Le lipoproteine:Ruolo delle HDL e di ABCA1

(ATP-binding cassette transporter A1)nel trasporto inverso del colesterolo

(RCT)

Le lipoproteineAssociazione dei lipidi del plasma (colesterolo, trigliceridi e fosfolipidi) con apolipoproteine

Funzione principale: trasporto dei lipidi e delle sostanze idrofobiche nel sangue ai vari tessuti e organi.

Struttura globulare, differiscono per densità, composizione lipidica e porzione apolipoproteica.

Sintetizzate principalmente nel fegato e nell’intestino

Classificazione delle lipoproteine

CM VLDL IDL LDL HDL

CM = chilomicroni, tra le lipoproteine hanno < densità e > diametro. Raccolgono i TG e il colesterolo a livello dell’intestino tenue. Sono presenti pressochè solo dopo i pasti .VLDL = (very low density lipoproteins) raccolgono TG e CE a livello del fegatoIDL = (intermediate density lipoproteins) ciò che resta delle VLDL dopo che hanno dato TG al tessuto adiposo e muscolareLDL = (low density lipoproteins) ciò che resta delle IDL, definite colesterolo “cattivo”HDL = (high density lipoproteins) definite colesterolo “buono”Apo = apolipoproteina TG=triglyceride CE= cholesteryl ester

Maggiore proteina

ApoBApoA-I (70%)ApoA-II (20%)ApoA-IV, ApoC,ApoD, ApoE (10%)

ApoB100ApoC-III ApoE

Maggior lipide

TG TG CE CE CE

Mediante ultracentrifugazione sono separate in base alla loro diversa densità:

Principali siti di formazione delle HDL

Il destino dei lipidi nel plasma

Via Esogenariguarda il metabolismo dei lipidi introdotti conla dieta, è legata all’azione dei CM

Via Endogenaha inizio con la secrezione di VLDL da parte del fegato

Contribuiscono ai livelli lipidici circolanti

Via del Trasporto inverso del colesterolo (RCT)catalizza il ritorno del colesterolo al fegato dove viene secreto sotto forma di sali biliari. Il ruolo centrale di questo processo è svolto dalle HDL

Proprietà delle HDL nel plasma umano

Numerosi studi epidemiologici hanno mostrato che la concentrazione di HDL-C è inversamente correlata al rischio delle malattie cardiovascolari (CVD) (Gotto & Brinton 2004; Barter P. et al 2007; Tall A.R. 2008)

Fattori associati con il metabolismo delle HDL sono cardioprotettivi

Le HDL prevengono CVD principalmente rimuovendo il colesterolo dalle cellule dei tessuti periferici e trasportandolo al fegato

CVD sono una delle principali cause di morte nei paesi Occidentali

Caratteristiche delle due sottoclassi di HDL2 e HDL3 umane

Eterogeneità delle HDL nel plasma umanoUltracentrifugazione: due subfrazioni, HDL2 e HDL3

Corsa elettroforetica su gel di Poliacrilamide non denaturante: cinque sottopopolazioni differenti:HDL 2b, HDL2a, HDL3a, HDL3b, HDL3c

Eterogeneità delle HDL nel plasma umano

a: microscopio elettronico: particelle discoidali e sfericheElettroforesi su gel d’agarosio: particelle con migrazione α, la più rappresentata nel plasma ( forma matura di HDL) , particelle con migrazione pre-β ( forma immatura di HDL)b: composizione apolipoproteica: particelle che contengono apo A-Ie altre che contengono apo A-I e apo A-II;

a b

Metabolismo delle HDLConsiste in formazione, arricchimento,

deplezione, scambio di lipidi e apoproteine

Apo A-I : necessaria per la biosintesi e il metabolismo delle HDL

ABCA1 LCAT : Lecitin cholesterol Acyltransferase, genera colesterolo estere

SR-B1: recettore “scavenger”di classe B e tipo 1

CETP: cholesterol ester transfer protein

PLTP: Phospholipid transfer protein

LPL : lipasilipoproteica

HL: lipasi epatica

EL : lipasi endoteliale

Cubulina

Apo A-I Povera di lipidi

Membrana cellulare

PL

ABCA1

Apo A-I HDL discoidalepre β-migranti

(forma immatura )

FC

FC trasferito dalla membrana cellulare

LCATCE

ApoAI-HDLSferica α-migranti(forma matura)

Formazione di particelle mature α-HDLStep 1. Step 2.

1. Formazione di apoA-I povere di lipidi e genesi di preβ-migranti, promuovono l’efflusso di FC (free cholesterol) attraverso ABCA1

2. Interazione delle preβ-migranti con LCAT e formazione delle α-migranti

CE

Importanza della formazione delle particelle pre-ββββ migranti (step 1)

Frazione di HDL3 + chimasi umana Efflusso dicolesterolo

HDL3 contengono particelle α-migranti e β-migranti (6%)

0%Nell’intima vasale quando si ha una secrezione di chimasi ad opera di must-cellule attivate, il colesterolo non viene rimosso: conseguente formazione di “foam-cells” e alto rischio di aterosclerosi ( Favari E, et al., 2004)

CE

HDL sferiche α-migranti

LCAT CE

Prodotto di fusione instabile

ApoAI poveradi lipidi

Stabile

CE

CE

Step 3.

CE

Step 4.

apoAI-HDL discoidale

FegatoapoAII-HDL discoidale

LCAT CE

apoAI-HDL sferica CE

apoAI/AII-HDL sferica

3. Rimodellamento delle HDL ad opera di LCAT

4. Meccanismo di incorporazione dell’apoA-II nelle apoA-I HDL

Formazione di particelle mature α-HDL

PLTP

Trasporto inverso del colesterolo (RCT)Componente delle membrane eucariotiche, precursore degli acidi biliari e degli ormoni steroidei

Quasi tutte le cellule animali lo sintetizzano a partire dall’acetil-CoA, ma solo gli epatociti e le cellule steroidogeniche riescono a catabolizzarlo in sali biliari e ormoni steroidei

Le cellule lo acquisiscono anche dalle lipoproteine circolanti

Se in eccesso all’interno delle cellule diviene citotossico

L’RCT è il meccanismo che serve per rimuovere l’eccesso dai tessuti periferici

I principali componenti che prendono parte al RCT sono le HDL , ABCA1 e apo A-I

Famiglia degli ABC-trasportatori

Ampia famiglia i cui membri sono tutti proteine integrali di membrana che utilizzano ATP come fonte di energia per trasportare metaboliti attraverso le membrane.

Sono raggruppati in sette sottoclassi : ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, ABCG. Nell’uomo sono stati individuati 49 ABC-trasportatori, 13 fanno parte della sottoclasse ABCA.

Strutturalmente vengono suddivisi in due gruppi: 1) Trasportatori “interi” hanno due unità strutturali simili legate covalentemente2) Gli “emi”-trasportatori una singola unità strutturale.

ABCA1

Trasportatore meglio caratterizzato, espresso in modo ubiquitario, soprattutto nel fegato, intestino, polmoni, tessuti fetali. Si trova nella membrana cellulare, dei lisosomi e dell’apparato di Golgi.

Mutazioni nel gene causa Malattia di Tangier (Fredrickson, 1960)malattia rara ereditaria autosomiale caratterizzata da bassi livelli di HDL e di ApoAI, accumulo di esteri di colesterolo nei macrofagi con conseguente sviluppo di aterosclerosi precoce.(Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al.,1999; Rust et al.,1999)

Media l’efflusso di colesterolo e fosfolipidi in maniera unidirezionale verso specifici accettori extracellulari poveri di lipidi. L’accettore preferenziale è Apo A-I, ma possono fungere da accettori anche Apo A-II, Apo E, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo A-IV.

ABCA1

NBD1

NBD2

TMD1 TMD2

Walker C

Walker B

Walker A

Sav1866 (ABCA1-like) isolato da Staphylococcus aureus

(Dawson RJP, Locher KP, 2006)

Interazione tra le eliche delle due subunità e formazione di una cavità circolare, rappresenta il canale per il passaggio dei substrati

Idrolisi ATP permette alla proteina di adottare una conformazione in grado di legare il substrato dal lato citoplasmatico

TMDs: domini transmembranaICLs: loops intracellulariECLs: loops extracellulariNBDs: domini di legame dei nucleotidi 1,2,3,4,5,6: le α-eliche

Modelli per la secrezione di lipidi ABCA1- mediata

Esocitosi Retroendocitosi

colesterolo in eccesso impaccato in vescicoleche traslocano verso porzioni di membrana contenenti ABCA1

Interazione ABCA1 e apolipoproteinesi formano vescicoleendocitosi verso depositi di EC e PLesocitosi e rilascio di substrati all’esterno della cellula

Ciclo di trasporto di ABCA1

(Denis M, et al., 2004)

1. Le molecole di ABCA1 formano unità tetrameriche

4. Apo AI interagisce con la forma tetramerica mediante α-eliche anfipatiche che consistono di sequenze di 11 o 22 amminoacidi ripetuti

2. Lega i substrati lipidici e cambia conformazione

5-6. L’ATP è idrolizzatoe viene rilasciato Apo AIlipidato

3. ABCA1 scambia ADP con ATP

Regolazione di ABCA1

Ruolo importante nel metabolismo lipoproteico e nell’aterogenesi

SRB1: sterol regulatory element binding protein-1SCD: stearoyl-CoA desaturases

Effetto degli acidi grassi insaturi su ABCA1Acidi grassi insaturi riducono i livelli di mRNA e di proteina di ABCA1 in modo LXR-dipendente (studi in vivoe in vitro)

(Jiyoung Lee et al. Journal of Nutritional Biochemistry 2011)

PPARγγγγ attiva la trascrizione genica di ABCA1, LXR α e LXRβ nell HepG2

T0901317 agonista di LXRGW1929 agonista di PPARγ; GW9662 antagonista di PPARγ

I ligandi di PPARγγγγ regolano l’espressione di ABCA1 in modo PPARγγγγ-dipendente

PPARγγγγ riduce i livelli di proteina di ABCA1 e LXR β nelle HepG2

Analisi mediante western blot di ABCA1 e LXRβ

Aumento di ABCA1 dopo 24h di trattamento con T0901317 in accordo con i valori di mRNA

Diminuzione di ABCA1 e di LXRβ con GW1929discrepanza implica una regolazione post-trascrizionale sotto il controllo di PPARγ

GW1929 attiva la via MEK1/2-ERK1/2 (W.C.Huang et al., 2002)ERK1/2 è un regolatore negativo della stabilità della proteina ABCA1 nei macrofagi

PPARγγγγ media la regolazione post-trascrizionale di ABCA1 ma non dipende dalla via MEK1/2-ERK1/2

Western blot del contenutodella proteina LXRβ citoplasmatica (Cyto.) e nucleare ( Nuc.)

Agonisti di PPARγ destabilizzano il legame LXRβ-ABCA1attiva l’espressione genica in maniera LXR-dipendente

Inibendo MEK1/2-ERK1/2 si influenza lo stato fosforilativo e si abolisce la dissociazione del complesso Denis A. Mogilenko et al.,

Biochemical and Biophysical Research 2010

Overespressione di ABCA1

nel fegato

Aumento di HDL,suggerendo una significativa quantità di HDL si forma sulla superficie degli epatociti

Topi con inattivazione selettiva di ABCA1 nei macrofagi

Livelli normali di HDL-C

Sviluppo di topi Abca1-knockout fegato-specificiAbca1(-L/-L) mediante gene targeting

Southern blotGene ABCA1

Real-time PCR

Western blot

Southern blot

La ricombinazione diABCA1Era specifica per ilfegato

Efflusso lipidico in topi wt e Abca1 (-L/-L)

Topi knockout fegato-specifici per ABCA1 non hanno efflusso lipidicoApo-AI dipendente negli epatociti

Analisi dei lipidi plasmatici e delle lipoproteine

Relazione tra la proteina ABCA1 epatica e HDL-C

Si osserva un effetto genotipo dose dipendente tra l’espressione epatica della proteina ABCA1 che correla con la diminuzione della concentrazione plasmatica di HDL-C fegato specifica

Western blot

Ruolo di ABCA1 nel catabolismo delle HDL

In pazienti con TD iniettati con HDL di donatori sani queste venivano rapidamente degradate.

HDL di topi wt marcate con [125I] tyramina cellobioso per analizzare il decadimento plasmatico e l’assorbimento nei tessuti e iniettate nei 3 genotipi dei topi.

L’assorbimento di HDL-Apo AI avviene permezzo di SR-BI nel fegato, l’Apo AI rilasciatamancando ABCA1 viene degradata dal rene

Conclusioni e prospettive future

ABCA1 è la molecola chiave nella formazione delle HDL nascenti (pre-βHDL) ed è responsabile dell’assemblamento di FC e PL con Apo-AI.

Responsabile nel mantenere la concentrazione epatica di HDL attraverso la lipidazione di Apo-AI di nuova sintesi e di Apo-AI riciclate derivanti dal catabolismo di particelle di HDL.

Modelli animali e studi in vitro mostrano che ABCA1 epatico è responsabile dell’80% delle HDL plasmatiche, e ABCA1 intestinale del 30%.

ABCA1 è finemente regolato sia a livello trascrizionale che post-trascrizionaleComprendere i meccanismi di regolazione e le molecole coinvolte in questo processo saranno utili a sviluppare nuove strategie terapeutiche nella cura delle malattie cardiovascolari