Saggi per la determinazione della

concentrazione delle proteine

Nicola Franceschini

Facoltà di Biotecnologie

aa 2009-2010

Determinazione Quantitativa delle Proteine

• Nessun metodo soddisfa pienamente la necessità di determinare la concentrazione delle proteine in soluzione di uno specifico campione

• La scelta di un metodo dipende dalla natura della proteina, la natura degli altri componenti presenti nel campione, la velocità, l’accuratezza e la sensibilità del metodo

Metodi più comuni per la

Determinazione delle Proteine• Analisi gravimetrica

• Test Biureto

• Saggio Folin-Ciocalteau (Lowry)

• Saggio dell’acido Bicinconinico (BCA)• Saggio dell’acido Bicinconinico (BCA)

• Saggio del Dye-Binding (Bradford)

• Assorbimento nell’Ultravioletto

• Saggio Kieldhal

Metodo gravimetrico

• Si basa sulla pesata di una determinata

quantità di proteina allo stato liofilizzato in

un opportuno volume di acqua o tampone

• Tra le più precise delle tecniche richiede • Tra le più precise delle tecniche richiede

grandi quantità di proteina

Test Biureto

Catena peptidica Complesso Biureto (color porpora)

• Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.

• Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.

• Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.

• Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.

• Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.

Test Biureto

• Riproducibile

• Poche sostanze interferenti

(ammonio solfato è uno di questi)

• Minori deviazioni che con il Lowry o i metodi ultravioletti

• Richiede grandi quantità di proteine (1-20mg)

• Bassa sensibilità

Test Biureto

1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima delle misure.

2. Diluire il campione con tampone a una concentrazione di 1-20 mg/ml . Aggiungere 1 ml a ogni provetta. Preparare I campioni in duplicato.

3. Preparare una provetta per il bianco con 1 ml di tampone.3. Preparare una provetta per il bianco con 1 ml di tampone.

4. Preparare degli standard partendo da una soluzione 10 mg/ml di albumina sierica bovina. Gli standards devono coprire l’intervallo da 1 a 10 mg di proteine.

5. Aggiungere 9 ml di reagente Biureto a ogni provetta, agitare e lasciare 20 min.

6. Leggere a 550 nm.

Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)

•Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.

•Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.

•Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

•Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).

Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)• Ampio intervallo di sensibilità

• Può essere effettuato a temperatura ambiente

• 10-20 volte più sensibile che le misure UV

• Può essere realizzato su piastre multiwell

• Molte sostanze interferiscono con il saggio

(acidi forti, solfato di ammonio)

• Necessita di molto tempo per la realizzazione

• Il saggio è sensibile alla luce

• L’intensità del cromoforo varia con il tipo di proteina

Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)1. Aggiungere in provetta campioni contenenti fino a 100 µg di

proteina.

2. Portare le provette a un volume di 1 mL totale con acqua.

3. Preparare la miscela di saggio e diluire il reagente Folin-Ciocalteu .

4. A ogni provetta aggiungere 5 mL di miscela di saggio e agitare con vortex.

5. Incubare le provette a temperatura ambiente per 10 min.

6. Aggiungere 0.5 mL di Folin-Ciocalteu, agitare immediatamente.

7. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.

8. Agitare le provette, azzerare lo spettrofotometro con il bianco e misurare l’assorbanza a 500-750 nm.

Saggio acido Bicinconinico (BCA )

• P.K. Smith et al. (1985) Anal. Biochem. 150: 76.

• K. J. Wiechelman et al. (1988) Anal. Biochem. 175: 231

Saggio acido Bicinconinico (BCA)

• Molto sensibile e rapido se si usano alte temperature

• Compatibile con molti detergenti

• Il reagente è stabile • Il reagente è stabile

• Piccole variazioni tra proteine diverse

• Ampio e lineare intervallo di lavoro

• La reazione non va a completamento se condotta a temperatura ambiente

Saggio acido Bicinconinico (BCA)

1. Preparare la quantità necessaria di 1 volume di solfato di rame a 50 volumi di una soluzione di acido bicinconinico.

2. Prepare un set di provette contenenti il campione e albumina sierica bovina nel range da 0 a 100 microgrammi. Ogni provetta deve contenere un volume totale di 0.1 mL.

3. Aggiungere 2.0 mL del reagente in ogni provetta e agitare.

4. Incubare le provette a 60oC per 15 min.

5. Raffreddare le provette a temperatura ambiente e misurare l’assorbanza a 562 nm.

Saggio Dye-Binding (Bradford)• CBBG risponde soprattutto alle arginine

(otto volte che gli altri residui)

• Per proteine ricche di arginina è opportuno usare

• Uno specifico standard

• CBBG si lega a questi residui nella forma anionica

Assorbimento a 595 nm (blue)

• Il colorante libero in soluzione è nella forma

• cationica (blu)

Assorbimento massimo a 470 nm (rosso).

• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram

quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.

• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

Assorbimento massimo a 470 nm (rosso).

Saggio Dye-Binding (Bradford)

• Veloce ed economico

• Altamente specifico per le proteine

• Molto sensibile [1-20 µg (micro saggio) 20-200 µg (macro saggio)]

• Compatibile con diverse sostanze

• Il colorante complessato si forma in • Il colorante complessato si forma in circa 15 min ed è stabile per circa 1 ora

• Curva standard non-lineare su un ampio intervallo di concentrazioni

• Risposta variabile per proteine diverse, quindi la scelta di uno standard è molto importante

Saggio proteine BioRad

• Dopo 10 minuti, l’assorbanza può essere letta a 595 nm.

L’assorbanza è stabile per un’ora.

Saggio Dye-Binding (Bradford)

• Gli spettri di assorbimento anionico e cationico del colorante si sovrappongono.

• Questo determina una curva standard non lineare, in realtà è lineare su piccoli intervalli di concentrazione.

• Se il campione contiene più di 20 microgrammi, viene fuori una curva di secondo ordine che fitta meglio che la curva lineare.

Saggio Dye-Binding (Bradford)

1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima dell’uso

2. Diluire i campioni con tampone a una concentrazione di 1-20 microgrammi/ul

3. Preparare gli standards contenenti 1-20 microgrammi proteina (albumina o gamma globuline) in un volume di 1000 µl (albumina o gamma globuline) in un volume di 1000 µl

4. Preparare I campioni sconosciuti da misurare da 1 a 20 microgrammi di proteina per provetta .

5. Aggiungere 200 ul di reagente Bradford e complementare a 1000 ul con acqua. Mescolare con forza e incubare 10 minuti a temperatura ambiente .

6. Misurare l’assorbimento a 595.

Assorbimento ultravioletto 280 nm

• Può rappresentare un’ottima tecnica quando non si ha alcuna idea della concentrazione di un campione che deve essere assolutamente recuperato.

• Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e sensibili

• La detrminazione si basa sull’assorbimento specifico degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano

• La detrminazione si basa sull’assorbimento specifico degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano

• La misura è soggetta a interferenza da altri componenti cellulari e in particolare acidi nucleici

• Il metodo non è molto sensibile e presuppone l’uso di cuvette di quarzo

• Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e la misura è molto rapida.

Ultraviolet Absorbance (pro e contro)

• Vantaggi

• Veloce

• Recupero campione

• Utile per fare screening di concentrazione

• Svantaggio• Svantaggio

• Sensibile alla presenza contaminati come Sali e altre molecole biologiche

• Essendo varia la composizione in aminoacidi elle proteine è difficile la scelta di uno standard

• L’assorbanza è fortemente influenzata da pH e forza ionica della soluzione.

Assorbimento Ultravioletto

Procedura

1. Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone

2. Misurare l’assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo

3. Cambiare lunghezza d’onda a 260 nm, far lo zero con acqua o tampone

4. Misurare l’assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo

5. Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione proteica

[Proteina] (mg/mL) = 1.55*A280 – 0.76*A260

Metodo Kieldhal

• (1) Digestione

• + H2SO4 concentrato

• + catalizzatore

• azoto convertito in ione ammonio.

• (2) Neutralizzare con NaOH per ottenere NH3

• (3) distillare NH3 e intrappolare in acido borico.• (3) distillare NH3 e intrappolare in acido borico.

• (4) Titolare con acido cloridrico.

• Calcolo:

• Grammi azoto/ grammo di campione =

• *(ml di campione - ml di bianco) × N acido × 0.014g/meq

peso del campione

• * ml di acido cloridrico richiesti per titolare il campione.

Metodo Kjeldhal

• svantaggi: non tutto l’azoto viene dalle proteine.

• Purine

• Pirimidine DNA, RNA, ecc.

• Urea

• Molti tessuti vegetali contengono > 50% N

non proteico

• % N × 6.25 = % Proteina

Note

• Usare vetreria pulita

• Usare cuvette pulite (in questo caso si usano provette in policarbonato usa e getta)

• I saggi proteici sono influenzati fortemente dalla composizione del campione (es. Detergenti, Sali ecc.) composizione del campione (es. Detergenti, Sali ecc.)

• Accertarsi del funzionamento dello spettrofotometro e accenderlo 20 minuti prima di iniziare le misure

Note

• Le curve standard vanno eseguite con le proteine adeguate

• I valori calcolati per il campione devono stare sempre all’interno di quelli ella curva standard

• Controllare la linearita’ della risposta delle proteine facendo delle curve di diluizione facendo delle curve di diluizione

• Eseguire sempre un bianco con acqua o tampone usato per la misura

• Mettere la concentrazione proteica sull’asse y per avere una stima diretta della concentrazione proteica