Frammentazione del DNA Gli esperimenti si fanno in vitro in cellule che sono sincronizzate e vanno in apoptosi nello stesso momento in apoptosi. Ci sono metodiche che riescono a mettere in evidenza la frammentazione a livello di singole cellule: la frammentazione del Dna (prodotta da CAD attivate da caspasi) ha permesso di mettere a punto una tecnologia basata sul fatto che le terminazioni libere 3' possono essere substrato di un enzima, il TdT. Se si usa il TdT marcato...copiare slide

Il Kit pi semplice si puo fare su cellule poste su un vetrino.

Si possono vedere con l'utilizzo di altri coloranti che mettono in evidenza il Dna e la frammentazione. Con il metodo TUNEL si vedono cellule con frammentazione, a pi forte ingrademento si vedeono cellule positive. A pi forte ingrandimento usando altri sistemi di colorazione, al microscopio ottico, si notano cellule marcate.

Nelle cellule apoptotiche si puo mettere in evidenza la diminuzione del Dna a livello dei nuclei con la citometria di flusso: permette di esaminare un grande numero di cellule, misurazioni rapide e quantitative di paramtri multipli su singole cellule contemporaneamente ci sono cellule in sospensione o nuclei che sono costrette a passare in fila attraverso una canna di flusso emissione di luce che viene raccolta, filtrata e convertita ad una valore digitale su un computer. In immunologia si pu sfruttare questo sistema per raccogliere quelle cellule che hanno tutte la stessa caratteristica (metodo FACS). Si possono avere cellule non apoptoiche e andare a misurare la quantit di DNA, la colorazione del Dna non casuale, stechiometrica (tanto maggiore quanto pi dna c'): se il contenuto di DNA di queste cellule con la citometria di flusso si hanno dei picchi che corrispondono alla fase G1, S, G2... Quando si sottopongono le cellule a trattamenti che inducono l'apoptosi il Dna diminuisce e si ha un picco che compare prima di G1 (picco ipodiploide?).

Si possono ottenere informazioni sul: volume cellulare

dimensione forma ed omogeneit ottica

densit/granularit

distinzione tra cellule morte e vive

determinazione della ploidia: in cellule tumorali a volte si trovano dei tracciati anomali non corrispondente a mutlipli di n il grado di aneuploidia , in certi tumori, correlato con la prognosi

Le endonucleasi sono attivate dalle caspasi, che possono essere di vario tipo (14 membri); le caspasi 3 intervengono nella fase effettrice dell'apoptosi. Una metodica pu permettere di vedere se le caspasi sono attivate o no: si pu vedere il clivaggio di alcuni substrati, sistemi con inibitori delle casp marcati con fluorocromi oppureanticorpi reattivi con caspasi attivate.

Si pu mettere in evidenza il clivaggio del substrato PARP con metodi immunocitochimici.

Le caspasi non sono sempre attive. Normalmente si hanno le procaspasi inattive che si attivano quando sono clivate in due punti particolari: a livello della parte amminoterminale e carbossi terminale. Il frammento pi piccolo ruota accanto a quello pi grande. Si ottiene un tetramero. Da una molecola attivata si ottengono una serie di caspasi attive che determinano clivaggio delle proteine citosoliche, della lamina nucleare ecc.

Pere vedere se le caspasi sono attive si pu utilizzare un sistema di inibitori che si vanno a legare ai centri attivi (esposti solamente quando la caspasi attivata) delle caspasi, inibendoli. Gli inibitori si portano dietro delle molecole fluorescenti che mettono in evidenza gli inibitori. Si usa il FLICA che ha una parte che si va a legare al centro enzimatico.

Ogni sottofamiglia delle caspasi ha vari ruoli: caspasi 3 effettrici

casapai 8 e 9 attivatrici

caspasi che sono mediatrici della infiammazione

Mediatori dell'apoptosi Tre grandi classi di molecole: molecole che inducono l'apotposi perch si legano al loro recettore di membrana, l'apoptosi dovuta al legame con il recettori producendo variazioni del contenuto intracellulare

interazioni con il sistema immunitario: le cellule vanno incontro ad apotposi in seguito a cambiamenti del contenuto intracellulare indotti dall'interazioni con cellule citotossiche

condizioni avverse: ipertermia, ipotermia, ischemia, radiazioni, deprivazione di fattori di crescita (ad esempio androgeni nella prostata), farmaci, tossine, agenti chimici

Nella apoptosi c' una fase di esecuzioni in cui avvengono modificazioni morfologiche tipiche dovute ad eventi a cascata proteolitici e nucleolitici e una fase di induzione in cui si innesca il processo in conseguenza del recepimento di segnali extracellulari e segnali endogeni. La finalit dell'apoptosi predisporre l'eliminazione della cellula; questo deve impedire la fuoriuscita di materiale, c' l'attivazione di trans-glutaminasi che provocano la formazione di legami crociati che formano una rete che costringe la cellula a rimanere compatta ed impedire la fuoriuscita di materiale potenzialmente pro-infiammatorio. Gli stadi istologicamente visibili sono la fase 3 e 4.

Il processo apoptotico pu essere attivato da: via di trasduzione del seggnale

vie di danno cellulare ( radiacali,anosssia, calcio, perforine)

Danno al DNA (p53) in alcuni casi il danno al DNA pu essere compatibile con la vita della cellule. Esistono dei guardiani del genoma come p53 che in caso di danno cerca di far riparare il DNA (perch se il danno resta e coinvolge geni delle proliferazione pu essere trasmesso ad una progenie di cellule e dar luogo allo sviluppo di tumori); p53 blocca il cliclo cellulare dando tempo agli enzimi di riparazione di riparare il danno, ma se il danno non riparato induce la cellula in apoptosi. P53 uno degli oncosoppressori: molto spesso pu mutare oppure possono essere ereditate mutazioni che determinano una riduzione della protezione del genoma.

Danno della membrana (ceramide): le ceramidi sono molecole idrofobe che possono neosintetizzate oppure possono derivare da sfingolipidi di membrana che vengono idrolizzati da sfingomielinasi che si possono attivare e produrre le ceramidi. Se aumentano le ceramidi intracellulare queste avviano reazioni a cascata che determinano una serie di effetti biologici. Nell'apoptosi avviene un aumento consistente della concentrazione intracellulare di ceramidi. La produzione di ceramidi avviene per attivazione di una particolare sfingomielinasi acida che si attiva pH acido. L'inibizione delle produzione di ceramidi, in alcuni modelli cellulari in cui sono coinvolte le ceramidi nell'apoptosi, blocca l'innesco del processo apoptotico.

Le vie di induzione possono essere: Via recettoriale o estrinseca o extracellulare: stimoli che innescano vie di trasduzione del segnale comportando la soprressione o induzione dei programmi di morte (non detto che portino sempre ad apotposi). Vie di morte attivate dal legame di appropiati ligandi con recettori appartenenti alla superfamiglia dei TNFR (recettori del fattore di necrosi tumorale).

Via intrinseca: segnali intracelullari...slide

VIA ESTRINSECAL'interazione recettore ligando determina l'interazione di pi procaspasi con alcune proteine adattatrici. Il recettore FAS costituito da un dominio extracellulare per interazioni con ligando, un dominio trasnmentmbrana e un dominio di morte (DD) che organizzato in alfa eliche. Il fas presente sulla membrana di tutte le cellule. Quando si legano i ligandi avviene sempre la trimerizzazione del recettore che ha delle proteine adattatrici che interagiscono con le procascaspasi.

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Recettore del TNF Prodotto dai linfociti T e attiva i macrofagi in risposta ad un processo infettivo. Legando il recettore il TNFR1 il TNF pu avere diversi effetti, dipendono dal tipo di cellula e dal tipo di recettore. Il legame comporta l'attivazione di geni pro-infiammatori ed immunomodulatori in alcune cellule, mentre in altre induce apoptosi. Il TNF induce la trimerizzazione dei recettori ed anche in questo caso ci sono delle proteine adattrici che interagiscono con i DD e che reclutano la procascapasi 8.

Nel caso in cui TNF induce effetti infiammatori la proteina adattatrice non recluta la procaspasi 8 ma determina una cascata di chinasi che determina una attivazione di NfkB (in condizioni basali inattivato da IkB) sopravvivenza.

La fase di iniziazione avviene fino al reclutamento della caspasi 8. Nella fase di esecuzione si ha l'attivazione delle caspasi 3 che determina il clivaggio di substrati di morte e altre substrati. La via mitocondriale non separata dalla via estrinseca, le due vie convergono solamente nella fase di esecuzione, nella fase di iniziazione sono separate. Il mitocondrio sempre in qualche modo interessato, si attiva la caspasi 9 grazie a fattori che fuoriescono dal mitocondrio come il citocromo C; il processo mediato da una serie di fattori che hanno effetti contrapposti (pro- e anti-apoptotici).

VIA INTRINSECASi attiva la caspasi 9 che ha un dominio regolativo CARD (serie di alfa eliche) media interazioni proteina proteina riconoscendo domini simili CARD presenti su altre proteine. Il gene cruciale che attiva le caspasi APAF-1 che contiene un dominio CARD che pu interagire con il CARD della procaspasi 9. Affinch APAF-1 leghi la caspasi 9 deve avvenire un cambiamento di conformazione di APAF-1 grazie al citocromo c: si forma cos un complesso molecolare proteolitico che ha la forma di una ruota e viene detto apoptosoma. Se non ci fosse il citocromo C non si formerebbe l'apoptosoma. Inizialmente il citocromo c reclutato da APAF-1, successivamente APAF-1 lega la caspasi 9.

La regolazione affidata alla proteine della famiglia Bcl-2 che controllano il rilascio delle proteine mitocondriali come citocromo C: pro-apoptotiche: come BAX e BAK e BH13

antiapoptotiche: BCL-2 che d il nome alla famiglia e Bcl Xl prodotta dallo spilicing alternativo di Bcl X.

L'interazione tra queste proteine modula il processo.

Il mitocondrio pu essere influenzato nella sua funzione in due modi: si pu creare una transizione di permeabilit mitocondriali, con apertura di pori nella membrana interna, riduzione del potenziale transmembranario, arresto reazioni redox rigonfiamento

attraverso aumento della permeabilit della membrana esterna e rilascio di citocromo C solamente.

Esistono diverse teorie che spiegherebbero come Bcl2 svolgono i loro effetti. Secondo una teoria l'apotposi poteva essere indotta dalla MPT (transizione di permeabilit mitocondriale), ma recentemente si visto che non cos. Tuttavia ci sono forti prove che suggeriscono l'iniziale coinvolgimento di canali mitocondriali indotti dall'apoptosi (canali MAC indotti sulla membrana mit. Esterna).