BIOCATALISI

A.A.

2008 -2009

Dr. Davide Tessaro

Lezione 4:Enzimi redox:

le deidrogenasi

Scala redox composti bio

Enzimi redox

Le DHasi NAD-dipendentiSi avvalgono del cofattore Nicotinammide Adenina Dinucleotide (NADH), eventualmente fosforilato (NADPH), che non è legato covalentemente all’enzima e che viene consumato in quantità stechiometrica.

MeccanismoNella catalisi è coinvolto anche uno ione Zn++, che orienta e attiva il substrato

Le Dhasi sono selettive per quanto riguarda la stereochimica dell’idruro del cofattore: ogni enzima ha una propria specificità

Stereospecificità

Specificità di substrato

Y = lievito; HL = fegato di cavallo; TB = Thermoanaerobium brockii;

Riciclo del cofattorePrimo metodo: accoppiamento dei substrati

• per spostare l’equilibrio verso i prodotti va usato un eccesso di substrato ausiliario

• l’attività dell’enzima è distribuita tra le due reazioni;

• il prodotto deve essere purificato dalla gran quantità di ausiliario

• ausiliari reattivi deattivano l’enzima

• le alte concentrazioni in gioco portano ad inibizione

Riciclo del cofattoreSecondo metodo: accoppiamento di enzimi

• le reazioni devono essere indipendenti l’una dall’altra

• i substrati non devono competere per lo stesso enzima

• stato dell’arte OK per NADH, si cerca ancora un metodo efficiente a livello industriale per NADPH

Formiato deidrogenasi

• la reazione è irreversibile

• sia il formiato che la CO2 sono innocui (anche per l’enzima) e facilmente separabili

• il formiato è poco costoso

• TTN: 103 105

• FDH costosa e poco attiva (3 U/mg) si immobilizza l’enzima o si una una membrana

• FDH da Candida boidinii per NAD, FDH da Pseudomonas sp. Ingegnerizzata per NADPH

Glucosio deidrogenasi

• reazione irreversibile per idrolisi gluconolattone

• GDH da Bacillus cereus accetta sia NAD+ che NADP+ ed è stabile

• GDH costosa e separazione prodotto può essere non banale

• G6PDH da Leuconostoc mesenteroides è poco costosa, accetta sia NAD+ che NADP+, ma G6P è costoso, deve essere preparato in situ (uso di esokinasi + ATP) o sostituito con ausiliari simili (gluc-6-solfato)

Alcol deidrogenasi

• l’equilibrio va spostato rimuovendo i prodotti o usando un eccesso di reagenti

• ultimamente ADH da Rhodococcus ruber usa i-PrOH (fino al 50%) come substrato

• ADH da lievito per NADH, ADH da Leuconostoc mesenteroides per NADPH

• TTN ancora un po’ bassini

Forma ossidata

• attenzione al potenziale redox

• LDH accetta solo NADH

ApplicazioniH

H

O O

H

H

O

O

O O

H

H

O OH

H

H

OH

O

O OH

HL-ADH

riciclo NADH

HL-ADH

riciclo NADH

HL-ADH

riciclo NADH

e.e. > 98%

e.e. > 98%

e.e. > 98%

Riduzioni con cellule intere

R1 R2

O

R1 R2

OH

• facile trattabilità, costo ridotto

• largo spettro di attività

• no aggiunta cofattori (riciclo interno, consumo Glu)

• combinano diversi enzimi

Lievito da panettieri (S. cerevisiae)

• basse produttività

• eventuale tossicità del substrato o prodotto

• purificazione difficoltosa

• diversi enzimi presenti: controllo reazioni collaterali

DHasi da lievito

Riduzione chetoni

Il lievito agisce secondo le regole di Prelog

riduzione beta-ketoesteri

Evidentemente agiscono contemporaneamente enzimi diversi

Inibizione selettivaSi va ad inibire l’enzima “D”

Diastereoselettività lievito

Diastereoselettività lievito

Deracemizzazione alcoliSi procede via stereoinversione, sfruttando i sistemi già presenti nel microorganismo.

R1 R2

OH

R1R2

OH

R1 R2

O

NAD(P)+

NAD(P)H

deidrogenasi enzima redox

La seconda reazione DEVE essere irreversibile

Deracemizzazione alcoli

Enoato reduttasiÈ noto che diversi generi di microorganismi (Clostridia, Proteus, Beauveria, Saccharomyces) sono capaci di ridurre doppi legami attivati con alte specificità.

Tale attività è associata ad una classe di enzimi (enoato reduttasi) coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi.

Pur essendo stati, tali enzimi, isolati e caratterizzati, si preferisce fare ricorso, per le biotrasformazioni, alle cellule intere, per evitare problemi di riciclo del cofattore e di stabilità all’ossigeno dell’enzima stesso.

La formale addizione di idrogeno avviene, solitamente, con stereochimica trans.

La scoperta di tale attività, nel lievito da panettiere, risale addirittura al 1934.

Substrati per lievitoVengono ridotti solo doppi legami C=C attivati dalla coniugazione con gruppi elettron-attrattori. Doppi legami isolati e tripli legami non vengono ridotti.

• acidi ed esteri α,β-insaturi. Gli esteri possono venire parallelamente idrolizzati.

• lattoni α,β-insaturi

• aldeidi α,β-insature. C’è la parallela riduzione del carbonile. Alternativa: alcoli allilici

• chetoni α,β-insaturi: destino simile alle aldeidi

• nitrocomposti α,β-insaturi

• 1,3-dieni attivati (coniugati): viene ridotto solo il doppio legame α,β

Spesso (ma non sempre) la stereochimica della riduzione è controllabile a partire dalla conformazione E o Z del substrato

Esempi

Esempi

Esempi

Processo Hoffman La-Roche

pH 8.0-9.0; 20°C

Fed-batch per evitare livelli tossici di oxoisoforone

Conv. 87%, resa 80%, selettività 92%, e.e. 97%

STY 2.8 g/(L d)

Scopo: produzione carotenoidi

OH

OH

zeaxantina: mais, zafferano, tuorlo d'uovo, retina oculare

Controllo reazioniLa cellula di lievito è un sistema multienzimatico: se più enzimi competono per lo stesso substrato, è necessario trovare un metodo di controllo cinetico.

Devo fare in modo che la concentrazione di substrati e prodotti rimanga piccola, di modo da non incorrere in fenomeni inibitori o in reazioni collaterali.

Extractive biocatalysisUso una resina apolare: substrato e prodotti si adsorbono su di essa mantenendo una loro (piccola) concentrazione in acqua determinata dal rispettivo coefficiente di partizione.

Anche il work-up è facile: basta filtrare le particelle di resina e poi “lavare via” il prodotto avvalendosi di un solvente organico

Esempio

EsempioO

OO

O

OOH

Processo Eli Lilly

Cellule intere di Zigosaccharomyces rouxii, pH 7.0, 33-35°CIl substrato ha un limite di tossicità di 6 g/L: usando una resina XAD-7, si hanno meno di 2 g/L in soluzione, pur avendo 40 g/L complessivamente.La resina ha log P < 2, non è tossica, non ha effetti denaturanti, e può essere facilmente riutilizzata.

Resa 96%, e.e. > 99.9%, purezza 95 %, STY 75 g / (L d)

O

OOH

O

O N

N

NH2

O

LY300164benzodiazepina

in test per trattamentosclerosi laterale amiotrofica