1 Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T

I linfociti T maturi che non hanno mai incontrato l’antigene si concentrano negli organi linfoidi sec-ondari dove hanno la possibilità di riconoscere antigeni presentati dalle MHC di cellule dentritichemature e quindi di attivarsi. Una volta attivate seguono i processi di espansione e la differenziazionein cellule effettrici o della memoria. Sia i linfociti T naive che le cellule dentritiche mature sono attrattinelle aree T per azione di chemochine che interagiscono con i recettori CCR7. Una volta avvenuto l’in-contro, il riconoscimento dell’antigene presentato dalle MHC e l’interazione tra le proteine B7 espressedalla cellula dendritica e il corecettore CD28 determinano l’attivazione dei linfociti T. Una volta attivatoil linfocita inizia a secernere IL-2 (interleuchina 2), una citochina autocrina che avvia l’espansioneclonale. Alcuni linfociti T lasciano gli organi linfoidi ed entrano in circolo, altri rimangono lì per aiutarei linfociti B a differenziarsi in plasmacellule. Le risposte T terminano principalmente per apoptosi deilinfociti T attivati dovuta alla eliminazione dell’antigene che li depriva dello stimolo di sopravvivenza.

1.1 Attivazione dei linfociti CD4

L’attivazione presuppone che antigene e linfociti naive si trovino nello stesso tessuto linfoide. L’anti-gene raggiunge i linfonodi mediante drenaggio linfatico oppure raggiunge la milza attraverso il circoloematico. L’antigene si sposta trasportato dalle cellule dendritiche e viene presentato in associazionealle molecole MHC di classe II per l’attivazione dei CD4.

Per l’attivazione dei linfociti CD4 sono necessari due segnali: riconoscimento dell’antigene as-sociato a MHC e molecole costimolatorie B7-1 e B7-2. Per la proliferazione è necessaria inoltre laautosecrezione di IL-2; affinchè vi sia secrezione di Il-2 e parallela espressione del suo recettore è pri-ma necessario che il linfocita abbia riconosciuto l’antigene. In questo modo abbiamo proliferazionedelle sole cellule specifiche e necessarie, proliferazione che coinvolge dunque un unico clone cellularee definita espansione clonale. Con l’eliminazione degli antigeni la maggior parte dei T attivati muoreriportando il numero di linfociti a condizioni basali.

1.2 Attivazione dei linfociti CD8

Affinchè vi sia attivazione questa volta serve che l’antigene sia presentato da molecole MHC di classe I.I linfociti T CD8 hanno il compito di eliminare cellule infettate. Le risposte da questo gruppo di linfocitisono sollecitate da peptidi microbici presenti nel citosol delle cellule infette: questo pone un problemaperchè gli antigeni riconosciuti possono essere prodotti anche all’interno di una cellula che non è unaAPC professionale; le cellule dendritiche hanno però la speciale capacità di catturare e ingerire le celluleinfette o tumorali e di presentarne gli antigeni ai CD8 naive in un processo detto cross-presentazione.

L’attivazione dei CD8 è facilitata dall’azione dei CD4: nel caso di una forte risposta innata quest’ulti-ma è superflua ma diventa indispensabile per risposte a infezioni latenti,tumori ecc. I linfociti T helperproducono citochine che stimolano la differenziazione dei CD4, inoltre esprimono la proteina CD40Lche viene riconosciuta dal recettore CD40 sulle APC: questo ne aumenta l’efficacia nello stimolare ladifferenziazione dei CD8.

Alla pari dei CD4, anche i CD8 vanno incontro ad espansione clonale tuttavia in modo molto piùmassiccio: si passa da un linfocita specifico ogni 106 linfociti a uno ogni dieci. In seguito all’espansionesi ha la differenziazione in cellule effettrici CTL caratterizzate dalla presenza di granuli citoplasmaticilegati alla membrana contenenti proteine citolitiche quali la perforina e granzimi. Inoltre sono ingrado di produrre citochine tra cui IFN-γ e TNF. Due fattori di trascrizione sono richiesti per questanuova espressione genica: T-Bet e Eom.

1.3 Molecole costimolatorie

La differenziazione e proliferazione dei linfociti T naive richiedono molecole costimolatorie espresse dalleAPC: in assenza di costimolazione, anche in caso di incontro con l’antigene, i linfociti T muoiono perapoptosi in quanto incapaci di rispondere. La molecola meglio caratterizzata sui linfociti T è il recettoredi membrana CD28 che lega le glicoproteine costimolatorie B7-1 e B7-2 espresse sulle APC; B7-2 èespressa costitutivamente mentre B7-1 solo in cellule attivate. Prodotti microbici che legano il TLRe citochine, soprattutto IFN-γ, aumentano l’espressione delle B7, così come l’interazione CD40L:CD40.

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Le cellule dendritiche sono quelle che presentano la maggior espressione di queste glicoproteine equindi rappresentano le cellule più potenti nell’attivare i linfociti T naive. Molti adiuvanti hanno comefunzione lo stimolare l’espressione di molecole costimolatorie sulle APC.

L’assenza di molecole costimolatorie sulle APC contribuisce alla tolleranza verso gli antigeni self,poichè ogni APC presenta antigeni self ai linfociti T è proprio la mancanza di molecole costimolatorieche assicura che le cellule T non si attivino in associazione alla selezione negativa durante la fase dimaturazione. I linfociti T effettori e della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione di B7 esono quindi in grado di rispondere ad APC in tessuti non linfoidi in cui non sono espresse le B7. Ilcontrollo delle funzioni delle cellule T effettrici è effettuato da linfociti T regolatori deputati a inibire lefunzioni effettrici.

Il meccanismo di azione pro attivatorio dell’interazione CD28:B7 è compreso in modo parziale. Isegnali prodotti aumentano la produzione di citochine, specialmente l’autocrina IL-2, inoltre si hal’aumentata espressione della proteina anti apoptotica Bcl-x.

Oltre alle molecole attivatrici CD28 esistono anche molecole costimolatorie inibitrici sempre ap-partenenti alla famiglia delle CD28, primo esempio la CTLA-4. Questa lega sempre molecole B7 tut-tavia funge da regolatore negativo nella attivazione. Altra molecola inibitoria è PD-1 che lega molecoleappartenenti alla famiglia delle B7 chiamate B7-DC e B7-H1 andando a regolare negativamente l’at-tivazione del linfocita. Ultimo recettore costimolatore è chiamato ICOS e lega il ligando di ICOS conparticolare rilevanza nell’attivare funzioni effettrici quali la produzione di IL-10 e IL-4. L’attivazione diCD28 è cruciale per dare inizio alla risposta dei linfociti CD4 mentre quella di ICOS per le cellule Teffettrici. Si ipotizza che CTLA-4 inibisca rispote acute negli organi linfoidi mentre PD-1 quelle cronichee quelle in tessuti non linfoidi.

1.4 Trasduzione del segnale

La trasduzione del segnale in cellule naive attiva geni normalmente silenti i cui prodotti sono respons-abili della risposta e delle funzioni del linfocita attivato. Prima abbiamo visto come citochine e molecolecostimolatorie fossero un punto chiave nell’espansione clonale e nella differenziazione: l’attivazione delTCR è responsabile invece della specificità.

Il TCR non possiede attività enzimatica intrinseca e si trova associato al complesso CD3 e alla catenaζ formando il complesso del TCR che possiede, nel versante citoplasmatico, strutture dette dominiITAM: la fosforilazione di questi domini dà inizio alla trasduzione del segnale. Si assiste all’attivazionedi via di trasduzione parallele che confluiscono nell’attivazione di determinati fattori di trascrizione;levie sono principalmente tre:

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• la via della calcineurina che attiva NFAT

• la via della PKC che attiva NF-κB

• la via delle MAP chinasi che attivano AP-1

Queste tre vie sono a loro volta attivate mediante specifiche tirosin chinasi che mediano il segnale traTCR e gli enzimi sopra citati.

Tirosin chinasi Una volta formato il complesso del TCR quando il recettore si lega all’antigene eMHC una tirosin chinasi chiamata Lck associata a CD4 e CD8 si sposta vicino alle sequenze ITAM delcomplesso CD3 e della catena ζ attivandosi e fosforilando le tirosine in esse contenute. Queste tirosinefosforlate fungono da ancoraggio per un’altra tirosin chinasi chiamata ZAP -70 che una volta legatasiviene anche essa fosforilata da Lck attivandosi e andando a fosforilare numerosi substrati che fungonoda proteine adattatrici di altre molecole coinvolte nella trasduzione del segnale. Altro gruppo di chinasiimportanti sono le PI-3 chinasi attivate dalla costimolazione di CD28: questi enzimi catalizzano lagenerazione di fosfatidil inositolo tre fosfato (PIP3) a partire dal PIP2 di membrana. Le attività dellechinasi citate sono regolate da specifiche tirosine fosfatasi reclutate dal complesso TCR e chiamateSHP-1 e SHP-2 che inibiscono la trasduzione del segnale e un’altra è la SHIP.

Formazione della sinapsi immunologica La regione di contatto tra il linfocita T e la sua APC prendeil nome di sinapsi immunologica. Le molecole che vengono subito spostate verso il centro di questastruttura sono il complesso TCR, i corecettori CD4 o CD8, i recettori per i costimolatori (CD28) e varienzimi associati. La segnalazione viene avviata all’interno di questa struttura sovramolecolare.

Reclutamento e attivazione delle proteine adattatrici ZAP-70 si porta a fosforilare parecchie pro-teine adattatrici in grado di legarsi a molecole segnalatorie. Le proteine adattatrici presentano dominiricurrenti di tipo SH2 o SH3 che consentono loro di formare cluster di enzimi in tempi rapidi. Unevento chiave dell’attivazione del linfocita T è la fosforilazione da parte di ZAP-70 della proteina adatta-trice LAT, la quale è in grado di legarsi direttamente alla fosfolipasi Cγ1; la fosfolipasi è una molecolafondamentale che recluta altre proteine tra le quali SLP-76 e Grb-2.

Via della MAP chinasi La via Ras è iniziata a seguito del legame del TCR e porta all’attivazione di ERK,membro fondamentale della famiglia delle MAP kinasi che porta alla mobilitazione di diversi fattori ditrascrizione. Ras nella sua forma inattiva è legato ad una molecola di GDP che, quando viene sostituitada una di GTP, è responsabile dell’attivazione. L’attivazione di Ras coinvolge le proteine LAT e Grb-2,in quanto la catena di eventi è la seguente:

1. Fosforilazione di LAT da parte di ZAP-70

2. Reclutamento di Grb-2 su LAT

3. Reclutamento del fattore Sos da parte di Grb-2/LAT

4. Scambio di GTP per GDP su Ras grazie alla catalisi di Sos

5. Attivazione delle MAP kinasi

Esistono tre MAP kinasi principali nei linfociti T, delle quali il prototipo è ERK. L’attivazione di ERK loporta a traslocare nel nucleo e a fosforilare una proteina detta Elk, la quale stimola la trascrizione diFos, un componente del fattore di trascrizione AP-1.

In parallelo all’attivazione lungo la via Ras si ha il reclutamento di una piccola proteina detta Vav,la quale scambia GTP per GDP su una proteina detta Rac. Rac in forma attiva inizia una cascatasegnalatoria parallela che termina nell’attivazione della MAP kinasi JNK che si porta a fosforilare c-Jun,il secondo membro del fattore di trascrizione AP-1.

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Segnali calcio e fosfolipasi dipendenti La fosfolipasi Cγ1 è un enzima citosolico reclutato da LATfosforilata e fosforilato da ZAP-70 e altre chinasi. La fosfolipasi fosforilata si porta ad idrolizzare ilfosfolipide di membrana PIP2 producendo così IP3 e DAG. Il ruolo fisiologico di IP3 è l’aumento del cal-cio citoplasmatico per apertura di canali nel reticolo endoplasmatico; questa fuoriuscita dal reticoloattiva i canali CRAC che facilitano l’arrivo di altro calcio dal reparto extracellulare (difetti nel gene checodifica Orai, componente del canale CRAC, sono alla base di alcune rare immunodeficienze umane).Il calcio citoplasmatico agisce da molecola segnalatoria legandosi a varie calmoduline delle quali unafondamentale è la calcineurina. Il DAG attiva invece l’enzima PKC che è coinvolto nell’attivazione enella traslocazione nucleare di NF-κB.

Attivazione dei fattori di trascrizione I fattori di trascrizione che sono attivati nei linfociti T a seguitodel riconoscimento antigenico sembrano critici per quasi tutte le risposte di queste cellule e sono:

NFAT Questo fattore è richiesto per l’espressione di IL-2, IL-4, e TNF. Questo fattore è presente in for-ma inattiva serina-fosforilata nei linfociti T a riposo. La sua attivazione è legata alla calcineurina,che defosforila la molecola e ne svela la sequenza di localizzazione nucleare.

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AP-1 Questo fattore in realtà è una famiglia di molecole leganti DNA. La molecola meglio compresaè quella formata dalle subunità c-Jun e Fos. AP-1 sembra essere un punto di convergenza diparecchie vie segnalatorie attivate dal riconoscimento antigenico.

NF-κB Questo fattore è essenziale per la sintesi di parecchie citochine. Nei linfociti a riposo la molecolaè presente in complesso con inibitori specifici (IκB) che ne bloccano l’ingresso nel nucleo; i segnalidel TCR causano l’ubiquitinazione degli inibitori, quindi la loro degradazione e quindi il ripristinodella capacità del fattore di entrare nel nucleo.

1.5 Attenuazione della risposta

I meccanismi inibitori sono mediati da varie strategie quali il reclutamento delle fosfatasi SHP-1, l’at-tivazione dei recettori inibitori di famiglia CD28 e il reclutamento di proteine dette E3 ubiquitin ligasiche degradano certe molecole.

Recettori inibitori Il prototipo del recettore inibitorio è CTLA-4, di cui però si sa poco del mecca-nismo di azione. Normalmente questa molecola è sequestrata in vescicole intracellulari che vengonorapidamente mobilitate con la formazione della sinapsi immunologica. Nella sinapsi CTLA-4 potrebbecompetere con CD28 per legare le molecole B7 o reclutare fosfatasi che bloccano l’attivazione dei dominiITAM.

L’altro recettore inibitorio di interesse è PD-1, indotto in linfociti B, T e monociti a seguito dell’at-tivazione. PD-1 ha due ligandi, PD-L1 e PD-L2, omologhi ai B7 ed espressi su cellule dendriticheattivate, monociti e altre cellule. Il recettore contiene sul lato citoplasmatico dei domini ITIM checontribuiscono al reclutamento delle fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che attenuano il segnale.

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