Caratterizzazione dei polifenoli in puree di pesca

ed albicocca mediante LC-HRMS: un approccio

nella identificazione di adulterazioni

Bologna, 23 Giugno 2016

Emanuela Cocconi, SSICA Parma

AIJN (European Fruit Juice Association): qualità e genuinità di succhi e puree di frutta

In ambito comunitario, per valutare la qualità e la genuinità di succhi e puree di frutta si fa riferimento al Code of Practice (COP) del AIJN.

Linee di guida di riferimento che riportano le caratteristiche compositive di frutti processati industrialmente

Linee guida di riferimento individuali per 25 succhi/puree di frutta ed

ortaggi : Acerola, mela, albicocca, aronia, banana, ribes nero, mirtillo rosso, uva, pompelmo, guava, kiwi, limone, mandarino, mango, arancia, passion fruit, pesca, pera, ananas, melograno, lampone, amarena, fragola, pomodoro, carota.

AIJN CODE OF PRACTICE

AIJN Reference Guidelines

Sezione A : Requisiti qualitativi e igienici Sezione B : Parametri per la valutazione della genuinità (acidità totale, acidi organici, numero di formolo, ceneri, minerali, zuccheri..)

I parametri sono divisi in 4 categorie:

1. Parametri industriali: densità relativa e corrispondente valore di Brix per succhi naturali e succhi da

concentrato;

2. Requisiti igienici: acidità volatile, etanolo, acido D-L lattico e patulina;

3. Contaminanti ambientali: arsenico e metalli pesanti;

4. Parametri legati alla composizione: acidoL-ascorbico, olii essenziali, HMF

AIJN Reference Guidelines

Per ciascun parametro analitico presente nelle linee guida AIJN è

riportato un intervallo di variazione (valore minimo e massimo).

‘It is not possible to establish any universally applicable standards for processed fruit juices and for their authenticity. On the other hand, it is possible to give minimum or maximum values and/or ranges for the individual constituents. These are met in nature with a high degree of probability in a typical fruit juice and also take into account the regular influences of nature and appropriate processing.’ Code of Practice, General Comments

‘Purée/juice is obtained, by definition of the EC Directive from mature and sound fruit by mechanical processes and is treated by physical means’

‘The values and comments in this guideline are based on pure, authentic juices, without permitted ingredients and/or additives, exhibiting the characteristic colour and flavour of the named fruit ’

‘Various types and origins of fruit of industrial significance were subject to comprehensive analysis to provide the values found in guideline’

AIJN Reference Guidelines

Reference Guidelines, Introdution

Ref. AIJN Market Report 2014

Albicocche e pesche sono frutti tipici del sud Europa

Destinate al consumo fresco Solo una piccola parte è destinata alla

trasformazione industriale

AIJN Market Report 2014: Italia leader nella produzione europea di albicocche e pesche

Solidi solubili (g/100g) min 9/10 Acido citrico (g/kg) 1,5-5,0 Acido D-isocitrico (mg/kg) 30-160 Acido L-malico (g/kg) 2-6 Numero di formolo (ml/100g) 15-35 Ceneri (g/kg) 3,0-7,0 Potassio (mg/kg) 1400-3300 Fosforo (mg/kg) 110-230 Glucosio (g/kg) 7,5-25 Fruttosio (g/kg) 10-32 Saccarosio (g/kg) 12-60

AIJN reference guidelines per la purea di albicocca Sezione B

AIJN reference guidelines per la purea di pesca Sezione B

È possibile distinguere albicocca e pesca sulla base dei parametri riportati nelle linee guida del AIJN?

Solidi solubili (g/100g) 10,2/11,2 Acido citrico (g/kg) 1,5-16,0 Acido D-isocitrico (mg/kg) 75-200 Acido L-malico (g/kg) 5-20 Numero di formolo (ml/100g) 12-50 Ceneri (g/kg) 4,5-9,0 Potassio (mg/kg) 2000-4000 Fosforo (mg/kg) 100-300 Glucosio (g/kg) 15-50 Fruttosio (g/kg) 10-45 Saccarosio (g/kg) tracce-55

100% albicocca

Purea di pesca ed albicocca sono utilizzate come ingredienti nella preparazione di nettari, bevande, gelatine,…….

Ricevimento della purea

Controlli analitici di routine in accordo alle linee guida del AIJN

Sospetta aggiunta di frutti diversi da quello dichiarato

Necessità di controlli analitici più specifici ?

L’aggiunta di purea di pesca a purea di albicocca è una delle più comuni adulterazioni

INDUSTRIA DI SECONDA TRASFORMAZIONE

Controllo qualità/genuinità

Quadro analitico ambiguo

‘If some parameters do not fall within the values quoted in Section B this does not mean, automatically, that the sample is adulterated’ Ref. AIJN Reference Guidelines

Quadro analitico ambiguo

‘Interpretation of data from profiling procedures Over the last 10 years a number of profiling or “fingerprinting” methods have been developed that are very useful in assessing the quality and authenticity of fruit juices/purées. In most of these methods the pattern of peaks is often more important than their actual size. The fingerprinting methods include oligosaccharide, anthocyanin and polyphenol profiles and the profile of volatile flavour compounds. The pattern of isotopic data in a sample can also be useful to enhance the detection of added sugars and/or acids or in the assessment of country of origin.’ Code of Practice, Specific Comments category B parameter

‘Additional analyses and/or traceability survey (identification of origin, variety and/or actual climatic conditions, etc.) must be undertaken in order to determine whether the deviations are specific to the particular raw material or are attributable to a processing or adulteration procedure.’ Code of Practice, General Comments

‘Polyphenol profiles These methods have particular use in the detection

of the presence of one type of fruit in another. They

again involve the separation of the compounds by

reverse phase HPLC.

The methods produce a pattern of peaks that can

be compared with a reference sample of fruit. These

patterns are generally very complex. However, it is

often only particular regions of the profile that are of

specific interest in detecting the addition of one fruit

to another.

Typical examples of the use of these methods are:

Differentiation of citrus juices

The detection of mixtures of citrus juices such as

sweet (C. sinensis) and sour (C. aurantium) orange

The presence of grapefruit in orange

Differentiation of lime from lemon.

Differentiation of apple and pear or mixtures ’ Code of Practice, Specific Comments category B parametrer

Sospetta aggiunta di frutti diversi da quello dichiarato?

Quali molecole ricercare?

Nuovo fornitore?

100% albicocca

Scopo dello studio

Studiare la composizione in polifenoli liberi e coniugati di puree di

pesca ed albicocca Individuare polifenoli che possono essere discriminanti nei casi di

sospetta aggiunta di purea di pesca a purea di albicocca

Frutti provenienti dal Nord e Sud Italia

Frutti, raccolti tra maggio ed agosto 2014

Pesche ed albicocche idonee alla trasformazione industriale

Lo studio è stato condotto su :

Albicocche e pesche sono state trasformate in puree da una ditta conserviera italiana

Un campione medio costituito da circa 1 kg di purea è stato prelevato da ogni batch produttivo ed inviato alla SSICA

Purea Pesca

Purea di

albicocca

10 BATCH PRODUTTIVI

3 CAMPIONI PER OGNI BATCH

30 puree di pesca

10 BATCH PRODUTTIVI 3 CAMPIONI PER OGNI BATCH

30 puree di albicocca

Analisi dei polifenoli mediante UHPLC-HRMS/MS con spettrometro di

massa Q-ExactiveTM secondo:

Approccio target: identificazione e quantificazione di polifenoli

mediante corrispondenza con soluzioni standard

Approccio untarget: processamento dei raw files ottenuti

dall’analisi UHPLC-HRMS/MS con il software SIEVETM 2.1

Disegno sperimentale

Preparazione del campione

Le puree sono state diluite con una soluzione idroalcolica al 50% di

metanolo, filtrate su filtro di cellulosa e su filtro siringa in nylon da 0,2 µm.

Il filtrato è stato sottoposto ad analisi UHPLC-HRMS/MS.

Analisi UHPLC-MS/MS

L’analisi è stata condotta con un UHPLC Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate 3000 RS costituito da: Pompe: sistema quaternario (HPG-3000RS) Autocampionatore (WPS-3000 TRS) Alloggiamento Colonna TCC-3000RS

Accoppiato con uno spettrometro di massa Thermo Scientific™ Q Exactive™ quadrupole-Orbitrap™ e sorgente H-ESI II.

L’acquisizione degli spettri e dei cromatogrammi e la gestione del sistema cromatografico sono state eseguite con il software Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.1

Schematic representation of the Q Exactive quadrupole-Orbitrap mass spectrometer

HCD cell for precursor ion fragmentation

Quadrupole mass filter for precursor ion selection

OrbitrapTM mass analyzer

Ion transfert tube

S-Lens

C-trap for ion accumulation in parallel with Orbitrap detection

Analisi UHPLC-HRMS/MS

Condizioni cromatografiche

Colonna:

Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ C18 100mm x 2.1 mm, 1.9µm Hypersil GOLD C18

Temperatura colonna: 35°C

Volume di iniezione: 10 µl

Flusso: 0,3 ml/min

Fase mobile: Eluente A acqua/acido formico 0,1%; Eluente B acetonitrile/acido formico

0,1%

Eluizione a gradiente : 0 min, 1%B, 10min, 95%B, 13.5 min, 1%B, 16 min, 1%B.

Durata della corsa: 16,7 minuti

Acquisizione degli spettri di massa

Negative ion mode

Full MS e higher energy collisional dissociation (HCD) data-dependent MS/MS (full MS-

ddMS2).

Mass range da m/z 100 a 950.

Resolving power: 70000 per full MS scans e 17500 per HCD MS/MS scans.

Normalized collision energy (NCE) =30%.

Analisi UHPLC-HRMS/MS

Analisi UHPLC-HRMS/MS

Condizioni operative dello spettrometro di massa

Spray voltage, 3.00 kV

Sheath gas flow rate, 40 arbitrary units

Auxiliary gas flow rate, 10 arbitrary units

Capillary temperature, 250°C

Auxiliary gas heater temperature, 300°C.

Calibrazione dello strumento con : Thermo Scientific™ Pierce™ ESI negative ion calibration

solution (Catalog number: 88324)

Analisi UHPLC-HRMS/MS

Sono state preparate singole soluzioni madre in metanolo Per diluizione sono state preparate le soluzioni di lavoro in

soluzione idroalcolica al 50% di metanolo Standard : Flavonoli, Flavanoli, Acidi idrossicinnamici, Acidi

benzoici

Approccio target

Approccio target Flavonoli

Quercetin

kaempferol

Rutin

Hyperoside

Quercitrin

Kaempferol-3-glucoside

Kaempferol-3-rutinoside

Flavanoli

Catechin

Epicatechin

Acidi idrossicinnamici

Procianidine

Procianidina B2

Acido caffeico

Acido p-cumarico Acido o-cumarico

Acido clorogenico

Acido ferulico Acido sinapico

Acidi benzoici

Acido gallico

Target coumpound MF, molecular formula of the compound; Rt (min), retention time, in minutes; [M-H]-, accurate mass of precursor ion from MS1spectrum; MS2 main fragment, main fragment in the negative ion ESI-HCD MS/MS spectrum (NCE=30%) of precursor ion

Compounds MF Rt (min)

[M-H]- (m/z)

MS2 main fragment (m/z)

Flavonols Quercetin aglycon C15H10O7 6.16 301.0343 301.0354/151.0027 Rutin (quercetin-3-rutinoside)

C27H30O16 4.86 609.1450 300.0277

Hyperoside (quercetin-3-galactoside)

C21H20O12 4.97 463.0871 300.0276

Quercitrin (quercetin-3-rhamnoside)

C21H20O11 5.33 447.0922 301.0341

Kaempferol aglycon C15H10O6 6.73 285.0394 285.0405/151.0027 Kaempferol-3-rutinoside C27H30O15 5.16 593.1501 285.0398 Kaempferol-3-rutinoside C21H20O11 5.29 447.0922 284.0327 Flavanols Catechin C15H14O6 4.18 289.0706 245.0820 Epicatechin C15H14O6 4.50 289.0706 245.0820 Procyanidin B2 C30H26O12 4.30 577.1341 125.0245 Hydroxycinnamic acids and derivatives

Sinapic acid C11H12O5 4.20 223.0601 208.0378 Chlorogenic acid (5-caffeoylquinic acid)

C16H18O9 4.21 353.0867 191.0555

Caffeic acid C9H8O4 4.47 179.0339 135.0442 p-Coumaric acid C9H8O3 5.00 163.0390 119.0492 Ferulic acid C10H10O4 5.22 193.0495 134.0373 o-Coumaric acid C9H8O3 5.67 163.0390 119.0492 Hydroxybenzoic acid Gallic acid C7H6O5 2.25 169.0131 125.0244

Approccio target

Purea di albicocca

Acido clorogenico Rutina

Catechina Epicatechina

Procyanidin B2 Iperoside

Kanferolo-3-rutinoside Kanferolo-3-glucoside

Purea di pesca

Acido clorogenico Rutina Catechina Iperoside Kanferolo-3-glucoside

Approccio target

0

50

100

150

200

250

300

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10

mg/

kg

Chlorogenic acid rutin catechin epicatechin procianidin B2 hyperoside Kanferolo-3-rutinoside kanferolo-3-glucoside

Ac. c

loro

geni

co

Rutin

a

Ac. c

loro

geni

co

cate

chin

a

cate

chin

a

epic

atec

hina

Proc

iani

dina

B2

iper

osid

e

Kanf

erol

o-3-

rutin

osid

e

iper

osid

e

rutin

a

Kanf

erol

o-3-

gluc

osid

e

Approccio target

Purea di albicocca

Acido clorogenico, rutina, catechina, epicatechina e procianidina B2 sono

i principali polifenoli identificati nelle puree esaminate. Iperoside e

kanferolo-3-rutinoside sono presenti in piccole quantità.

Purea di pesca

Acido clorogenico, catechina, iperoside sono i principali polifenoli

identificati. La rutina è presente in piccole quantità; in tracce (<1 ppm) il

Kanferolo-3-glucoside.

L’analisi target non è sufficiente per individuare piccole aggiunte

di purea di pesca a purea di albicocca

Approccio untarget All datasets from Q Exactive analysis were processed with Thermo Scientific™

SIEVETM 2.1 software through the Chromatographic Alignment and Framing

algorithm.

SIEVE 2.1 software uses MS intensity from raw LC/MS data to find abundance

differences. It used a proprietary process to generate a unique “frame” for each

group of peaks within a specified m/z and retention time range. Frame by frame,

the algorithm determined whether there is a statistically significant difference in

abundance between samples. The chosen type of experiment was the Two Sample

Differential Analysis .

The apricot group is define as the control group and the application compares

the other group to this one. For each trend point, the application calculates a ratio

against the control group.

Approccio untarget: SIEVE 2.1 software

Impostazione esperimento

Approccio untarget: SIEVE 2.1 software Definizione parametri

Approccio untarget: SIEVE 2.1 software

Align

Frame

Identify

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

165.0557

59.0134

121.0295

93.0346

136.9324

147.0453119.050196.9601

126.9141 181.661868.1883 155.544261.8397 82.3286

Processamento dati

Principal Component Analysis dei campioni esaminati. I punti rossi rappresentano le puree di pesca mentre I punti blu rappresentano le puree di albicocca.

I frame sono in ordine decrescente di abbondanza di segnale

Analisi dati

Criteri utilizzati nella scelta dei frame da investigare: Abbondanza del segnale

Ratio

P-Value

Relazione tra i tre parametri

Ratio <0.5 segnale prevalente nel gruppo di controllo (Albicocca)

0.5 > Ratio < 2.0 Non ci sono differenze significative tra I due gruppi

Ratio>2 segnale prevalente nel gruppo Pesca

All’aumentare del Ratio, aumenta la presenza del segnale nel gruppo Pesca

Frame of interest found from differential

analysis by SieveTM 2.1 software were

submitted to Chemspider search.

Databases used in Chemspider accurate

mass search: KEGG, Natural Remedies,

Nature Chemical Biology, Nature

Chemistry, Nature Publishing Group,

PhyStandard, Plant Metabolic Network,

Planta Piloto de Química Fina,

Universidad de Alcalá, PlantCyc,

PubMed, Royal Society of Chemistry.

Approccio untarget Identify

Polyphenols putative identification was performed using two-stage approach:

1. Accurate mass determination generating elemental composition within a narrow

mass tolerance window for identification based on accurate precursor mass.

2. HCD product ion data to elaborate hypothetical fragmentation patterns. HCD

MS/MS spectra shown were also compared with data in literature and in the

Reference Library of m/z Cloud – Advanced mass spectral database (HighChem

LLC, Slovakia).

For some signals, the putative identification was confirmed by analysis performed on

authentic standard.

Approccio untarget Identify

Identify

Pesca4a #2330 RT: 5.18 AV: 1 NL: 1.75E6F: FTMS - p ESI d Full ms2 164.94@hcd30.00 [50.00-190.00]

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abun

danc

e

147.0451

165.0556

72.9929 119.0501

167.0346

123.0451 152.011473.9963 108.021493.0345 139.0399101.039771.0134 117.0343 163.040681.0345

Negative ion ESI-HCD MS/MS spectrum (NCE=30%) of the precursor ion at m/z 165.06

Identify

acidofenillattico #1929 RT: 5.15 AV: 1 NL: 2.11E7F: FTMS - p ESI d Full ms2 165.04@hcd30.00 [50.00-185.00]

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relat

ive A

bund

ance

147.0453

165.0558

72.9929 119.0503

91.0554103.055573.996370.636760.8005

Negative ion ESI-HCD MS/MS spectrum (NCE=30%) of phenyllactic acid

Identify

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relat

ive A

bund

ance

165.0557

59.0134

121.0295

93.0346

136.9324

147.0453119.050196.9601

126.9141 181.661868.1883 155.544261.8397 82.3286

Negative ion ESI-HCD MS/MS spectrum (NCE=30%) of p-hydrohydroxycinnamic acid (phloretic acid)

Identify

Phloretic acid

Analisi dati

Thermo Scientific™ Compound Discoverer™ 2.0

ID Ratio

Peach/ Apricot

Rt (min) [M-H]- (m/z)

MS2 main fragment

(m/z)

Predicted MF

Δm/z (ppm)

Putative identity

I 0.65 3.80 353.0880 191.0561 C16H18O9 0.90 neochlorogenic acid*

II 2.20 3.94 577.1354 125.0241 C30H26O12 0.55 procyanidin B1/B5*

III 0.53 4.12 337.0934 163.0401 C16H18O8 2.11 p-coumaroylquinic acid*

IV 0.20 4.30 367.1036 193.0506 C17H20O9 0.70 feruloylquinic acid*

V 825.03 4.43 431.1328 223.0976 C22H24O9 4.00 heptamethoxyflavone

VI 11.32

4.64 281.1397 171.1179 C15H22O5 0.48

octylgallate

VII 5.34 281.1397 139.0764 C15H22O5 gallic acid derivative

VIII 6.08 5.16 165.0556 147.0451 C9H10O3 0.56 3-phenyllactic acid*

IX 11.84 5.40 205.0871 161.0971 C12H14O3 0.23 3-dimethylallyl-4-hydroxy benzoic acid

X 36.16 5.67 313.0931 153.0920 C14H18O8 0.72 vanillin-glucoside

XI 6.22 6.19 417.1195 121.0294 C21H22O9 0.83 Pinocembrin 5-O-glucoside

The most interesting MS signals by SIEVE 2.1 software approach: novel compound identified or putatively assigned in apricot and peach puree.

*identification confirmed by authentic standard

Neochlorogenic acid

Procyanidin B1/B5

p-Coumaroylquinic acid

Feruloylquinic acid

3-phenyllactic acid

Heptamethoxyflavone Octylgallate Gallic acid derivative

3-Dimethylallyl-4-hydroxy benzoic acid Vanillin-glucoside Pinocembrin 5-O-glucoside

Neochlorogenic acid

Procyanidin B1/B5

p-Coumaroylquinic acid

Feruloylquinic acid 3-phenyllactic acid

Gallic acid derivative

Compound identified Compound identified

Compound putatively assigned Compound putatively assigned

3-Dimethylallyl-4-hydroxy benzoic acid

Vanillin-glucoside

Pinocembrin 5-O-glucoside

Grazie per l’attenzione!

emanuela.cocconi@ssica.it