CELLULE CELLULE STAMINALISTAMINALI

Gigliola SicaGigliola Sica

Direttore dell’Istituto di Istologia ed EmbriologiaDirettore dell’Istituto di Istologia ed Embriologia

della Facoltà di Medicina e Chirurgiadella Facoltà di Medicina e Chirurgia

Università Cattolica del Sacro Cuore Università Cattolica del Sacro Cuore

Roma, Italia.Roma, Italia.

Cellule staminaliCellule staminali

L’aggettivo “staminale” deriva dal latino

“stamen” (stame) che significa letteralmente

“ordito del telaio – filo”.

In botanica lo stame è il filamento la cui parte

terminale contiene il polline.

Il greco “stemon” riconduce alla radice di

“stare” nel senso di “essere ritto”.

L’inglese “stem” indica la parte

principale di una pianta, che ne

costituisce l’asse portante che

supporta foglie, fiori e frutti.

L’aggettivo “staminale” sta a

significare, pertanto,

“ancestrale”, che precede, nel

caso specifico delle cellule, altri

elementi cellulari.

Le cellule staminali sono elementi provvisti di

due caratteristiche principalidue caratteristiche principali:

1) la capacità di autorinnovamento illimitato o

prolungato e cioè di riprodursi senza

differenziarsi;

2) la capacità di dare origine a cellule

progenitrici di transizione con attitudine

proliferativa limitata, dalle quali discendono

popolazioni di cellule altamente differenziate.

Le cellule staminalicellule staminali e quelle

progenitrici progenitrici specifiche sono

morfologicamente e

citochimicamente indistinguibili.

Sono cellule rotonde, con una sottile

rima di citoplasma basofilo e nucleo

con 2 o più nucleoli.

Le cellule staminali possono

essere distinte da quelle

progenitrici sulla base dei livelli

di espressione di alcuni geni e di

alcune proteine.

Nel corso della differenziazione la progenie

delle cellule progenitrici di alcune linee

cellulari procede attraverso una serie di

fasi intermedie morfologicamente

distinguibili in base alle dimensioni, alla

configurazione nucleare, alle proprietà

tintoriali e alla presenza o assenza di

granulazioni citoplasmatiche.

Cellule staminaliCellule staminali

2) embrioni ottenuti inserendo il nucleo di una

cellula

adulta in una cellula uovo, privata del suo

nucleo;3) organi di un feto abortito;

4) cordone ombelicale;

6) tessuti adulti.

Sorgenti:1) embrioni nei primi stadi dello sviluppo ottenuti mediante fecondazione in vitro a scopi riproduttivi o specificamente per la ricerca;

5) liquido amniotico;

Le cellule staminalicellule staminali sono

caratteristiche degli embrioni, ma

sono presenti anche negli organi

di individui adulti in piccola

quantità.

Le cellule stcellule staminali embrionaliaminali embrionali possono

derivare:

a) dalle cellule germinative primordiali, che

alla fine si differenziano in spermatozoi e

ovociti.

b) dalla blastocisti.

La preparazionepreparazione di cellule staminali embrionali umane implica:

2) il loro sviluppo fino allo stadio di blastocisti;

1) la produzione di embrioni umani e/o l’utilizzazione

di quelli soprannumerari da fecondazione in vitro o crioconservati;

3) il prelievo della massa cellulare interna, il che implica la distruzione dell’embrione.

5) ripetuti passaggi, fino alla formazione di linee

cellulari capaci di moltiplicarsi, conservando

le

caratteristiche delle cellule staminali.

4) la messa in coltura di tali cellule su uno strato

di

fibroblasti irradiati (feeder layer) e in un

terreno

di coltura adatto, dove esse si moltiplicano

fino alla formazione di colonie che poi

confluiscono;

Questo è, tuttavia, solo il punto di

partenza per la preparazione di linee

cellulari differenziate, ossia di cellule le

quali possiedono le caratteristiche che

assumono nei diversi tessuti, es.

muscolari, nervose, ematiche, etc.

Lo step successivo è l’orientamento in

coltura del differenziamento, mediante

fattori di crescita. Questa operazione non

è facile, visto che non conosciamo

completamente i meccanismi

che lo sottendono.

"Human embryonic stem cells that are becoming epithelial cells, as indicated by the presence of a protein called cytokeratin (in green). The nuclei are stained blue." From: Growing Stem Cells (Genome News Network) Research by Daniel G Anderson, Shulamit Levenberg & Robert Langer at the Massachusetts Institute of Technology.

Per quel che riguarda le cellule ottenute

da feti abortiti, il loro uso equivarrebbe a

quello di organi prelevati da cadavere.

Le cellule così ottenute non hanno fornito

dati conclusivi sulla loro capacità di dare

vita a diversi tessuti.

Le cellule staminali ottenute dai vasi del

cordone ombelicale permetterebbero

teoricamente di creare banche

personalizzate per ciascun neonato, una

riserva biologica da utilizzare anche a

distanza di tempo per curare malattie. Ad

oggi queste cellule hanno dato origine solo

a cellule del sangue; non è dimostrata la

capacità di dare vita ad

altri tessuti.

Prelievo di cellule staminali da cordone ombelicale

Caratteristiche delle cellule staminali Caratteristiche delle cellule staminali ottenute dal liquido amnioticoottenute dal liquido amniotico

Clonal human AFS cells have a normal karyotype and retain long telomeres.(a) Giemsa band karyogram showing chromosomes of late passage (>250 p.d.) cells. (b) Flow cytometry of late passage cells showing DNA stained with propidium iodide. G1 and G2/M indicate 2n and 4n cellular DNA content, respectively. S indicates cells undergoing DNA synthesis, intermediate in DNA content between 2n and 4n. (c) Conserved telomere length of AFS cells between early passage (20 p.d., lane 3) and late passage (250 p.d., lane 4). Short length (lane 1) and high length (lane 2) telomere standards are provided in the assay kit. Marker lengths are indicated. p.d., population doubling.

Nature Biotechnology - 25, 100 - 106 (2007).

In molti tessuti sono presenti cellule

staminali capaci, sostanzialmente, di dare

origine solo a cellule del tessuto da cui

provengono.

Tuttavia, in vari tessuti umani (midollo

osseo, cervello, mesenchima) si trovano

cellule staminali pluripotenti capaci di dare

origine a più tipi di cellule, in maggioranza

ematiche,

muscolari e nervose.

Cellule staminali adulteCellule staminali adulte

Nel midollo le cellule staminali da cui

derivano le varie linee di cellule

ematiche, che hanno come marcatore

il CD34, ove purificate, possono

ricostituire l’intera popolazione

ematica in pazienti trattati con

chemioterapia o radioterapia.

Le cellule emopoietiche pluripotenti

corrispondono a meno dello 0,2% della

popolazione totale delle cellule nucleate del

midollo.

La maggior parte di esse è in fase quiescente

e riprende a dividersi solo in risposta a

richieste di nuove cellule sanguigne.

Cellule staminali emopoieticheCellule staminali emopoietiche

Le cellule germinative primordialicellule germinative primordiali danno

origine agli spermatogoni che sono di

due tipi:

A, che si dividono per mitosi e

forniscono una riserva continua di

cellule staminali;

B, che danno origine agli spermatociti

primari.

Alcune cellule di tipo A abbandonano la

popolazione di cellule staminali e danno

origine a generazioni successive di

spermatogoni, progressivamente più

differenziate.

Al termine dell’ultima divisione delle

cellule A si formano gli spermatogoni di

tipo B e da essi derivano gli spermatociti

primari.

Fra le cellule del colletto delle ghiandole

gastriche è presente un modesto numero di

cellule staminali che governano il

rinnovamento continuo della mucosa.

Esse migrano verso l’alto per rimpiazzare le

cellule mucose superficiali e verso il basso

per formare cellule ossintiche e cellule

principali.

L’epitelio cilindrico pseudostratificato

ciliato dell’apparato respiratorio

presenta cellule basali. Sono

considerate cellule staminali destinate

a rimpiazzare le cellule ciliate e le

cellule caliciformi.

Il tessuto adiposo rappresenta una

ulteriore fonte di cellule staminali

che possono dar vita a cellule ossee

e muscolari.

Cellule staminali sono presenti nel

tessuto nervoso dei mammiferi in

via di sviluppo e nel sistema

nervoso dei mammiferi adulti,

incluso l’uomo.

Le cellule staminali ottenute dal

tessuto nervoso fetale e dal tessuto

nervoso adulto del topo, del ratto o

anche dell’uomo crescono bene in

coltura e, quando introdotte

nell’encefalo di animali da

esperimento, mostrano capacità di

migrazione e sostituzione di

aree danneggiate.

Neoregulina e proteina 2

osteomorfogena guidano lo

sviluppo di cellule staminali

nervose neuroni e glia o cellule

muscolari lisce.

L’impiego di cellule staminali pone,

tra gli altri, il problema della

tumorigenicità e quello della

incompatibilità immunologica.

Per superare il problema della

incompatibilità immunologica si è

arrivati alla clonazione terapeutica.

Il termine “clone” indica la produzione

di copie tutte uguali di una cellula o di

un tratto di DNA.

La locuzione “clonazione terapeutica”

indica il potenziale uso della tecnica

del trasferimento nucleare per

ottenere cellule, tessuti ed organi per

pazienti che necessitino della

sostituzione di un tessuto o di un

organo

malato o danneggiato.

Sono state proposte tre vie di

clonazione terapeutica, atte ad

ottenere cellule staminali umane

pluripotenti con una ben definita

informazione genetica, cui far seguire

la differenziazione desiderata:

1) trasferimento del nucleo di una cellula

somatica umana in un ovocita umano privato del

proprio nucleo, seguito dallo sviluppo embrionale

(blastocisti); prelievo della massa cellulare interna

e derivazione da questa delle cellule staminali e

quindi delle cellule differenziate desiderate;

2) trasferimento del nucleo di una cellula somatica

umana in un ovocita di altro animale;

3) riprogrammazione del nucleo di una

cellula somatica fondendolo con il citoplasma

di una cellula staminale embrionale.

Dati recentissimi della letteratura

(Letters di Nature on line) riportano

i risultati di esperimenti effettuati

nel topo per ottenere cellule

staminali embrionali mediante

nuclear transfer con delle

modifiche rispetto a quanto

illustrato precedentemente.

Questi lavori avrebbero lo scopo di

conciliare gli interessi scientifici e le

istanze etiche nella speranza di

generare anche un ampio

consenso sociale.

a) Alterazione del nucleo del donatore

per ottenere una blastocisti incapace

di impiantarsi in utero ma capace di

generare cellule staminali embrionali;

b) derivazione di cellule staminali da

un singolo blastomero di un embrione

allo stadio di 8 cellule senza alterare

lo sviluppo dell’embrione stesso.

a, b, Clump of GFP-positive mES

cells 48 h after aggregation with

single blastomeres; arrow shows a

protruding cluster of GFP-negative

cells. c, d, Outgrowth of GFP-

negative cells aggregated with GFP-

positive mES cells, after being plated

on MEFs; arrows point to GFP-

negative cells. e, f, Passage 1 of the

outgrowth; arrows show remaining

GFP-positive mES cells. g, h, Single

blastomere outgrowth on MEFs for 4

days without ES cells, stained with

Troma-1 and DAPI. a, c, e, Green

fluorescence; b, Hoffman modulation

optics; d, f, phase contrast. Scale

bar, 100 m.

PARADIGMA STANDARD DELLA PARADIGMA STANDARD DELLA

DIFFERENZIAZIONEDIFFERENZIAZIONE

Il differenziamentodifferenziamento è la comparsa di

differenze morfologiche, biochimiche e

funzionali tra le cellule. Alcune di

queste differenze sono visibili con

comuni mezzi di osservazione

(microscopio).

La comparsa di differenze visibili è

preceduta da quella di differenze invisibili

con le tecniche tradizionali

(determinazionedeterminazione).

Per ogni tipo di cellula è possibile

individuare un periodo critico prima del

quale le cellule possono cambiare il loro

destino, ma dopo il quale esse sono

determinate a differenziarsi in un certo

modo.

La determinazionedeterminazione implica anche il

concetto di memoria cellulare: le

cellule si ricordano di ciò che è

avvenuto nel periodo della

determinazione e rispondono agli

stimoli ambientali non solo in base al

loro patrimonio genetico, ma anche in

base alla loro storia.

Il differenziamentodifferenziamento può essere

indipendente (determinanti

citoplasmatici) o dipendente

induzione.

Le sostanze induttrici naturali sono

molecole specifiche come i fattori di

crescita trasformanti (TGF-o la

famiglia dei fattori di crescita dei

fibroblasti (FGF).

Il differenziamentodifferenziamento si verifica

sostanzialmente nel corso dello sviluppo

embrionale.

Tuttavia, esso si continua nel normale

turnover cellulare e nei processi riparativi.

Complesse interazioni si estrinsecano

tra le cellule adiacenti.

Le cellule vanno incontro a una graduale

restrizione del potenziale differenziativo.

Lo sviluppo è accompagnato da una gerarchia di

processi di differenziamento che va dalla

formazione dei 3 foglietti germinativi alla

produzione nell’uomo di oltre 200 tipi di

cellule diverse.Durante lo sviluppo si osservano peraltro

numerosi cambiamenti di forma che avvengono

attraverso migrazioni, ripiegamenti, tubulazioni,

invaginazioni, collettivamente noti con il

termine morfogenesi.

Nella proliferazione e nel

differenziamento cellulare sono

coinvolti diversi fattori di crescita:

EGF, TGFs, FGFs, fattore BIG,

interleuchine, sostanza morfogenetica

dell’osso, etc.

Nel differenziamento degli arti sono

anche implicati i fattori Wnt, che a

loro volta inducono l’espressione di

alcuni geni della famiglia Lim.

L’acquisizione delle caratteristiche del

blastema metanefrico richiede

l’espressione del gene per il fattore di

trascrizione chiamato WT1. La crescita

del blastema richiede l’espressione del

gene per il fattore di trascrizione

chiamato c-ret.

Mutazioni di WT1Mutazioni di WT1 danno origine ad

anomalie dello sviluppo del rene,

dell’apparato genitale e a

tumori renali dell’infanzia.

Questi tumori (di Wilms) sono rari

(8/1.000.000 di individui).

Per la differenziazione del nefrone

e la formazione del glomerulo sono

importanti: Mox 1, n-myc, Pax 2,

Hoxc-9.

La decisione di una cellula dello strato

germinativo di rimanere a far parte del

contingente delle cellule che proliferano o di

spostarsi nello strato spinoso e proseguire

nel differenziamento dipende da un

gran numero di fattori:

EGF, TGFs, HGF, calcio, acido retinoico,

fattore BIG (ligando del recettore ECK),

IL-1, IL-6.

Eccessivi livelli di questi fattori possono

causare disordini proliferativi

dell’epidermide: TGF- psoriasi.

Il differenziamento è talvolta legato a

induzioni interattive specifiche che si

esercitano tra gemme di

organi differenti.

Il differenziamento non spiega però tutto

quello che accade: si originano delle

diversità dovute esclusivamente al fatto

che gli stessi tipi di cellule vanno a disporsi

nello spazio in maniera diversa.

Esiste dunque il problema

dell’organizzazione spaziale (pattern).

In realtà, le cellule ricevono due tipi di

informazioni diverse:

1) destino istologico

2) destino spaziale (geni del pattern)

Il patternpattern è il progetto architettonico

dell’individuo, mentre la morfogenesimorfogenesi è

l’insieme dei processi che realizzano il

progetto.

Geni omeoticiGeni omeotici: controllano il piano di

formazione del corpo.

Omeogeni sono stati scoperti anche nei

vertebrati: essi sono riconoscibili dalla

presenza dell’omeobox, sequenza di 183

nucleotidi contenuta nei geni.

Esiste una certa proprietà di

correzione dalle deviazioni

(regolazione) e si pensa che

l’embrione sia diviso in aree

organogenetiche o campi

morfogenetici.

Totipotenza del germe

Possibilità di formare sia i tessuti embrionali

che quelli extraembrionali (persa allo stadio di

8 blastomeri).

Totipotenza embrionale

Capacità di formare tutti i tessuti dell’embrione

rimane più a lungo; è presente allo stadio di

blastocisti.

Gemelli monozigoti: 1/3 totale

1/3 ha 2 placente (bicoriali),la separazione è avvenuta precocemente

quando entrambi i gruppi avevano la capacità di formare il trofoblasto (primi 3 giorni);

gli altri 2/3 hanno una placenta sola (monocoriali).

La grande maggioranza ha due amnios.

Una piccola minoranza (1-2%) dei gemelli identici ha un solo amnios.

La separazione è avvenuta dopo la formazione dell’amnios: II settimana dello

sviluppo.

Quanto esposto a proposito delle cellule Quanto esposto a proposito delle cellule

staminali tende a modificare il staminali tende a modificare il

paradigma standard della paradigma standard della

differenziazione !differenziazione !

Si mira allaSi mira alla

TRANSDIFFERENZIAZIONE !TRANSDIFFERENZIAZIONE !

The hepatocyte-to-beta cell transdifferentiation paradigm The hepatocyte-to-beta cell transdifferentiation paradigm

Date le proprietà delle cellule staminali

è ovvio che esse siano importanti

durante lo sviluppo e il mantenimento

dell’omeostasi dell’organismo.

Due fenomeni biologici significativi

coinvolgono le cellule staminali:

1. L’invecchiamento

2. Il cancro

In condizioni fisiologiche le

cellule staminali presiedono al

rinnovamento cellulare e,

quando la capacità replicativa

tende ad esaurirsi, il tessuto

invecchia.

A causa della lunga vita e della

loro storia replicativa le cellule

staminali sono soggette a danni

indotti da fattori intra- o

extra-cellulari.

Alcuni errori dovuti alla

duplicazione del DNA possono

essere riparati, ma, a lungo

andare, i meccanismi di

riparazione possono rivelarsi

inefficaci.

Modelli di Tumorigenesi:Modelli di Tumorigenesi:

a) Modello semplificato a partire dalla

cellula staminale:

sviluppo tumorale clonale unidirezionalesviluppo tumorale clonale unidirezionale.

Tutte le cellule tumorali derivano dalla

cellula staminale e contengono mutazioni

riscontrabili in questa cellula.

Modelli di Tumorigenesi:Modelli di Tumorigenesi:

b) Modello di differenziazione dinamica:

sviluppo tumorale clonale multidirezionale.sviluppo tumorale clonale multidirezionale.

Anche in questo caso si trovano mutazioni

nella cellula staminale, ma il

differenziamento può estrinsecarsi in forme

diverse e le cellule possono andare incontro

ad una fluttuazione lungo la via

differenziativa riesprimendo le caratteristiche

delle cellule progenitrici.

c) Modello di reclutamento:

sviluppo tumorale non clonale multidirezionalesviluppo tumorale non clonale multidirezionale.

Il tumore, non solo contiene cellule staminali

mutate, ma recluta anche cellule normali che

sono necessarie al suo stesso sviluppo. Le

cellule reclutate possono avere mutazioni

differenti da quelle espresse nelle cellule

staminali e possono essere ingaggiate a

differenti stadi della differenziazione del “cell

lineage” a cui appartengono.

Modelli di Tumorigenesi:Modelli di Tumorigenesi:

Stem cell model of mammary carcinogenesisStem cell model of mammary carcinogenesis

Si ringraziano le Dott.sse:

Cristiana Angelucci

Fortunata Iacopino

Silvia Ferracuti

Cecilia Giannitelli

Per la collaborazione offerta alla realizzazione di questa presentazione.