Classe 4: liasi - biologia.campusnet.unito.it · 3) AB+H2O ÆA+B idrolasi (legami:scissione rev...

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 1

Classe 4: liasi

1) AH2+B A+BH2 ossidoreduttasi (trasf. Di H+e-)2) A+BC AB+C tranferasi (trasf. Di gruppi)3) AB+H2O A+B idrolasi (legami:scissione rev idrolitica)

LIASI(enzimi di 4° classe)4) AB A+BLa reazione liasica consiste nella formazione e scissione di un legame in modo che la molecola del substrato si risolve in due componenti.Reaz. reversibili :l’eq è dato dall’attività dei componenti e quindi dall’utilizzo dei componenti verso vie metaboliche particolari.


4. LIASI: coenzimi

Solo alcune liasi sono proteine coniugate con coenzimi di derivazione vitaminica Nel dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione di liasi specifiche che contengono come coenzima:

TPP (derivato dalla VITAMINA B1): -C-C- liasi specifiche che agiscono sugli α−chetoacidipromuovendo la decarbossilazionePALP (derivato dalla VITAMINA B6 ): liasi specifiche che agiscono sugli aminoacidi


Sottoclasse: tipo di legame interessato (che viene scisso o formato).

-C-C- CARBONIO-CARBONIO LIASI-C-N- CARBONIO-AZOTO LIASI-C-S- CARBONIO-ZOLFO LIASI-C-O- CARBONIO OSSIGENO LIASISOTTOSOTTOCLASSE: riguarda la categoria di substrati interessati dal meccanismo liasico.Nelle liasi alcuni E hanno CoE e richiedono la presenza di cofattori , altri sono solo Me proteine (Me di transizione) , altri ancora non hanno gruppo prosteticoma una concentrazione di R aa nel sito attivo che ne fa un centro di catalisi.


LIASI –C-C- vit B1 (TPP) dipendenti

N

N

NH2

CH3

N+

S

CH3

OH

Cl-

P

O

O

OH OH

OH

O

P-

TPP

N+

S

CH3

N+

S

CH3

Transizioni del coenzima durante la catalisi

Le –C-C- liasi hanno la vit.B1 (tiaminopirofosfato trasf.) come gruppo prostetico.Anche qui la catalisi è centrata sull’equilibrio dell’anello tiazolico tra 1 forma in cui 2’ è sede di struttura carbanionica o una in cui 2’ si impegna con doppio legame verso il substrato.


Effetto catalitico liasi TPP

Hanno effetto decarbossilanteSUBSTRATI: α−chetoacidiDecarbossilazioni1) Riduttive

2) Ossidative

L’ α-chetoacidoaldeide. Il C

carbanionico èmodificabile.Il C carbonilicopassa da n° +2 a +1.

OH O

CH3

C

C O

H O

CH3

C

C O + CO2

Il C carbonilicopassa da n° +2 a +3 (ac. Piruvico acacetico). L’acido non è libero ma veicolato dal suo vettore CoA(trasferasi).AcetilCoA

O

CH3

C

C OS CoA

+ CO2

OH O

CH3

C

C O + CoASH


Dettagli meccanismo catalitico

OH O

CH3

C

C O

N+

S

CH3

N+

S

CH3

δ +

N+

S

CH3

OH

OH O

CH3

C

C

OH

OH O

CH3

C

C

N+

S

CH3

OH

CH3

C

Il sito attivo delle liasi acetta la posizione C1-C2 degli α-chetoacidi. I legami C=O del carbossile sono polarizzati e la δ+ sul C facilita L’ATTIVITà DEL CARBANIONE SI FORMA IL LAGAME COVALENTE IL N°OSS +2 +1. PRIMO COMPOSTO CoE-SUBSTRATO STABILE.- effetto catalitico: (lattimica lattamica) Me cofattori :trasportano e- tra parte piridinica e tiazolica.

+ COOH


Meccanismo catalitico

Gli elettroni che partecipano al nuovo legame sono quelli del legame Cα-C1 che si scinde. Il C1 è struttura carbocationica neutralizzata dall’OH. -la CO2 si libera sempre sottoforma di bicarbonato.Il riequilibrio del nucleo piridinico verso la forma aromatoide fa si che si trasportano e- in senso inverso si forma un’aldeide attiva in forma carbanionica.

N+

S

CH3

OH

OH O

CH3

C

C-N

+

S

CH3

OH

OH O

CH3

C

C-

H+

Decarbossilazioneriduttiva

N+

S

CH3

OH

OH O

CH3

C

C

H

OH-

N+

S

CH3

OH

CH3

C -

H

OH

Aldeide idrata


Decarbossilazioni riduttive

Queste α-chetoacidodecarbossilasi sono presenti in tutte la cellule ma maggiormente nelle cellule procariote anaerobie; l’ α-chetoacido più abbondante è l’acido piruvico.Queste –C-C- liasi che danno decarbossilazioniriduttive sono distribuite generalmente nelle frazioni che nei peptidi sono definite ialoplasmatiche o del citoplasma solubile cioè la parte che non sedimenta anche a 100000x g.


Decarbossilazioni ossidative

Le decarbossilazioni ossidative interessano le membrane cellulari:nelle procariotiche sulla membrana plasmaticanelle eucariotiche sono nelle membrane interne del mitocondrio.Troviamo tre tipi di unità enzimatica che si organizzano strutt 4° e poi sopramolecolari.

1

2

3

Est.

Int.

1.1. LIASILIASI2.2. TRANSFERASITRANSFERASI3.3. OSSIDOREDUTTASIOSSIDOREDUTTASI


Descrizione unità 1,2,3

11°° tipo, unittipo, unitàà decarbossilantidecarbossilanti: LIASI: LIASI stessa organizzazione delle proteine della decarbossilazione riduttiva (TPP DIPENDENTI) ma hanno ampi domini idrofobici agiscono solo associati a materiale fosfolipidico(solo se inserite su membrana). Non sono transmembrana ma sporgono suillafaccia esterna della membrana interna mitocondriale.22°° tipotipo: : TRANSFERASI:TRANSFERASI: sono transmembrana, sono soggetti a

cambiamenti di conformazione e delimitano una sorta di ampio canale che li attraversa (carrier ma si compongono come enzimi di classe 2 transferasi). Hanno due coenzimi : uno legato in modo covalente (acido lipoico) e uno attraverso legami salini reversibili : Coenzima A33°° tipo: OSSIDORIDUTTASI:tipo: OSSIDORIDUTTASI: enzimi di classe uno ossidoriduttasi con

coenzima FAD (flavoproteina) minore distrubuzione di amino acidi idrofobici. Sporgono nella faccia interna della membrana interna mitocondriale.


Organizzazione sistemi decarbossilanti

I sistemi decarbossilanti non esistono solo in forma protomerica ma danno una struttura quaternaria che arriva a circa 50 protomeri con organizzazione cristallina.Dentro questa sono organizzate le subunità transferasiche che sono in numero minore, attraverso la membrana ed hanno contatti tra loro (effetti di cooperazione), il loro numero va da 3\4 a 1\2 di quelle liasiche.Nella grossa distribuzione superficiali dell’unità liasiche vediamo sporgere le unità transferasiche che dentro il plasmalemmainteragiscono con contatti idrofobici. Sull’altra faccia della membrana vicino alle subunità di tipo 2 che protrudono all’interno si hanno le subunità ossidoriduttasiche che sono 1\2 o 1\4 di quelle liasiche (in distribuzione geometrica definita).


Struttura sovramolecolare

Liasi : catturano e scindono gli alfa chetoacidi

Transferasi : trasportano l’acileOssidoriduttasi : sistema che riporta la

seconda subunità alle condizioinioriginarie.


1° passaggio

OH O

CH3

C

C O

N+

Sδ +

N+

SOH

OH O

CH3

C

C

N+

SOH

OH O

CH3

C

C

piruvato

attacco nucleofilo delle subunitàliasiche/decarbossilazionePiruvato deidrogenasi(organizzazione sovramolecolare) Alfa cheto glutarato deidrogenasi (ciclo di Krebbs)

N+

SOH

CH3

C

+ COOH


2° passaggio (i)

N+

SOH

OH O

CH3

C

C-

S

S

NH

O

C Lys- Enzi

N+

SOH

OH O

CH3

C

C

S

SH

NH

O

C Lys- Enz

Formazione di aldeide carbanionica per riequilibrio delle forme di risonanza: si realizza una prima reazione transferasica per attacco nucleofilo dal carbanione sul ponte disolfuro del CoE: ACIDO LIPOICO, acido carbossilico a 8 C con una ciclizzazione per formazione di un ponte disolfuro.Il ponte disolfuro viene scisso e si realizza un legame covalente tra lo zolfo e quella che era la struttura aldeidica con numero ossidazione “+1”, questa reazione redox fa transire il C che ha dato il legame da +1 a +2 : ritorno alle condizioni che esistono nel chetone


2° passaggio (ii)

N+

SOH

OH O

CH3

C

C

S

SH

NH

O

C Lys- Enz

N+

SOH

OH O

CH3

C

C

S

SH

NH

O

C Lys- Enz

-+

Mn

Il cambiamento di conformazione che segue orienta un R amino acidico del sito attivo dalla transferasi (nucleo imidazolico di istidina) verso il primo tipo di subunità. Il Mn prostetico della subunità 1 (decarbossilante) riconosce l’OH e destabilizza il legame –C-C- adiacente (scissione eterolitica)Si ottiene il doppio legame O=C con la dissociazione di un protone. Il numero di ox. è passato da +2 a +3 (carbossile mascherato nella struttura tioesterea).


2° passaggio (iii)

OC

S

SH

NH

O

C Lys- EnzCH3

CoASH

Abbiamo avuto la decarbossilazione ossidativa e l’unità a 2 C abbandona l’unità di primo tipo per trasferirsi sulla subunità transferasica. La subunitàtransferasica ora contiene acil-lipoato.

Acil lipoato : nella subunità secondaria si realizza un cambiamento di conformazioneLa struttura con l’acil lipoato cambia nel canale l’orientamento spaziale (passa ad uno orientamento verso l’interno) la Kd dell’enzima per il CoAdiviene molto bassa : l’enzima è in grado di catturare il CoA libero nell’ambiente interno.


2° passaggio (iv)Nella porzione piùinterna la subunità 2 porta l’atomo di manganese che fa da destabilizzante per il legame C-S.L’effetto è lo scatenarsi del meccanismo transferasico, in pratica sotto l’effetto del metallo di transizione l’acilesi sposta dal solfidrile che occupa nell’acido lipoico al solfidrile del CoA che in questo momento si trova molto vicino nello spazio si forma acil CoA.

OC

S

SH

NH

O

C Lys- EnzCH3

CoASH

Mn +

HS

SH

NH

O

C Lys- Enz

O

S C CH3CoA


2° passaggio (v)

HS

SH

NH

O

C Lys- Enz

O

S C CH3CoA

La partecipazione del metallo a questo meccanismo di trasferimento fa si che l’enzima subisca una modifica : aumenta di un fattore 104 a 106 la Kddella dissociazione apoproteina-CoA. L’acetil CoA dissocia sul lato interno della membrana (per cui nella membrana interna del mitocondrio) arriva sulla faccia esterna il piruvato ed esce sulla faccia interna del mitocondrio il CoA. La seconda proteina non si ècomportata solo come transferasi ma anche come carrier portando un’unitàbicarboniosa dall’esterno verso l’interno.


3° passaggio

S

S

NH

O

C Lys- EnzFMN

FMNH2

Acido lipoico sempre orientato verso la faccia interna, a questo punto intervengono gli enzimi del terzo gruppo ossidoriduttasi FAD dipendenti.FMN FMNH2 i coenzimi flavinici si trovano vicini all’acido lipoico lo riossidanorigenerando il ponte disolfuro. La riossidazione scatena l’ultima trasformazione : fa orientare ancora il braccio con coenzima verso la subunità liasica (verso la faccia esterna della membrana interna). Nella membrana interna dei mitocondri ci sono ossidoriduttasi NAD dipendenti ( non associate a particolari strutture) che riossidano le tre subunità e le unità riducenti vengono trasferite sul coenzima piridinico questo tipo di decarbossilazione ossidativa si conclude con acil CoA e unità riducenti con coenzima piridinici ridotti. Anche NAD proteine rimettono nella condizione di partenza i coenzimi flavinici della terza struttura che possono quindi ripetere il ciclo


LIASI PALP

Le liasi con coenzima PALP intervengono nel metabolismo degli aminoacidi.1a reazione: aggancio del substrato al coenzima e formazione del legame di base di Schiff

O MeO

OH

P O

O

CH2

H2C

N CH2-enzima

OH

NH2

HOOC

CH

ROH

NH

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

N

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

Base di Schiff

H+

Eliminazione virtuale di acqua


Liasi PALP

2) transizione alla forma chinoideLa catalisi è guidata dal metallo: la simmetria dei legami con i R del sito attivo promuove interazioni con il Cα (nelle transferasi PALP era il C sostituente in 4)

N

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

-O MeO

OH

P O CH2

HC

NH

CH2-enzima

OH

N

HOOC

C

R


Scissione C1-Cα: aminoacido decarbossilasi (-C-C- liasi)

La simmetria dei legami del Me può dare inoltre legami con altre parti del substrato.Se la terza interazione del metallo si stabilisce con l’O legato al C1 si ha scissione C1-Cα con decarbossilazione dell’aminoacido.

O

NH2

OH OH

OHNH2

NH2

O

O

NH2

NH2 OH

serina colamina + CO2

ornitina putrescina + CO2

NH2

OH

NH2

NH2

NH2

NH2

N

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

-

+

lisina cadaverina + CO2


Interazione con il sostituente in β

Si verifica per quegli aa che hanno in β un sostituente importante: es. cisteina e serina

N

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

-C β

serina

cisteina

Acido aminoacrilico α-imminoacido Acido piruvico

O

NH2

OH OH

O

NH2

SH OH

O

NH2

CH2 OH

O

NHOH

CH3

O

OOH

CH3


Trasformazione serina a glicina + -CH2OH

N

HOOC

CH

RO MeO

OH

P O CH2

HC

N CH2-enzima

OH

-C β

O

NH2

OH OH

ONH2 OH

Gly

+ -CH2OH

Ser

Le interazioni con il Me sono dirette una verso l’N e due verso il Cα.Il risultato è la scissione tra Cα e Cβ e la produzione di unità monocarboniosa che viene accettata da FH4 sotto forma di metilene –CH2-


Liasi metallo-dipendenti-C-O--C-S--C-N-

H

. C CH2

OH

.

H

. C CH2

NH2

.

Il metallo (es. il Fe) riconosce l’O dell’OH sostituente. Il Cu riconosce l’N del gruppo NH2.

Il passaggio da legame dativo a covalente provoca una sottrazione del sostituente mentre nel substrato precedente resta una carica +, ossia una struttura carbocationica. Gli OH o NH2 sono rilasciati dall’enzima come prodotto di reazione. La struttura si riassesta creando un doppio legame e dissociando un protone. Si forma una insaturazione. La reazione è reversibile e quindi può essere addizionato OH, SH, NH2su posizioni insature che li accettano come sostituenti.

Fe-Enzima Cu-Enzima

H

. C+

CH2 .

H

. C+

CH2 .

HO-Fe-Enzima H2N-Cu-Enzima

H

. C CH .

H

. C CH .

H+H+

Classe 4: liasi - biologia.campusnet.unito.it · 3) AB+H2O ÆA+B idrolasi (legami:scissione rev...

Documents

Transcript of Classe 4: liasi - biologia.campusnet.unito.it · 3) AB+H2O ÆA+B idrolasi (legami:scissione rev...