2012

Impiego in campo come fertilizzante/ammendante: – Tal quale; – Separazione solido-liquida; – Strippaggio dell’azoto.

Vantaggi: – Non dover smaltire il refluo; – Risparmio economico per la riduzione dell’uso dei fertilizzanti

azotati.

Introduzione

Obiettivo del lavoro

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Studio della produzione di biogas attraverso la digestione anaerobica di una coltura erbacea

alternativa, la canna comune (Arundo donax L.)

Obiettivo

Sperimentazione della canna comune in campo:

• Effetto dell’epoca di taglio sulle rese.

Produzione di biogas della canna comune a confronto col mais:

• Potenziale metanigeno;

• Caratterizzazione chimica del digestato;

• Caratterizzazione molecolare della comunità degli archea metanigeni nel digestato.

Canna comune (Arundo donax L.)

PUNTI DI FORZA

• Produttività costante ed elevata

• Grande adattabilità (tipo di terreno, condizioni udometriche)

• Ridotte esigenze nutrizionali

• Elevata resistenza a crittogame e insetti, competitiva contro piante infestanti

• Specie poliennale

• Coltura non alimetare (no-food)

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• Pianta erbacea rizomatosa perenne: - Classe: monocotiledoni (Liliopsida) - Ordine: Poales - Famiglia: Graminaceae (Poaceae) - Tribù: Arundineae - Genere: Arundo

→ Coltura erbacea alternativa per la produzione di biogas.

Bonari et al., 2004; Ceotto, 2006; Nassi o Di Nasso, 2008

Materiali e Metodi

Sperimentazione della canna comune in campo

• Cinque epoche di raccolta durante la stagione vegetativa 2011, da metà giugno a fine settembre, anche in ipotesi di un insilamento a livello aziendale: – A1 (I taglio): raccolta il 20/06; – A2 (II taglio): raccolta il 15/07; – A3 (III taglio): raccolta il 02/08; – A4 (IV taglio): raccolta il 22/08; – A5 (V taglio): raccolta il 20/09.

• Impianto della coltura (2 piante m-2) messo a punto nel 2006 presso il CRIBE (Centro “E.Avanzi”, San Piero a Grado, PI) con lo scopo di valutare la produttività potenziale della canna comune. Parcelle di 50 m2 x 3 repliche.

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Materiali e Metodi

Effetto dell’epoca di taglio sulle rese areiche in s.s.

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Effetto significativo dell’epoca di taglio sulle produzioni quantitative della canna comune.

Con l’avanzare dell’età della coltura la resa è aumentata.

Min: A1 = 23 tss ha-1 Max: A5 = 38 tss ha-1

Risultati

69% 62% 62%

53% 49%

% di H20

Digestione anaerobica della biomassa

– Biomassa di canna comune x epoca di raccolta (n=3)

– Mais insilato (n=3)

– Inoculo tal quale (n=3)

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T = 38-40 °C; Tempo di ritenzione idraulica = 40 giorni. Produzione del biogas: trasduttore di pressione → invio segnale ogni tre minuti a centralina Programmable Logic Controller (PLC). Composizione del biogas: mini-gascromatografo.

Inoculo + Biomassa

VSinoc = 2·VSsub

Sistema statico in bacth (2L)

Materiali e Metodi

Potenziale metanigeno Risultati

MYP Min: A5 258 ml gVS-1 Max: A3 374 ml gVS-1

Rmax Min: A5 20 mlCH4 gVS-1 giorno-1 Max: M 45 mlCH4 gVS-1 giorno-1

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Rese metanigene ed energetiche ad ettaro

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Risultati

Arundo = 10% > M A5 = 27% > M

Caratterizzazione chimica del digestato

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Effetto significativo del fattore substrato sul Ktot e il carbonio organico totale (TOC) dei digestati.

Risultati

Caratterizzazione molecolare della comunità degli archea metanigeni nel digestato

• Primers ed enzimi di restrizione selezionati per caratterizzare la comunità attraverso clonaggio e sequenziamento del frammento del gene 16S rRNA (829 bp):

Arch16S-Forw2 5’-YGAYTAAGCCATGCRAGT-3’ Univ16S-Rev5 5’-TGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’

• HhaI = Hin6I → sito di taglio: G CG▼C C▲GC G • HaeIII = BsurI → sito di taglio: GG▼CC CC▲GG

Risultati

Nettmann et al., 2008

Entropia del frammento 16S rRNA analizzato

• Estrazione DNA genomico; • Amplificazione e clonaggio del frammento genico 16S

rRNA; • Sequenziamento 192 cloni positivi selezionati in base

alle abbondanze relative dei profili di restrizione ottenuti da gel;

• Digestione in silico (8 profili RFLP) e analisi filogenetica (6 clade) delle sequenze ottenute da sequenziamento;

Identificazione degli archea metanigeni (albero filogenetico Neighbour-Joining): – Genere Methanosarcina - ordine Methanosarcinales – Genere Methanoculleus - ordine Methanomicrobiales – Genere Methanobrevibacter - ordine Methanobacteriales – Genere Methanobacterium - ordine Methanobacteriales

Identificazione di archea metanigeni nei diversi digestati

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Risultati

Clade 4_RFLP2

Ricchezza dei clade nei digestati e abbondanze relative

dei singoli clade

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• Metanosarcina (clade 1): presenza ubiquitaria in tutti i digestati.

• Methanoculleus thermophilicus, Methanoculleus bourgense (clade 2 e 4): presenza specifica in Arundo.

• Methanoculleus spp, Methanobrevibacter thaueri e Methanobacterium subterraneum (clade 3, 5 e 6): presenza specifica nel mais.

Risultati R

icch

ezza

dei

cla

de

(n)

Struttura delle comunità di archea metanigeni nei diversi digestati

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• M comunità diversa dalla canna comune;

• A1 comunità diversa dagli altri tagli;

• A2, A3, A4, A5 comunità non distinguibili tra loro.

• Abbondanze relative del clade 3, 5, 6 correlate tra loro e caratteristiche del M;

• Abbondanze relative del clade 2 e 4 correlate tra loro e caratteristiche di A1.

Risultati

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Quale è la relazione tra le comunità di archea metanigeni ed i parametri che descrivono la produzione di metano?

Risultati

Specie più efficienti per la produzione di metano:

• Clade 1 → Metanosarcina ubiquitario in ogni digestato

Specie più efficienti per la velocità massima di produzione di metano:

• Clade 3, 5, 6 → Methanoculleus spp, Methanobrevibacter thaueri e Methanobacterium subterraneum specifici nel mais

Analisi digestato:

-Valori di azoto e fosforo confrontabili con quelli del mais; valori di potassio e carbonio organico inferiori rispetto al mais.

-Sviluppo di specie di archea metanigeni ubiquitari (Methanosarcina) legati al potenziale metanigeno (MYP).

-Selezione di archea metanigeni specifici della canna comune (Methanoculleus thermophilicus, Methanoculleus bourgense).

-Selezione di archea metanigeni specifici del mais (Methanoculleus spp. Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium subterraneum) legati alla velocità massima di produzione del metano (Rmax).

Conclusioni

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Produzione di biogas:

-Efficienza della canna comune simile al mais, sia considerando il potenziale metanigeno che la resa metanigena ad ettaro.

Conclusioni

Ringraziamenti

Prof. Enrico Bonari

Dott.ssa Lucia Guidi

Dott. Giorgio Ragaglini

Dott.ssa Elisa Pellegrino

Dott. Cristiano Tozzini

Prof. Michael Klocke

Contatti Elisa Corneli - PhD student

LandLab - Istitute of Life Sciences - Scuola Superiore Sant'Anna Via S. Cecilia 3 56127 Pisa Italy Tel +39 050 883181 Fax: +39 050 883526 Email: e.corneli@sssup.it elisacorneli@hotmail.it