BIOCATALISI

A.A.

2008 -2009

Dr. Davide Tessaro

Lezione 4:Enzimi idrolitici, seconda parte

Gli antibiotici beta-lattamici

penicilline

cefalosporine

Sono dei battericidi (soprattutto Gram+)

Sono analoghi del dipeptide D-Ala-D-Ala, e si legano irreversibilmente (acilazione di una Ser) all’enzima che presiede al crosslinking dei peptidoglicani della parete cellulare.

Il principale meccanismo di resistenza a tali antibiotici è la produzione di beta-lattamasi (penicillasi)

La penicillina

Penicillina G

Scoperta del 1929 da Fleming

Viene prodotta da un particolare ceppo di Penicillum chrisogenum

Per limitarne la vulnerabilità ai ceppi resistenti si può agire sulla catena laterale, sostituendola con opportuni analoghi.

È allora necessario trovare un metodo selettivo per la rimozione di tale catena e l’ottenimento dell’acido 6-amminopenicillanico (6-APA).

6-APA: sintesi chimica (1970)

NH

OO

N

S

OOH

NH

OO

N

S

OO Si(CH3)3

ClSi(CH3)3

PCl5

N

ClO

N

S

OO Si(CH3)3

N

OO

N

S

OO Si(CH3)3

NH2

ON

S

OOH

O

O

piridina

-40°C

BuOHN,N-dimetilanilina

- 50°C

H2O

+

6-APA

6-APA: biocatalisi (1973)

NH

OO

N

S

OOH

NH2

ON

S

OOH

OH

O

+

6-APA

Penicillina amidasi

pH 8 (NH3), 30°C

Esempio: processo Unifar

Enzima: penicillina amidasi da E. coli immobilizzato su Eupergit-CDopo 800 cicli, l’enzima è attivo al 50% (60’ 120’)Conversione 98%, resa 86% (estrazione acido e cristallizzazione)Selettività >99%, purezza 99%Produzione 300 t/y, STY = 445 g/(L*d)

La cefalosporina

Cefalosporina C

Isolato dal fungo Cephalosporium acremonium, scoperto da Giovanni Brotzu (Cagliari)

Ora il fungo si chiama Acremonium chysogenum, e viene tuttora utilizzato (ceppi mutati) per la produzione di cefalosporina C.

La rimozione della catena laterale dà luogo al 7-ACA (acido 7-amminocefalosporanico)

Non esiste un enzima adatto a tale scopo: si può usare la procedura di deacilazione chimica

Prime evoluzioniSNH2

O

OH O

O

O

SNH2

O

OH O

7-ACA

7-ADCA

H2/Pd

Il 7-ACA può essere ridotto a dare il corrispondente derivato senza il gruppo acetossi: l’acido 7-amminodesacetossicefalosporanico, detto più semplicemente 7-ADCA.I suoi derivati risultarono adatti all’amministrazione orale.

L’ottenimento di 7-ACA per fermentazione continuò però ad essere costoso rispetto alla produzione di 6-APA: si cercò allora di individuare la relazione chimica tra i due composti.

Ring expansion

N

S

O

NH

O

OOH

O

O

NH

O N

S

O OH

NH

NH

O

Si(CH3)3Si(CH3)3 Piridina/HBr

Si trovò il modo di effettuare la conversione a partire dall’ossido della Pen-G

E’ essenziale l’uso di un gruppo protettore al carbossile.

Anche la cefalosporina finale può essere deacilata usando la procedura enzimatica.

Acilazione chimica

SNH2

O

OH O

SNH

O

OH O

O

NH2

Cl O

O

O

O

NH

O

OEt

K+

+

1) protezione

2) acilazione

3) deprotezione

7-ADCA

Cefalexina

L’acilazione chimica viene condotta a seguito di uno step di protezione e prima di uno step di deprotezione.

Vengono usati agenti aggressivi, solventi clorurati e condizioni anidre

La reazione è l’inverso dell’idrolisi enzimatica: non sarebbe possibile effettuare anche questa con una procedura biocatalitica?

Acilazione enzimatica

SNH2

O

OH O

NH2

O

X

NH2

O

NH

S

O

OH O

NH2

O

OH

7-ADCA

+

- X

+ H2O

+ H2O

-X

- 7-ADCA

Cefalexina

1. L’enzima deve avere selettività adatta;

2. Bisogna operare sotto controllo cinetico;

3. L’acilante deve essere attivato (estere, ammide)

4. Si opera a pH debolmente acido e T bassa per sopprimere le reazioni di idrolisi

Selettività PGA

Processi a confrontochimico chemo-enzimatico

10 passaggi;40 kg di effluenti per kg di prodotto;solventi clorurati, agenti sililanti, sottoprodotti da protezione e deprotezione

Coupling enzimatico

SNH2

O R3

OH O

NH2

O

NH

S

O R3

OH O

R1

NH2

O

R2

R1

+

Processo Chemferm (Gist-Brocades + DSM)

Enzima da E. coli immobilizzato covalentemente su un carrier a base di gelatina;

Si usa un eccesso di acilante, che viene riciclato

Resa >90%, selettività > 95%, e.e.> 99%

200 t/y

Alcuni antibiotici prodottiNH2

O

NH

S

O

OH O

NH2

O

NH

S

O

OH O

OH

NH2

O

NH

S

O Cl

OH O

NH2

O

NH

ON

S

OOH

NH2

O

NH

ON

S

OOH

OH

NH2

O

NH

O Cl

OH O

OH

O

NH

S

O

OH O

cefalexina cefaclor cefadoxil

ampicillina amoxicillina

loracarbef cefamandolo