Concetti basilari per lo studio del binding recettoriale

Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando

radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il

complesso RD secondo l’equazione

Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo:

I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti.

R + D RD

Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.

Ligando radiomarcato D

Recettore libero R

Recettore RDEquilibrio

Incubazione

Radioligando Tessuto

Tampone di incubazione

Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria

un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità

di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al

tessuto (Free).

Equilibrio Separazione

Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione

Filtrazione

Il metodo più semplice e classico è quello della

filtrazione su membrane in fibra di vetro

Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 m-2.7 m

Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando

aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa

attraverso la membrana.

Limiti e precauzioni della filtrazione

Le proteine ostruiscono il filtro

Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro.

Elevata velocità di filtrazione (deve essere completata in 4-5

secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal

recettore. In genere si perde il 5% di RD)

Centrifugazione

Limiti e precauzioni della centrifugazione

Una certa quantità di ligando radiomarcato (Free) potrebbe

restare intrappolato nel pellet.

Numero limitato degli alloggi nel rotore

Dialisi

Viene impiegata quando il recettore ha bassa affinità per il ligando

radiomarcato (micromolare).

Una piccola membrana simile alla cellulosa da dialisi separa

due camere

R LL L

LL

L

L

R

R

La membrana è scelta in modo tale che il ligando possa

passare mentre il recettore viene trattenuto.

Il ligando diffonde fino a raggiungere l’equilibrio.

Nella camera azzurra [L] sarà Ligando libero

Nella camera gialla [L]= ligando libero +ligando legato

La differenza fra questi valori è la concentrazione di ligando

legato.

Quella che viene misurata è la deplezione di ligando libero

Cromatografia per esclusione

Viene impiegata quando il recettore ha elevata affinità per il

ligando radiomarcato (picomolare).

Studi di binding

Analisi di saturazione

Analisi cinetica

Analisi di competizione

• Analisi di Scatchard• Analisi di Hill

• Cinetica di associazione • Cinetica di dissociazione

Analisi di saturazione

Recettore + Ligando Recettore-LigandoKon

Koff

Il binding avviene quando ligando e recettore collidono mediante

diffusione e quando la collisione ha un corretto orientamento e

sufficiente energia. La velocità di associazione è data dal

numero di eventi di binding per unità di tempo

Von = [Ligando] × [Recettore] × kon

numero di eventi per unità di tempo

Una volta avvenuto il binding, ligando e recettore restano legati

per un certo periodo di tempo.

La velocità di dissociazione del complesso è data dal

Voff = [ligando-recettore] × koff

Dopo la dissociazione il ligando e il recettore non devono aver

subito modifiche.

All’equilibrio avremo: Von = Voff

Riarrangiando l’equazione avremo:

Per meglio comprendere il significato della Kd poniamo

[Ligando] = Kd

L’equazione pertanto diviene:

[Recettore]

[Ligando-Recettore] = 1

da cui si evince che:

[Ligando] × [Recettore] × kon = [Ligando-Recettore] × koff

[Ligando] [Recettore]

[Ligando-Recettore] =

Koff

= KdKon

[Recettore] = [Ligando- Recettore]

Quando [Ligando] = Kd la quantità di recettore libero è

esattamente uguale alla quantità di recettore occupato.

I recettori totali sono la somma di quelli liberi più quelli legati al

ligando, e quando [Ligando] = Kd avremo che metà della

popolazione recettoriale sarà occupata all’equilibrio.

Se il ligando ha elevata affinità per il recettore, la Kd sarà

piccola perché basterà una piccola concentrazione di ligando per

legare la metà dei recettori.

Non bisogna confondere la Kd (costante di dissociazione

all’equilibrio) con Koff (costante di dissociazione). Non sono la

stessa cosa ed hanno dimensioni differenti.

Kon = costante di associazione (molare-1 min-1)

Koff = costante di dissociazione (min-1)

Kd = costante di dissociazione all’equilibrio (molare)

La legge di azione di massa permette di definire la frazione di

recettore occupata all’equilibrio in funzione della concentrazione di

ligando.

Frazione recettoriale occupata [RL]

[Rtot]=

[RL]

[R] + [RL]

Questa equazione non è utile perché non conosciamo la

concentrazione di recettore libero.

Poiché

[R] = [Rtot] - [RL]

e sapendo che:

[RL]

[R] [L]Kd =

[RL] =Kd

=([Rtot] - [RL]) [L][R] [L]

Kd

[RL] Kd + [RL] [L] = [Rtot] [L]

[Rtot] [L][RL] =

Kd + [L]

[RL] (Kd + [L] ) = [Rtot] [L]

[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]

da cui la frazione recettoriale occupata [RL]/ [Rtot] sarà:

[RL]

[Rtot]

[Ligando]

Ligando + Kd

=

[Ligando] Frazione recettoriale occupata

0 0%

1Kd 50%

4Kd 80%

9Kd 90%

99Kd 99%

La legge di azione di massa è un modello semplice che può

essere usato per spiegare alcuni dati sperimentali e non è utile in

tutte le situazioni.

Il modello assume che:

Tutti i recettori sono ugualmente accessibili al ligando

Il binding non deve alterare il ligando o il recettore

Il binding deve essere reversibile

I recettori sono liberi o legati con il ligando. Non devono esserci

differenti stati di affinità recettoriale o di binding parziale

Informazioni provenienti dall’analisi di saturazione

KD

Indica la concentrazione di radioligando che all’equilibrio

occupa il 50% dei recettori presenti nel preparato

biologico

Bmax

Indica la densità recettoriale nel tessuto studiato. Si

esprime in moli/mg di proteina.

Approccio sperimentale all’analisi di saturazione

L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il

Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti

concentrazioni di ligando radiomarcato.

Binding Totale

Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di

radioligando

Binding Non-Specifico

Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai siti specifici di legame

Esempio: Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio

per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM

Provetta 1 (Binding totale)

Tessuto + Rx (0.5 nM)

Lettura radioattività =2500 cpm

Provetta 2 (Binding non specifico)

Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 M)

Lettura radioattività= 500 cpm

Alla concentrazione 0.5 nM di RX il complesso RD (Binding

Specifico, Bound) sarà : 2500-500= 2000 cpm.

Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di RX che si è legato

a siti non specifici di legame.

Infatti l’impiego del ligando non marcato ad levata

concentrazione spiazza RX solo da tutti i siti specifici ma non

da quelli non specifici.

Realizzando differenti concentrazioni di RX e definendo per

ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si

calcola il Binding Specifico.

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.00

0.05

0.10

0.15Binding totale

Binding specificoBinding non specifico

[3H]spiroperidolo, (nM)

Bo

un

d(p

mo

l/mg

pro

tein

)

Visualizzando solo la

curva del binding

specifico possiamo

individuare la Kd e la Bmax

Le tre curve corrispondenti

sono riportate in figura

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.000

0.025

0.050

0.075

0.100

Bmax

Kd

[3H]spiroperidolo, (nM)

Bou

nd(p

mol

/mg

prot

ein)

Come trasformare i cpm in concentrazione

Esempio:Un campione dal volume totale di un 1 mL fornisce

5000 cpm per un Rx di attività specifica 27 Ci/mmole

cpm

dpm

= efficienza (%)

Conoscendo l’efficienza strumentale (es 55%) 5000 cpm

corrispondono a 9090 dpm

Sapendo che 2.22 x 106 dpm corrispondono a 1 Ci

Avremo che 9090 dpm corrispondono a 4.1 x 10-3 Ci

Il campione in esame ha un volume totale di 1 mL

La concentrazione sarà: 1.52x10-10 M (0.152 nM).

Dall’attività specifica del radioligando sappiamo che 27 Ci

corrispondono ad 1 mmole. Cioè 27 x 106 Ci ad 1 mmole

Avremo che 4.1 x 10-3 Ci corrispondono a 1.52 x10-10 mmoli

Analisi di Scatchard

Partendo dall’equazione:[Rtot] [L]

[RL] =Kd + [L]

[RL] ([L] + Kd ) = [L] [Rtot]

[RL] [L] + [RL] Kd = [L] [Rtot]

dividendo tutto per [L] Kd avremo:

[RL] [L]

[L] Kd [L] Kd [L] Kd=+

[RL]Kd [Rtot] [L]

quindi:[RL]

[L]=

[Rtot]

Kd

-[RL]

Kd

Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL];

con Bmax la quantità massima di ligando legato [Rtot];

con F la quantità di ligando libero [L]

avremo:B

F=

_ +B

Kd

Bmax

Kd

Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato e

ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B)

avremo:

Si ottiene una retta con

Slope = -1

Kd

L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di ricavare Bmax che rappresenta la densità recettoriale.

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.1500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Bound

B/F

Bmax

Se è presente un solo tipo di recettore lo Scatchard sarà lineare.Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale concentrazione ma con differenze in Kd per il radioligando avremo:

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.1500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Bound

B/F

[radioligando]

Bin

ding

spe

cific

o

A B

Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro

mentre in nero la curva somma del binding totale.

Nel grafico di Scatchard (B) la linea nera del binding totale

(inteso come somma del binding specifico delle popolazioni

recettoriali esistenti) evidenzia una curvatura e le due linee

tratteggiate rappresentano il binding specifico di ciascun

recettore.

Dall’analisi di Scatchard si può determinare l’omogeneità di

una popolazione recettoriale (sempre che vi siano differenze

evidenti tra i valori di Kd del radioligando per ciascun recettore).

In caso contrario avremo un’informazione apparente (di un’unica

popolazione recettoriale).

La soluzione del problema è realizzata ovviamente da radioligandi selettivi per ciascun tipo di recettore presente.

Analisi di Hill

Considerando l’equazione: [Rtot] [L]

[RL] =Kd + [L]

[RL] [L] + [RL] Kd = [Rtot] [L]

che può essere scritta:

[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]

[RL] =[L] ([Rtot] - [RL])

Kd

da cui: [RL]

[Rtot] - [RL]=

[L]

Kd

se il ligando L interagisce con n siti secondo l’equazione

nL + R RLn

[RL]

[Rtot] - [RL]=

[L]n

Kd

B

Bmax - B=

[L]n

Kd

avremo:

passando ai logaritmi:

dove n è il coefficiente di Hill (nH)

= n log [L] - log Kd

B

Bmax - Blog

log [L]

log B

Bmax - B

0

Se esiste un solo sito di interazione per recettore (n =1)

si ha una retta con pendenza = 1

Per calcolare la Kd bisogna porre

log B

Bmax - B= 0

pendenza = nH

Analisi cinetica

La quantità di binding aumenta nel tempo fino ad un valore

massimo (Ymax). Questo non corrisponde alla Bmax. Infatti Ymax è la

quantità di binding specifico all’equilibrio per una certa quantità di

ligando usato nell’esperimento di associazione. Bmax è la quantità

massima di binding estrapolata a concentrazioni molto alte di

ligando.

L’esperimento cinetico di associazione viene effettuato per

determinare la costante di velocità di associazione Kon e lo stato

stazionario.

Binding di associazione

La costante di velocità di dissociazione Koff (min-1).

La velocità con la quale incrementa il binding è dato da tre fattori

(oltre alle condizioni sperimentali come pH, temperatura):

La costante di velocità di associazione Kon (min-1 M-1).

La concentrazione del radioligando.

La concentrazione di recettore

libero ad ogni tempo di

misurazione corrisponde alla

Ymax meno il binding specifico

misurato allo stesso tempo.

Ymax

0 10 20 300

2500

5000

7500

Ymax

tempo (ore)

cpm

Effetto della concentrazione di Rx sul raggiungimento dello stato stazionario

Binding di dissociazione

tempo

Bin

din

g s

pec

ific

oBinding non specifico

Si porta sistema recettore-radioligando all’equilibrio e poi si

aggiunge il ligando freddo misurando il binding a diversi

intervalli di tempo.

Analisi di competizione

Il binding di competizione viene effettuato per determinare l’affinità

di un ligando per un dato recettore.

Viene utilizzata una concentrazione fissa di RX e di proteine

recettoriali.

Il sistema viene portato all’equilibrio in presenza di

concentrazioni differenti di ligando e quindi viene separato il

legato (Bound) da tutto il resto.

Binding totale

Il binding totale viene determinato in presenza del radioligando (in

questo caso [3H]-8-OH-DPAT) e del solo tessuto.

Binding non specifico

Viene determinato in presenza di 8-OH-DPAT ad elevate

concentrazioni (10 M) in modo che esso spiazzi dai siti

recettoriali specifici tutto [3H]-8-OH-DPAT.

La radioattività residua è data dal legame non specifico del

radioligando con proteine non recettoriali.

Binding specifico

Viene ottenuto per differenza tra il binding totale e quello non

specifico

Calcolo del valore di IC50

Concentrazione [3H]-8-OH-DPAT 0.81 nM

Binding totale 9200 cpm

Binding non specifico 920 cpm

Binding specifico 8280 cpm

[ ] 8-OH-DPAT

cpm

RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento

percentuale

1 x 10-10 8700 9200-8700 500/8280 6 %

1 x 10-9 7500 9200-7500 1700/8280 21 %

1 x 10-8 2500 9200-2500 6700/8280 81 %

1 x 10-7 1800 9200-1800 7400/8280 89 %

1 x10-6 920 9200-920 8280/8280 100 %

Curva di spiazzamento del composto 8-OH-DPAT

Alla concentrazione 1x 10-6 viene definito il binding non specifico (920

cpm) che sottratto al binding totale (9200 cpm) fornisce il binding

specifico (8280 cpm). A questa concentrazione tutto il radioligando è

stato spiazzato dai siti recettoriali specifici (100 %).

Composto 1

cpm

RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento

percentuale

9000 9200-9000 200/8280 2 %

8100 9200-8100 1100/8280 13 %

6500 9200-6500 2700/8280 33 %

2800 9200-2800 6400/8280 77 %

[ ]

1 x 10-10

1 x 10-9

1 x 10-8

1 x 10-7

1 x10-6 1720 9200-1720 7480/8280 90 %

Curva di spiazzamento del composto 1

Le curve di spiazzamento da cui ricavare il valore di IC50, si

ottengono riportando in grafico le percentuali di spiazzamento in

funzione del log della dose

10 -11 10 -10 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5

0

50

100

8-OH-DPAT IC50 = 3.02 nM Composto 1 IC50 = 20.6 nM

Log dose

% s

pia

zzam

ento

Il valore di IC50 indica la concentrazione di ligando in grado di

spiazzare il 50 % di radioligando dai siti recettoriali

all’equilibrio

E’ preferibile esprimere il valore di affinità come Ki in quanto si

eliminano le variabili

- concentrazione del radioligando utilizzato nel saggio di binding

- natura del radioligando impiegato

Equazione di Cheng-Prusoff

Ki =IC50

1 + [RX]

Kd