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La Risonanza Magnetica nello studio degli oli di oliva:

risultati e prospettive

Luisa Mannina

Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Chimica e Tecnologie del Farmaco, Facoltà di Farmacia e Medicina

luisa.mannina@uniroma1.it

Torino, 9-10 Novembre, 2017

Perché l’analisi NMR nello studio degli oli di oliva

Fornisce una descrizione globale quantitativa dei composti presenti negli alimenti

ANALISI DELLANALISI DELL’’OLIO DI OLIVAOLIO DI OLIVA

Il nostro approccio

OLIO DI OLIVAOLIO DI OLIVAAnalisi NMRAnalisi

Statistica

600 MHz

Preparazione del campione: 20 mL di olio di oliva in un solvente misto (700 mL CDCl3 + 20 mL DMSO-d6)

Banca data di spettri dal 1993

LO SPETTRO PROTONICO (1)LO SPETTRO PROTONICO (1)La regione delle aldeidi

123456789101112131415 ppm

7.88.08.28.48 .68.89.09.29 .49.69.8 ppm

esanale

trans 2-esenale

formaldeide

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (2)LO SPETTRO PROTONICO (2)La regione dei terpeni

4.504.554.604.654.704.754.804.854.90 ppm

Terpene 1

Terpene 2Terpene 3

Terpene 4

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (3)LO SPETTRO PROTONICO (3)La regione dei digliceridi

3.653.703 .7 53.803.853 .903.954.00 pp m

1,3 digliceridi

1,2 digliceridi

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (4)LO SPETTRO PROTONICO (4)La regione dei diallilici

2.652.662 .672 .682.6 92 .7 02 .7 12 .7 22.732.742.752.762.772.78 pp m

Linolenico

Linoleico

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (6)LO SPETTRO PROTONICO (6)Il picco di riferimento

2.202.212.222.232.242.252.262.272.2 82.2 92.302.31 pp m

Normalizzato a 1000 e posto a

2,25 ppm

CH2 in posizione 2 rispetto al carbonile

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (7)LO SPETTRO PROTONICO (7)Lo squalene

1 . 5 81 . 5 91 . 6 01 .6 11 .6 21 . 6 31 .6 41 . 6 51 . 6 61 .6 7 p p m

squalene

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (8)LO SPETTRO PROTONICO (8)La regione dei metili terminali

0.880.890.900.910.920.930.940.950.960.97 ppm

Linolenico

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (9)LO SPETTRO PROTONICO (9)Il β-sitosterolo

0.590.600.610.620.630.640.650.66 ppm

β-sitosterolo

123456789101112131415 ppm

LO SPETTRO PROTONICO (2)LO SPETTRO PROTONICO (2)La regione dei terpeni

4.504.554.604.654.704.754.804.854.90 ppm

Terpene 1

Terpene 2Terpene 3

Terpene 4

LO SPETTRO DEL CARBONIO (1)LO SPETTRO DEL CARBONIO (1)

190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm

saturi

1 7 3 . 1 01 7 3 . 1 51 7 3 . 2 01 7 3 . 2 51 7 3 . 3 01 7 3 . 3 51 7 3 . 4 01 7 3 . 4 51 7 3 . 5 0 p p m

vacc. + eicose.

oleico

oleico

linoleico

linoleico

Sn 1,3 Sn 2CH2- O-CO- R sn 1CH - O- CO-R’ sn 2CH2-O- CO-R’’ sn 3

La regione dei carbonili

ANALISI STATISTICA (2)ANALISI STATISTICA (2)

Statistica descrittiva

Analisi della Varianza (ANOVA)

Analisi ad albero (TCA)Analisi delle

Componenti Principali (PCA)

Analisi discriminante lineare (LDA)

MODELLIZZAZIONE

Testare l’affidabilità del sistema statistico

Scartare o correggere i dati anomali

Scartare le variabili con basso potere discriminante

Meno rigorosa; deve comunque tener conto dei risultati ottenuti con la TCA e con la PCA

I risultati dipendono molto dal modo in cui si decidono di calcolare le distanza tra i dati e dal modo con cui si decidono di associare tali distanze

Es: Regressioni di tipo lineare, lineare multipla e non lineare.Usare sempre indici di affidabilità(Durbin-Watson, etc.)

MATRICE DI DATI

15

FACTORE PEDOCLIMATICOFACTORE PEDOCLIMATICO

LDA

Variabili: trans 2 esenale, Terpene 2 e 3, Digliceridi 1-2, diall.Linolen., diall Linoleic., Squalene, Sacidi grassi insaturi, Cera, CH3 del linoleico , ββββ Sitosterolo.

Olive oils from Lazio (2005)

FATTORE PEDOCLIMATICO (geografico) (13.1)FATTORE PEDOCLIMATICO (geografico) (13.1)

LDA

Variabili: Lino 1-3, Lino 2, CH3 Lino (13C); Esanale, Esenale, Terpene 1, 2 e 3, Digliceridi 1-2, diall.Linolen., diall Linoleic., Squalene, Saturi, Insaturi, Cera, ββββ Sitosterolo (CDCl3).

(2005)

18

TRACE Project (Tracing Food Commodities in Europe)

Food Quality and Safety: “Traceability” processes along the production chain

CampionamentoCampionamento

2005(316 campioni )

Italia

(163)

1 region

1 region

Liguria

(63)

Turchia

(14)

Grecia

(25)Francia

(9)

Spagna (42)

2006(351 campioni)

Italia

(172)

1 region

1 region

Liguria

(79)

Cipro

(6)

Grecia (46)

Francia

(10)

Spagna (38)

DOP&EV

DOP&EV

11 regions

14 regions

2 regions

5 regions

8 regions

1 region

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

11HH NMR: Data collectionNMR: Data collectionInstruments: 600 MHz, Bruker AVANCE

AQS600 spectrometer.

• Number of Scans (NS) = 1 K;

• 90° pulse;

• Time Domain (TD) = 64 K;

• Delay (D1)= 0,5 sec;

• Spectral width (SW) = 18.5 ppm;

• Temperature = 300 K;

Sample preparation

• 20 µµµµL of olive oil;

• 20 µµµµL of DMSO;

• 700 µµµµL of CDCl3;

1

2

9

4

5

6

8

11

3

7

10

1 CHCL3 Chloroform2 CH=CH All unsaturated fatty acids3 CHOCOR Glycerol (triacylglycerols)4 CH2OCOR Glycerol (triacylglycerols)5 CH=CHCH2CH=CH Linoleyl and linolenyl6 CH2COOR All acyl chains7 CH2CH=CH All unsaturated fatty acids8 CH2CH2COOR All acyl chains9 (CH2)n All acyl chains10 CH3 Linolenyl11 CH3 All acyls except linolenyl

La sensibilità è la percentuale di

campioni della liguria accettati

dal modello

La specificità è la percentuale di

tutti gli altri campioni rifiutati

dalla categoria Liguria

PC 2005Liguria 3 Sensibilità: 93.60%

(57/60)

Specificità: 90.95%(221/243)

World 5 Sensibiltà: 88.06%

Specificitità: 25.00%

SIMCA Models

PC 2006

Liguria 3 Sensibiltà: 94.85%(129/136)

Specificità: 74.09%(366/494)

World 5 sensibiltà: 87.24%

specificità: 16.91%

23

MEDEO PROJECT Development of Methods for the detection of adulteration of olive oil with

hazelnut oil

(2000-2003)

Olio di nocciola in olio di olivaOlio di nocciola in olio di oliva

Valutazione della risoluzione: l’intensità di A non deve superare il 25% dell’intensità del segnale B.

RIS

ULT

AT

I

Selected 1H NMR signals

Root 1

Root

2

-40 -20 0 20 40 60-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

FACTOR1

FA

CT

OR

2

-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

BA

(A) PCA and LDA (B) applicati ad oli di oliva con ����: 0%; ����: 10%;����: 15%; ���� 20% di oli di nocciola

26

19 varietà, analisi convenzionali ed NMR

27

28

10 oli di oliva aromatizati

Qualità degli oli di oliva aromatizzati

2 monoglycerides

1 monoglycerides

Olio di oliva giovane aromatizzato al rosmarino

Olio di oliva aromatizzato al rosmarino vecchio

ConclusioniConclusioniLa metodologia NMR è uno strumento “potente” per identificare e quantificare un grande numero di composti negli alimenti.

Non richiedere separazione e trattamento dei campioni

L’analisi statistica dei dati permette di classificare i campioni in accordo allo specifico problema (origine geografica, varietà ecc)

32

Gruppo Italiano Risonanza Magnetica nella scienza degli alimenti

(2015 in the frame of GIDRM)

-Workshop “Applications Magnetic Resonance in Food Science” even years, (in Rome, 2008-2010-2012-2014-2016…2018)

- NMR days, odd years (Fish and SeaFood Applications, Lecce, 19 april 2017)

Grazie per l’attenzione