Scuola superiore medico tecnica di LocarnoFormazione tecnico in analisi biomediche

Ricerca di Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae nei prelievi cervico-vaginali

Allieva: Ramona ScolariSede di stage: Laboratorio di Citologia–ICP LocarnoPeriodo: gennaio–giugno 2012Responsabile allievi: Ariana RezzonicoResponsabile laboratorio: Pierangela Grassi

Ramona Scolari TAB 2 Citologia

SOMMARIO

1 INTRODUZIONE.................................................................................................................................2

2 NEISSERIA GONORRHOEAE................................................................................................................4

2.1 Eziologia.....................................................................................................................................4

2.2 Fattori di rischio.........................................................................................................................4

2.3 Sintomi......................................................................................................................................4

2.4 Analisi di laboratorio..................................................................................................................4

3 CHLAMYDIA TRACOMATIS.................................................................................................................5

3.1 Eziologia.....................................................................................................................................5

3.2 Fattori di rischio.........................................................................................................................5

3.3 Sintomi......................................................................................................................................5

3.4 Analisi di laboratorio..................................................................................................................5

3.4.1 Diagnosi clinica differenziale..............................................................................................5

3.4.2 Trattamento.......................................................................................................................5

4 PREANALITICA...................................................................................................................................6

4.1 Prelievo ginecologico.................................................................................................................6

4.2 Thin prep...................................................................................................................................6

5 ANALITICA (COBAS AMPLICOR).........................................................................................................7

5.1 Le fasi del processo analitico.....................................................................................................7

5.2 Analitica.....................................................................................................................................7

6 STATISTICA DEI DATI POSTIVI DAL 2005-2011.................................................................................11

7 CONCLUSIONE.................................................................................................................................14

8 SITOGRAFIA E BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................15

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1 INTRODUZIONEIl mio interesse per la citologia è maturato durante il primo anno di formazione quando sono stata attratta dalla possibilità di arrivare a una diagnosi analizzando al microscopio cellule singole o in gruppi poste su vetrini allestiti con diverse tecniche. Questo mi ha portato a scegliere lo stage nel laboratorio di citologia. Sto svolgendo il mio secondo periodo di pratica presso l’Istituto cantonale di patologia nel laboratorio di citologia clinica a Locarno. I materiali che arrivano a questo laboratorio possono essere suddivisi in due grandi gruppi:

campioni ginecologici: prelievi dal tratto genitale femminile; campioni non ginecologici: prelievi dal tratto respiratorio, dal tratto gastroenterico, liquor,

lavaggi, versamenti, urine, punzioni ad ago fine di organi superficiali e profondi.

CAMPIONI GINECOLOGICI

I campioni ginecologici in fase liquida (ThinPrep) pervengono al laboratorio dai diversi studi medici nonché da alcuni ospedali e cliniche del Cantone, ognuno è accompagnato da una richiesta per esame citologico ed eventuali analisi aggiuntive quali la ricerca di HPV, CT e NG. Per le analisi aggiuntive il laboratorio compila un nuovo foglio di richiesta finalizzato alla registrazione ed esecuzione di quella specifica analisi.L’analisi dei campioni inizia con le fasi preanalitiche: verifica della corrispondenza campione-richiesta, l’eventuale trattamento lisante del campione se questo contiene un eccesso di eritrociti e l’allestimento su strato sottile con il sistema TP 3000 a cui fa seguito la colorazione secondo il metodo Papanicolaou specifica per i campioni ginecologici. Questa particolare colorazione è composta da ematossilina (colorante nucleare), soluzione policroma EA50 e di soluzione OG6 (coloranti per il citoplasma con affinità tintoriali specifiche per i diversi tipi cellulari che consentono di valutare il grado di maturazione cellulare). La lettura al microscopio viene fatta da personale tecnico specializzato (citotecnici) nello screening del vetrino e valuta, se il materiale cellulare è soddisfacente e la presenza o l’assenza di lesioni epiteliali. In un vetrino si possono ritrovare la presenza di miceti (es. candida), batteri (es. vaginosi batterica) o virus (es. Herpes simplex). Se il campione è definito entro i limiti di normalità viene emesso il risultato, altrimenti il caso passa al responsabile di laboratorio che a sua volta può far uscire il referto (in caso di negatività), oppure sottoporlo all’attenzione del medico patologo per definire la diagnosi.

Figura 1: esempio di cellule cervicale viste al microscopio

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CAMPIONI NON GINECOLOGICI

Ci sono più tipi di campioni non ginecologici che vengono trattati diversamente da quelli ginecologici ma poiché in questo lavoro ci si riferisce ai campioni ginecologici non verrà approfondita questa parte.

OBIETTIVO

Come obiettivo per questo secondo stage voglio approfondire l’analisi per la ricerca dell’infezione di Chlamydia tracomatis (CT) e Neisseria gonorrhoeae (NG) ed analizzare la distribuzione della frequenza dell’infezione in relazione all’ età delle pazienti.

MEZZI E RISORSE

Per trovare le informazioni su questi due patogeni farò riferimento sia alle nozioni scolastiche, sia alla letteratura disponibile sul posto di lavoro e in rete. Spiegherò il principio alla base di quest’analisi e lo svolgimento della metodica. Il lavoro si basa soprattutto su dati di archivio relativi agli anni 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 e 2011. I dati raccolti riguardano il numero totale di analisi eseguite e il numero di quelle risultate positive suddivise per anni e per classi di età. I risultati saranno esposti con ausilio di grafici.Da questo tipo di lavoro mi aspetto di non trovare molti risultati positivi perché c’è in atto da tempo una prevenzione per le malattie a trasmissione sessuale.

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2 NEISSERIA GONORRHOEAE

2.1 EziologiaL’agente eziologico della Gonorrea è il batterio Neisseria gonorrhoeae (NG) che appartiene alla famiglia Neisseria spp di cui solo due sono patogene per l’uomo: la Neisseria meningitidis e la Neisseria gonorrhoeae. La NG induce una malattia a trasmissione sessuale, il batterio cresce su terreno di coltura agar cioccolato (sangue cotto) ed è molto fragile (a temperatura ambiente muore facilmente).

2.2 Fattori di rischio Promiscuità; prostitute; bisessuali; omosessuali; aumenta il rischio di contrarre HIV/AIDS.

2.3 SintomiUomo:

raro; asintomatico; dolore nella minzione, perdite purulente, dolore ai testicoli; complicazioni: setticemia, epididimite, orchite, cistite, prostatite, infertilità.

Donna: 50% casi asintomatica; perdite vaginali, dolore nella minzione, sanguinamento vaginale, dolore addominale e pelvico; complicazioni: cistite, salpingite, malattia infiammatoria pelvica, infertilità.

Neonato: in caso di madre infetta è pericoloso perché può infettare gli occhi causando una congiuntivite.

2.4 Analisi di laboratorioIstituto cantonale di microbiologia:

siero: ricerca anticorpi; striscio gola/occhio: coltura; striscio vaginale/uretrale/anale/cervicale o sperma: coltura; urina o striscio uretrale/cervicale: PCR.

Istituto cantonale di patologia laboratorio di citologia clinica: materiale cervico-vaginale raccolto in fase liquida (Thin prep): PCR (AMPLICOR COBAS).

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3 CHLAMYDIA TRACOMATIS

3.1 EziologiaIl batterio Chlamydia tracomatis (CT) appartiene alla famiglia Chlamydia spp di cui tre sono patogene per l’uomo: la Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumonae e la Chlamydia trachomatis. La CT è un piccolo batterio gram negativo con una parete cellulare rigida, è un parassita endocellulare obbligato. Ci sono quindici sierotipi che possono causare diverse malattie tra cui tracoma, congiuntiviti e malattie a trasmissione sessuale.

3.2 Fattori di rischio Promiscuità; giovani donne.

3.3 SintomiUomo:

perdite dal pene; dolore testicolare; dolore nella minzione.

Donna: dolore nella minzione; dolore al basso ventre; perdite vaginali; rapporti sessuali dolorosi.

Neonato; in caso di madre infetta il neonato durante il passaggio nel canale del parto può infettarsi gli

occhi causando congiuntivite o sviluppare una polmonite.

3.4 Analisi di laboratorioIstituto cantonale di microbiologia:

siero: ricerca anticorpi; urina, striscio uretrale/cervicale: PCR.

Istituto cantonale di patologia laboratorio di citologia clinica: materiale cervico-vaginale raccolto in fase liquida (Thin prep): PCR (AMPLICOR COBAS).

3.4.1 Diagnosi clinica differenziale

Non è facile distinguere clinicamente l’infezione da CT dalla NG poiché i sintomi sono simili.

3.4.2 Trattamento

Trattamento antibiotico in entrambe le infezioni.

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4 PREANALITICA

4.1 Prelievo ginecologico

Il test per la ricerca della CT e NG viene eseguito sul materiale residuo dopo che è stato allestito un vetrino per il pap-test. Per il pap-test il ginecologo, con l’ausilio di uno speculum (vedi figura 1), procede ad un prelievo dalla cervice uterina con una spatola di Ayre e degli appositi spazzolini (vedi figura 2). Il materiale prelevato viene trasferito in un vial, il barattolo Thin Prep che dopo essere stato chiuso, identificato con nome e cognome della paziente viene inviato al laboratorio accompagnato dalla richiesta di esame contenente dati anagrafici e informazioni cliniche. In laboratorio si procederà all’allestimento in strato sottile del campione.

4.2 Thin prepIl Thin prep contiene una soluzione chiamata PreservCyt composta da metanolo e un conservante tamponato. Questa soluzione conserva durante il trasporto le cellule prelevate e il DNA in essa contenuto. Può essere conservato a temperatura ambiente tra 15-30° C per massimo 6 mesi (non oltre la scadenza indicata sul barattolo).Al momento dell’uso non c’è bisogno una ricostituzione, miscelazione o diluizione. Per ottenere un vetrino con uno strato sottile e uniforme di cellule si usa un processore Thin prep 2000 o Thin prep 3000. Un filtro mescola la soluzione del Thin prep disperdono le cellule uniformemente che vengono poi aspirate assieme al liquido attaccandosi al filtro per poi essere trasferite su un vetrino (identificato con

il numero e il nome del paziente dal processore) grazie all’emissione di un forte soffio d’aria.

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Figura 3: Thin Prep e spatole di prelievo

Figura 4: Thin prep

Figura 5: allestimento del vetrino

Figura 2: prelievo dalla cervice uterina con spazzolino e speculum

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5 ANALITICA (COBAS AMPLICOR)Presso il laboratorio di citologia per l’analisi di CT e NG si usa il sistema COBAS AMPLICOR che permette la rivelazione del DNA dei due patogeni. Si tratta di un test diagnostico qualitativo in vitro che viene eseguito mediamente una volta alla settimana. Il test si basa sulla tecnica PCR (Polymerase Chain Reaction) e sull’ibridazione degli acidi nucleici dei due batteri. Come risultato si ottiene la sequenza specifica del genoma di entrambi i batteri (test multiplo).Il materiale su cui è possibile effettuare l’analisi è un prelievo cervicale (sospeso in Thin prep o in un medium dedicato) con lo strumento attualmente in uso è possibile analizzare contemporaneamente fino ad un massimo 21 campioni più 2 controlli di qualità del kit e 1 controllo di qualità interno del laboratorio.

5.1 Le fasi del processo analiticoIl processo analitico si può dividere in quattro fasi:

preparazione dei campioni; amplificazione del DNA dei due patogeni tramite PCR; ibridazione dell’amplificato con sonde specifiche; rilevazione colorimetrica.

5.2 AnaliticaCAMPIONE EMORRAGICO

Quando arriva un Thin prep con la richiesta di CT o NG è importante valutare se è emorragico. In questo caso è necessario lavarlo nel seguente modo:

trasferire il campione dal barattolo in una provetta (Falcon); centrifugare a 1700 giri per 10 minuti; travasare il sopranatante (parte liquida) nel suo barattolo originale; lavare il sedimento con Cytolit (contiene acido acetico che lisa gli eritrociti che altrimenti

interferirebbero con l’analisi); centrifugare a 1700 giri per 10 minuti; buttare il sopranatante; riportare il sedimento nel suo barattolo corrispondente.

REAGENTI D’USO (conservati a 4°C in frigo)

kit dei reagenti di reazione (pronto all’uso): substrato A(SB3), substrato B(SB), soluzione di denaturazione(DN4), soluzione coniugato di avidina-perossidasi(CN);

kit per la preparazione dei campioni(pronto all’uso): diluente(CT/NG DIL), reagente di lisi(CT/NG LYS), 1 flacone CT/NG urine wash;

kit di amplificazione (pronto all’uso): master mix (CT/NG MMX), liquido rosso (CT/NG IC), 1 controllo CT+, 1 controllo NG+;

kit di detezione Chlamidia (pronto all’uso): sospensione 1 di sonda CT (CT PS1), sospensione 2 di sonda CT (CT4);

kit di detezione Gonorrea (pronto all’uso): sospensione 1 di sonda NG (NG PS1), sospensione 2 di sonda NG (NG4);

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kit di detezione del controllo interno(pronto all’uso): sospensione 1 della sonda controllo interno(IC PS1), sospensione 2 della sonda controllo interno(IC4);

M4RT(pronto all’uso): medium di trasporto; wash buffer: tampone di lavaggio (conservare a temperatura ambiente).

CONTROLLI DI QUALITÀ

Controllo di qualità interno (1x): campione positivo della precedente analisi.Controlli di qualità del kit (2x).Preparare i controlli di qualità del kit per ogni serie settimanale di analisi:

1) Chlamydia positivo e Gonorrea negativo: preparare 2 provette da 2 ml; pipettare 1 ml di CT/NG DIL in una provetta e aggiungere 100µl di controllo CT+; vortexare; seconda provetta pipettare 250µl di CT/NG LYS e aggiungere 250µl della miscela della prima

provetta.

2) Chlamydia negativo e Gonorrea positivo: preparare 2 provette da 2 ml; pipettare 1 ml di CT/NG DIL in una provetta e aggiungere 100µl di controllo NG+; vortexare; seconda provetta pipettare 250µl di CT/NG LYS e aggiungere 250µl della miscela della prima

provetta.

PROCEDIMENTO

preparare un foglio di lavoro con il nome dei pazienti e il numero assegnato al campione; assegnare un numero ai pazienti controllando che la richiesta e il Thin prep corrispondono. I

numeri 1 e 2 saranno riferiti ai controlli del Kit; preparare 2 microtubi per paziente con il numero corrispondente su tappo e lato del

microtubo; vortexare; pipettare 1 ml per campione nel microtubo usando pipette con filtro per evitare

contaminazioni; centrifugare a 12500 giri per 15 minuti; buttare il sopranatante facendo attenzione a non toccare la parte interna del il tappo e

tamponare le provette su carta usando un foglio diverso per ogni campione; aggiungere 500 µl di M4RT; vortexare; riunire il materiale in un'unica provetta; pipettare in una nuova provetta 100µl di CT/NG LYS; aggiungere 100 µl del campione; vortexare; lasciare riposare per 10 minuti a temperatura ambiente; aggiungere 200µl di CT/NG DIL; vortexare; incubare per 10 minuti a 90°C; centrifugare per 10 minuti;

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preparare i controlli.

Preparazione dell’anello di amplificazione: scegliere il numero di A-ring (anelli A) necessari per l’analisi del campione tenendo conto che

ognuno di questi A-ring permette l’analisi di 10 campioni e 2 controlli; inserirli nell’apposito porta A-ring; pipettare 50 µl di CT/NG MMX; pipettare 50µl per campione nelle provette dell’anello seguendo l’ordine numerico.

Porre A-ring con le provettine in un sacchetto di plastica e porle in frigo mentre si finisce di preparare i campioni.

PREPARAZIONE DELLO STRUMENTO E AVVIO DELL’ANALISI

controllare la quantità di reagenti; preparare i reagenti; posizionare nell’area n° 13 i vassoi con i reagenti generici: SB3 e aggiungere 5 ml di SB, DN4,

CN4; posizionare nell’area n° 11 i vassoi con i reagenti specifici: CT4, NG4, IC4; su ogni cassetta registrare la data d’apertura; usando il software AMPLILINK identificare le due rastrelliere;

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1: meccanismo di trasferimento2: incubatore3: fotometro4: schermo LCD5: tastiera6: lettore codice barre7: stazione di lavaggio8:accensione/spegnimento9: vassoio con cuvettes10: vassoi dei reagenti11: termociclatore

Figura 6: COBAS AMPLICOR

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configurare le rastrelliere indicando posizione e numeri di lotto dei reagenti e caricarle; collocare gli A-ring nel termociclatore; inserire nel software i dati dei pazienti; chiudere il coperchio del termociclatore; avviare l’analizzatore.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

Il metodo per l’identificazione di uno dei due patogeni si basa su una tecnica che permette di amplificare una parte specifica del DNA.Reagenti necessari:

DNA da amplificare; oligonucleotidi sintetici

complementari alle estremità da amplificare;

desossiribonucleotidi; enzima Taq Polimerasi; Soluzione salina tamponata.

Il processo è composto da tre fasi che vengono più volte ripetute:

DENATURAZIONE: il DNA a doppia catena viene separato grazie ad un aumento della temperatura a 94-95° C;

APPAIAMENTO: gli oligonucleotidi si appaiano con le sequenze complementari grazie ad un abbassamento della temperatura a 60°C;

ESTENSIONE: l’enzima Taq Polimerasi avvia la sintesi del DNA e lavora a

72°C.

Da un doppio filamento di DNA di nostro interesse che vogliamo amplificare se ne ottengo due e a questo punto si ricomincia con la denaturazione, appaiamento e estensione. Il tutto viene ripetuto dai 25 a 40 cicli per ottenere un numero quantificabile di DNA.

RISULTATO

Densità ottica:< 0,2: negativo≥0,2 e < 0,8: zona grigia (si ripete l’analisi, se di nuovo dubbio dare come risultato)≥ 0,8: positivo (inviare il campione all’istituto di Microbiologia di Zurigo per conferma della positività)

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Figura 7: reazione a catena della polimerasi

Figura 8: amplificazione esponenziale

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6 STATISTICA DEI DATI POSTIVI DAL 2005-2011Per questo lavoro di statistica ho deciso di raccogliere i dati riguardanti le analisi eseguite per la ricerca di CT e NG. Ottenuti i dati ho osservato che i casi positivi di NG sono davvero rari e ho deciso di prendere in considerazione solo quelli riguardanti la CT.

In questo grafico ho inserito tutti i pap-test ricevuti negli ultimi sette anni. Si può osservare che dal 2005 al 2006 c’è stato una diminuzione del numero di casi entrate con una ripresa successiva fino al 2011.

In questo grafico sono rappresentate le richieste di ricerca di CT rispetto ai pap test totali ricevuti degli ultimi sette anni. Interessante notare come dal 2006 al 2008 le richieste siano notevolmente aumentate rispetto al 2005. Si osserva una flessione nel 2009 per poi aumentare fino al 2011.

Con questo grafico viene rappresen-tata la percentuale tra le analisi ese-guite su i pap test totali. Anche in questo grafico le analisi eseguite rispetto ai pap test totali aumentano dal 2005 al 2008 per poi diminuire nel 2009 con una buona ripresa fino

al 2011.

Questo grafico mostra la per-centuale dei risultati positivi rispetto al numero delle analisi eseguite. Si nota che i casi positivi tendono ad aumentare negli anni, tranne nel 2008 dove si rileva una flessione.

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Ho raccolto i dati per i casi positivi per la ricerca di CT per poi suddividerli secondo delle fasce d’età dal 2005 al 2011. In generale si nota, nei sette anni considerati, una tendenza dell’aumento dei casi positivi tra le giovani donne di età compresa tra i 16 e i 30 anni, mentre il numero dei positivi diminuisce tra i 30 e i 40 anni fino a stabilizzarsi a pochi sporadici casi positivi dopo i 40 anni.

DISTRIBUZIONE DEI DATI NEI SETTE ANNI ESPRESSA SECONDO L’ETÀ

anno minimo primo quartile

mediana terzo quartile

massimo media moda curtosi

2005 16 22 30 39 44 30 -2,33

2006 17 19 23 30 48 25 18 2,57

2007 17 21 28 38 63 32 30 0,62

2008 16 22 23 26 62 27 23 4,67

2009 24 24 24 30 47 29 24 1,81

2010 16 24 23 31 41 25 24 -0,38

2011 17 20 23 30 46 26 22 0,27curtosi 5,52 -1,09 0,09 -0,68 -0,94 -1,08 2,06 0,35

Da questa tabella possiamo osservare che l’età minima in cui si è riscontrato un risultato positivo per la ricerca di CT si situa a 16 anni con un picco a 24 anni nel 2009, mentre l’età massima si situa attorno ai 46 anni fino al massimo di 63 anni nel 2007. La media si situa attorno ai 26/27 anni . La moda, valore che ci indica il dato raccolto più frequente dando una più reale visione della distribuzione, equivale a 24 anni mentre la mediana è di 23 anni. Da questi dati possiamo dire che, nelle diverse fasce d’età, il numero dei casi positivi resta generalmente costante negli anni considerati.La curtosi indica se la distribuzione dei dati si allontana dalla normalità distributiva diventando più piatta (distribuzione platicurtica) o più allungata (distribuzione leptocurtica). Per la distribuzione normale ci si riferisce alla curva di Gauss che assume un valore pari a zero:

se < a 0 è una distribuzione platicurtica; se > a 0 si definisce come distribuzione leptocurtica.

Nel nostro caso si può notare che il 2008 è l’anno che più si allontana da una normale distribuzione, invece gli altri anni non mostrano una gran variazione.

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L’ultimo grafico mostra che, negli anni presi in considerazione, solo i minimi hanno una distribuzione con una curtosi che si allontana parecchio dalla curva di Gauss, gli altri parametri si aggirano attorno allo zero con tendenza ad una distribuzione platicurtica.

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7 CONCLUSIONECon questo lavoro di stage ho ripercorso dall’inizio alla fine quest’analisi per comprendere meglio il processo per arrivare alla diagnosi di Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae.Molto interessante la possibilità di poter ricercare CT e NG nello stesso materiale cervicale prelevato dal ginecologo di routine per il pap-test, ciò permette al laboratorio di guadagnare tempo per dare una diagnosi ed evita alla paziente ulteriori prelievi. La facilità del prelievo e la possibilità di rilevare entrambi i patogeni con l’apparecchio COBAS Amplicor velocizza la diagnosi e, nello stesso momento, l’analisi non essendo completamente automatizzata rende l’operatore partecipe e responsabile dei risultati.La parte di statistica mette in evidenza come la frequenza dei casi positivi é maggiore nelle giovani donne. Essendo queste due infezioni sessualmente trasmissibili da questo risultato si rileva quanto sia importante il comportamento delle persone, dai 16 ai 30 anni quando generalmente la vita sessuale è più attiva ed è possibile che, in mancanza di adeguate informazioni, non sempre si usino le dovute precauzioni. Tra le donne over 40 potrebbe esserci una migliore informazione con conseguente riduzione del rischio d’infezione.Bisogna inoltre tener conto che i dati raccolti non rappresentano tutti i casi positivi rilevati in Ticino poiché vi sono altri laboratori che eseguono i test per la ricerca di questi due patogeni e, poiché nel laboratorio di citologia clinica non pervengono campioni prelevati dal sesso maschile per la ricerca di queste due infezioni, mancano i dati riguardanti gli uomini. Tuttavia si può ipotizzare che sia verosimile la tendenza ad un aumento del numero dei casi positivi anche tra gli uomini. Per avere una miglior visione della situazione nel Canton Ticino potrebbe essere interessante verificare i casi positivi per ambo i sessi rilevati nei laboratori di microbiologia presenti nel Cantone.Concludendo dai dati raccolti si può affermare che questa infezione purtroppo colpisce ancora molte giovani donne , ne consegue l’importanza di un’adeguata prevenzione e informazione.

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8 SITOGRAFIA E BIBLIOGRAFIASITOGRAFIA

http://www.mayoclinic.com/health/gonorrhea/DS00180: 11.03.2012; http://www4.ti.ch/fileadmin/DSS/DSP/UPVS/PDF/Indicatori/INDICATORI/1_Stato_di_salute/

Morbilita/1_3_11_Gonorrea.pdf: 11.03.2012; http://www4.ti.ch/fileadmin/DSS/DSP/UPVS/PDF/Indicatori/INDICATORI/1_Stato_di_salute/

Morbilita/1_3_12_Clamidia.pdf: 11.03.2012; http://www.mayoclinic.com/health/chlamydia/DS00173: 11.03.2012; http://users.unimi.it/segredid/anatomia_patologica_per_diagnostica.htm: 09.04.2012; http://www.cdc.gov/std/: 16.05.2012

SITOGRAFIA DELLE FIGURE

http://www.sciencephoto.com/media/87126/view: FOTO IN COPERTINA; http://www.implantsinlondon.co.uk/gynaecologist.html: FIGURA 1 https://ausl2.umbria.it/citologia/immagini/

pap48.jpg&w=521&h=429&ei=3h1vT5fuHOHi4QSHn8zAAg&zoom=1: 25.03.2012 FIGURA 2; http://www.pacrimpath.com/pacrim/serv/s.cyto.thinprep.php: 25.03.2012 FIGURA 3; http://www.bpac.org.nz/resources/bt/2009/october.asp: 25.03.2012 FIGURA 4; http://www.wcpl.com/physician_thinprep.asp: 25.03.2012 FIGURA 5; http://www.labexchange.com/en/buy-devices/d/?sn=20206: 25.03.2012 FIGURA 6; http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html: 25.03.2012 FIGURA 7 E 8 PCR.

BIBLIOGRAFIA E DISPENSE

Dispense corso microbiologia TAB 1 2010-2011; ICP: 4.1. IO Chlamydia t e Neisseria g–Cl: 02.03.2012; foglio illustrativo Thin prep; biologia molecolare 2011-2012 TAB 2. Roche Diagnostics (1998) AMPLICOR®-Produkte in diagnostischen Routinelabor; New Jersey,

MediCom Moss E & Woodland A.(2010) Chlamydia the silent disease, UK, Euromed communications

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