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Assorbimento dopo colorazioneal Fast-green di celluledella caliptra di Allium cepalocalizzate in differenti regioniistologicheSergio Sani a & Agostino Stefani aa Istituto di Botanica dell'Università di PisaPublished online: 14 Sep 2009.

To cite this article: Sergio Sani & Agostino Stefani (1977) Assorbimento dopocolorazione al Fast-green di cellule della caliptra di Allium cepa localizzate indifferenti regioni istologiche, Giornale botanico italiano: Official Journal of theSocieta Botanica Italiana, 111:1-2, 91-99, DOI: 10.1080/11263507709426576

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Giorn. Bot. Ital., 111: 91-99, 1977

Assorbimento dopo colorazione a1 Fast-green di cellule della caliptra di Allium cepa localizzate in differenti regioni istologiche

SERGIO SANI c AGOSTINO STEFAN1 Istituto di Botanic3 dell'Universiti di Pisa

Ricevxrto il 13 Alarzo 197G Accettato il 2 Novembre 197G

ABSTRACT. - Fast-green absorption of cells localized in different regions of AIlixrm cepa root cap. - The nuclear and cytoplasmic protein content of two cell population (C2 = columella cells; P2 = peripheral cells) has been determined by Barr and Stroud cytophotometer after Fast-green staining (after DNA extraction and without DNA extraction). The collected data seem indicate that: 1) histone content is higher in nuclei of C2 cells than in nuclei of P2 ones; 2) acid proteins content is higher in nuclei of P2 cells than in those of C2 ones; 3) the cytoplasmic proteins of the two cell populations arc quite different in their Fast-green reactivity.

INTRODUZIONE

L'eterogeneiti della popolazione cellulare della caliptra 6 stata precedente- mente dirnostrata con tecniche diverse. Alcuni dat i della letteratura indicano infatti chc durante la differenziazione delle cellule della caliptra a w e n g o n o dei carnbia- ment i ultrastrutturali, (CLOWES e JUNIPER, 1964; JUSIPER e BARLOW, 1969; JUNIPER c FRENCH, 1970; STEFANI et al., in preparazione), mentre altri, sulla base di indagini citochimiche (SWIFT, 1950; JENSEN, 1958; CLOWES, 1968; STEFANI et al., i n preparazione) o autoradiografiche (HIMES, 1966; BARLOW, 1970, 1975), met tono in evidenza differenze anche in regioni istologiche apparente- mente omogenee.

Nella presente nota vengono riportati i risultati raccolti i n u n o s tudio citofo- tornetrico delle proteine cellulari e nucleari dopo colorazione a1 Fast-green allo scopo di caratterizzare ulteriorrnente alcuni tipi cellulari della caliptra.

hlATERIALI E hlETODI

Bulbi di Allizriiz cepa cv. fiorentina sono stati messi a gcrmogliare su recipienti di vctro, contenenti acqua, a temperatura ambiente. Le radici crcsciute da detti bulbi sono state fissate, alla lunghezza approssimativa di 2 cm, in formalina neutra a1 10% per tre ore e lavate per tutta la notte in acqua corrente.

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Alcuni apici sono stati inclusi in paraffna e sezionati longitudinalmente a 10 Itm di spessore.

Sulle sezioni longitudinali mediane t stato eseguito lo studio della morfologia cellulare.

Come 6 noto nella caliptra si possono riconoscere due regioni istologiche ben distinte: una centrale, la columclla, ed una pcrifcrica chc costituiscc le fiancate della caliptra. Le ccllule dclla columella, di forma irregolarc ma tcndenzialmente ovoidale, sono caratterizzate dalla presenza di numerosi granuli d’amido distribuiti in tutto il citoplasma (cellule vicino alle iniziali) o raggruppati a1 polo distale della cellula (cellule pib periferiche). Come conseguenza il nucleo, da una posizione centrale, viene spostato gradatamente verso un polo dclla cellula (Fig. 2).

Nella rcgione periferica Ie ccllulc sono rettangolari, molto allungate, con un nu- Cleo piccolo addossato ad una paretc longitudinale, in posizione di equidistanza dai poli della cellula (Fig. 3).

Lo studio delle sezioni longitudinali consente di suddividere la columella e le fiancate della caliptra in pih zone: nella presente nota ne sono state considerate tre, sia nella columella (Cl , C2, C3) che nclle fiancate (Pl, P2, P3; P = perifcrichc), pro- ccdcndo dall’interno verso l’esterno (Fig. 1).

Sulle sczioni sono stati misurati i diametri dei nuclei di ambedue i tipi cellulari, i diametri delle cellule della columella ed i lati delle cellule delle fiancate.

La superficie dei nuclei e delle cellule t: stata calcolata assimilando la loro mor- fologia, a seconda dei casi, a cerchi, ellissi o rettangoli.

Altri apici sono stati schiacciati dopo digestione in pectinasi (5%, p H 4, 40 “C) pcr un’ora. La tecnica dello schiacciamcnto i: stata impicgata per ottenere ccllule isolate su cui cffettuarc la misura dell’assorbimento a1 Fast-green; misura non effcttuabile su sezioni. I n un primo esperimento gli strisci degli apici radicali sono stati colorati in una soluzione di Fast-green (0,195) a valori di p1-I decrescenti da 8 a 2, dopo aver estratto il DNA con il metodo di ALERT e GESCIIWIND (1953). I n un second0 espe- rimento gli apici, prepsrati come sopra, sono stati colorati a1 Fast-green agli stessi valori di p1-I ma senza estrazione dcl DNA.

L‘assorbimento 2: stato misurato con il citofotometro di Deely, (microdensito- metro integratore tip0 Gn. 2 prodotto dalla Barr e Stroud, Glasgow). Le misure sono state cffettuate a 635 mp usando un obbiettivo 4 5 x .

Sono stati analizzati tre apici in ognuno dei due esperimcnti. In ogni apicc sono state misuratc trcnta cellule dclle zone C2 e P2 (Fig. 1 ) con i rispettivi nuclei. Sia nell’uno che nell’altro esperimento I’assorbimento ai diversi valori di p H i: stato misu- rato semprc s u l k stesse cellule. Cib i: stato possibile mappando Ic cellule su microfote grafie. L‘assorbimento citoplasmatico t stato considcrato come differenza tra l’assor- bimcnto dclla cellula intera e quell0 del suo nucleo.

Fig. 1 - Sczione longitudinale della caliptra di Allirrtn cepa.

Fig. 2 - Cellule della colurnella (zona C2) della caliptra di Allitrtn cepa contenenti granuli - Longitudinal section of root cap of Alliirm cepa.

d’arnido. - Colurnella cells (C2) with starch granules.

Fig. 3 - Cellule laterali (zona P2) della caliptra di Nlititn cepa. - Peripheral cells (PZ) of root cap of Alfiiitn cepa.

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RISULTATI E DISCUSSIONE

Dit?ierisioni delle cellule e dei nrrclei. - Nella tabella 1 sono riportate 1c super- fici medie dci nuclei e delle cellule situate nelle zone considerate. Dai dati riportati nella tabclla risulta chc le dimensioni delle cellule aumentano dall’intcrno verso I’estcrno della caliptra: quclle della columella hanno un aumento del 146%, pas- sando dalla zona C1 alla zona C3, mcntrc qucllc delle fiancate aumentano solo del 42%. I nuclei dei due tipi cellulari hanno invece un comportamento diverso: quelli della columella hanno &a superficie costante nelle zone CI e C2 cd una supcrficie minore nella regione C3; i nuclei delle fiancate hanno una superficie costante nclle zonc P1 e P2 ed una superficie maggiore in P3 (Tab. 1). Ncll’ambito dclle due regioni, colurnella e zona periferica, 1e differenze non sono perb mai molto vistosc, contrariamente a quanto avviene per la supcrficie cellulare.

TABELLA 1 Siiperficie media, in (pnz)’, delle cellrile della coluniella (Cl , C2, C3), delle cellule periferiche ( P l , P2, P 3 ) e dei relatioi tixiclei. Alean surface, in (pm)’, of coliimella cells (Cl , C2, C3) and peripheral cells ( P l , P2, P 3 ) and relative nuclei.

Tipo di cellula Cellula Nuclco

CI CZ c 3

PI P2 P3

797.30 f 73.86 1329.41 & 116.21 1965.50 2 125.65

1365.07 -c 105.94 169s .a -L 174.51 1943.37 & 131.39

134.78 I 9.31 115.19 -c 6.13 116.83 2 5.13

81.81 = 2.51 83.76 f 3.22

IM.Sl f 6.27

Assorbimeiito dopo esfruziorie del DNA. - Come dctto in materiali e mctodi, I’assorbimento dopo colorazione a1 Past-green ai vari pH i: stato considerato solo nelle cellulc delle zone C2 e P2 pcrchC pih facilrnente riconoscibili sugli strisci.

Se si accctta che l’assorbimento, dopo colorazione a1 Fast-green ad un determi- nato valore di pH, rappresenti una stima del contenuto in proteine totali reattive a quel pH (ALFERT e GESCHWIND, 1953), i dati riportati nella prcsente nota caratterizzano, come contenuto in proteinc colorabili a1 Past-green, le cellule cd i nuclei di due regioni istologiche della caliptra.

Nella tabclla 2 sono riportate le medie di assorbimento dopo colorazionc a1 Fast-green delle cellule C2 e P2, colorate dopo estrazione del DNA (primo espe- rimcnto). Ogni media i: stata considerata sulle misure effcttuatc su tre apici (trcnta cellulc per apice). Nella tabclla si pub notare come Ic cellule P2 evidenzino un pih basso assorbimento nucleare delle cellule C2. La pih alta differenza si riscontra a pH 8: 30%; talc differcnza dovrebbe esscre irnputabile solo agli istoni. Si sa infatti dalla letteratura chc nella ccllula non esistono altrc proteine, in entit;

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determinabile, che siano reattive ad un pH cosi elevato (ALFERT e GESCHWIND, 1953).

In Alliiitn cepa la caliptra 2 composta prevalentemente da cellule con un con- tenuto nucleare in DNA 2C (carattetistico di un nucleo diploide in posizione pre-

TABELLA 2 Aledie di assorbimento dopo colorazione a1 Fast-green (dopo estraziorre del D N A ) a dilfererrti valori d i pH di cellrile dd la coItir?zella (C2) e di cellrile laterali (P2) della caliptra di Alliunr cepa. Ogni cifra rappresenta la media delrassorbimento di 90 cellule. Alean Fast-green absorption (after extractioir of DNA) at difierent pH valrres of colrir~~ella cells (C2) and peripheral cells (P2) of root cap of Allirrm cepa. Each figure represents the tnear: tialrie of 90 cells.

c2 P2

nucleo cellula citophsmcl nucleo celluls citopl3srncl PI1

8 0.54 f 0.02 0.54 5 0.02 0 0.37 5 0.01 0.37 f 0.01 0 7 0.4s 5 0.02 0.45 f 0.02 0 0.37 + 0.01 0.37 t 0.01 0 6 0.71 5 0.01 0.71 -c 0.0) 0 0.56 5 0.02 0.56 -L 0.02 0 5 1.02 5 0.01 1.02 * 0.0) 0 0.76 f 0.02 0.76 f 0.02 0 4 1.43 t 0.05 4.22 5 0.19 2.59 kO.12 1.28 f 0.05 5.63 50.22 4.35 r0.14 3 2.2d 5 0.09 5.35 rt 0.10 3.10 = 0.13 2.15 5 0.06 7.64 f 0.22 5.49 f 0.13 .. 2.63 f 0.11 6.92 k 0.23 4.29 f 0.18 2.45 = 0.05 9.22 5 0.25 6.77 & 0.16 7

sintetica) e solo raramente, in periferia, da cellule che raggiungono il contenuto in DNA 4C (tipico di un nucleo diploide in posizione post-sintetica) (AVANZI e CREhroNINr, 1967). Sulla base di queste conoscenze e dei dati riportati n e h ta- bella 2 sembra quindi possibile concludere che i nuclei dellc cellule della columella (C2), pur avendo lo stesso contenuto in DNA dei nuclei delle ccllule P2, sono caratterizzati da un maggior contenuto istonico. Situazione che potrebbe indicare che nelle cellule C2 una maggiore porzione del genoma 2 complessata con gli istoni e quindi meno attiva nella trascrizione (BONNEK, 1965; ALLFKEY, LITTAU e MIRSKY, 1963; ALLFREY e MIRSKY, 1964).

Senza escludere questa ipotesi i: perb necessario tenere presente che la reatti- vitd degli istoni a1 Fast-green 2 influenzata da alcune trasformazioni della molecola stessa quali l’acetilazione e la metilazione (BLOCII e HEW, 1960); alterazioni che assumono un particolare significato in quanto implicate nei passi metabolici che precedono (acetilazionc) o che seguono (metilazione) il process0 d e b trascrizione genica (POCO, ALLFREY e MIRSKY, 1966; ALLFREY, POCO, LITTAU, GERSHEY e MIRSKY, 1968).

Non 2 quindi possibile stabilire se i nuclei delle cellule P2 diano una minore reazione a1 Fast-green per un contenuto istonico diverso quantitativamente o qua- litativamente rispetto ai nuclei delle cellule C2. Le due ipotesi, d’altra parte, non si escludono a vicenda ed ambedue sembrano indicare che i nuclei delle cellule

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P2 sono implicati in un process0 di rrascrizione pih diffuso c/o pih intenso dei nuclei dclle cellule C2. A questo riguardo pub avert un significato il fatto chc (nell’arnbito dclla caliptra) sia stata notata la pih alta incorporazionc di uridina proprio nelle cellule estcrne delle fiancate (AVANZI et al., dati non pubblicati).

TADELLA 3 Aledie d i assorbirnento dopo colorazione a1 Fast-green (senza estrazione del D N A ) a differenti valori di pH di cellule della colirniella (C2) e di cellrrle laterali ( P 2 ) della caliptrn di Allium cepa. Ogni cifra rappresenta la media dell’assorbinzento di 90 cellrile. Alean Fast-green absorption (without D N A extraction) at different p1-I valties of colirniella cells (C2) and peripheral cells (P2) o f root cap of Alliiini cepa. Each figure represents the mean valire of 30 cells.

c2 P2 pH --

nucleo ccI!uIa citoplasma nucleo cclluh citop13sma

5 1.82 t 0.06 3 3 1 5 0.16 1.99 t 0.10 1.14 t 0.04 2.43 f 0.11 1.29 = 0.07 4 3.91 t 0.09 8.77 t 0.20 5.25 -c 0.14 2.31 t 0.07 5.79 k 0.17 3.45 = 0.11 3 4.35 + 0.10 10.30 2 0.24 5.95 -c 0.17 3.11 -L 0.07 7.81 5 0.18 1.71) 2 0.12 2 5.08 -L 0.11 11.88 -c 0.29 6.80 -L 0.20 3.77 t 0.0s 9.77 f 0.21 6.00 0.14

Assorbimetzto sema preveritiva estrariotze del DNA. - Nella tabclla 3 sono riportate 1e medie di assorbimento dopo colorazione a1 Fast-green dei due tipi cellulari studiati (C2 e P2), colorati senza estrazione del DNA (2” esperimento). In queste condizioni sperimentali non E determinabile alcun assorbimento, nE a livello nucleare nC a livello citoplasmatico, in entrarnbi i tipi cellulari a valori di pH superiori a 5. Dai dati riportati nella tabella risulta che l’assorbirnento dclle cellule C2 E vistosarnente maggiorc di quello delle cellule P2 ad ogni valore di pH e cib sia a livello di citoplasma che a livello di nucleo.

Coticlrtsiorii per i rzrtclei. - I1 minor contenuto, presentato dai nuclei delle cellule P2, di protcine colorabili dopo estrazione del DNA (tabella 2 ) e senza estrazione del DNA (tabella 3), a bassi valori di pH della soluzione del Fast-green (proteine acidc) potrebbe spiegare il fatto che i nuclei delle cellule P2 hanno un volume vistosamente pih piccolo dei nuclei delle cellule C2 (tabella 1). A questo proposito vanno sottolineati due aspetti:

a) la differenza rilevabile a livello di volume (oltre il 40%) it paragonabile a quella determinnta nel contenuto di proteinc reattive a pH 5 scnza estrazione del DNA. Se si considcrano invecc le proteine reattivc ai pH minori, la diffcrcnza tra le due popolazioni nucleari si attcnua gradatamente fino a sccndere a1 24% a pH 2, valore di pH a cui si ha una stima delle proteinc totali (ALFERT e GESCH- WIND, 1953). Cib significa che i nuclei dclle cellule delle fiancate hanno, sul con- tenuto in proteine totali per nucleo, una maggiore pcrcentuale di proteine reattive a bassi valori di pH. Proteine che hanno una scarsa influenza sul volume nucleare;

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b ) per quanto riguarda le protcinc determinate dopo cstrazione dcl DNA, ncl passarc da p H 8 a pH 2 l’assorbimento aumenta quasi 5 volte nei nuclei delle cellule C2 e quasi 7 volte nei nuclei delle cellule P2. CioE la differcnza fra i due gruppi di ccllulc si attcnua col diminuirc dcl pH.

Quanto esposto nei punti a ) e b ) porta a concluderc che lo spettro dcl con- tenuto in protcinc 6 chiaramente diverso nelle due popolazioni nucleari.

Coiiclrisiorii per i citoplasmi. - Prcndcndo in considcrazione il citoplasma si pub notare qusnto segue:

n ) a pH 5 si ha reazione a1 Fast-green solo nelle cellulc in cui non E stato estratto il DNA;

6) confrontando l’assorbimento dclle cellule nellc quali 6 stato estratto il DNA (tab. 2), con I’assorbimento delle cellule non sottoposte alla estrazione del DNA con acido tricloroacetico (TCA), sccondo la tecnica di ALFERT e GESCH- WIND ( 1953), emerge chc l’idrolisi in TCA diminuisce l’assorbimento cellulare ad ogni valore di pH. Prescindendo dalla reazione del nucleo ncl quale i due cspcrimcnti dovrebbcro mettere in evidenza due gruppi distinti di proteine (asso- ciate a1 DNA nel 1” esperimento, non associate nel 2O espcrimento) 6 evidente che il citoplasma d i un assorbimento maggiore nelle ccllule in cui non 6 stato estratto il DNA. Cib risulta soprattutto nellc ccllulc C2.

Le differenze riportate ai punti a) e b) sembrano suggerire l’ipotesi che una ccrta cntith di protcine sia labile all’idrolisi con ‘1’CA c chc talc enti t i sia pi& elevata nel citoplasma delle cellule C2.

Ringruziufnefili - Gli autori ringraziano vivamcnlc la Prof. Silvana Avanzi pcr I’incoragpiamenlo c per 13 revisionc crilica del mmoscritto. Ringrariano inoltre la Signora Clelia Brunori ed i l Signor Enrico Ginldi per 13 efficienlissirna assislenn tecnica.

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RIASSUNTO

B stata dcterrninata, per 'mezzo di misure citofotometriche, dopo colorazione 31 Fast-green (con estrazione e senza estrazionc di DNA), la quantitj. di proteine nucleari e citoplasmatiche di due popolazioni ccllulari della caliptra (C2=cellule della colurnella c P2=cellulc pcriferiche). I risultati sembrano indicare chc: 1 ) i nuclei delle cellule C2 evidenziano un maggior contenuto istonico di quelli delle cellule P2; 2) i nuclei dclle ccllule P2 sono piG'ricchi di proteine forte- mente acide dci nuclei delle cellule C2; 3) anche a livello citoplasrnatico lo spettro dcl contcnuto in proteine 5 diverso nei due tipi ccllulari considerati.

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