Area sperimentale Risultati · Il DNA totale è stato estratto da 5 g di suolo con un protocollo...
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L’IMPORTANZA DEL METABOLISMO MICROBICO NELLA
DEFINIZIONE DI “TERROIR”: IL POTENZIALE RUOLO DELLO ZOLFO
PremessaPremessa
Il concetto di “terroir” e noto soprattutto in viticoltura per indicare un’area ben delimitata in cui le condizioni naturali, il suolo, le attivita umane ed il clima interagiscono tra loro permettendo la
realizzazione di un prodotto specifico e identificabile con quel territorio. Tra i diversi parametri in gioco, il suolo sta assumendo sempre maggiore importanza e considerazione in quanto
parametro in grado di influenzare in modo significativo la qualita del vino non solo a livello di distretto produttivo ma anche a livello aziendale o di singolo vigneto. Tuttavia, nonostante la
maggior parte dei processi che determinano la qualita del suolo siano regolati dalle comunita microbiche del suolo, il potenziale ruolo dei microrganismi nella definizione del terroir e ancora
per lo piu sconosciuta.
BRO11BRO11 BRO12BRO12
pH 8.1 8.4
K tot (ppm) 109109 39
N tot (‰) 0,660,66 0,24
C org (%) 0,650,65 0,23
O.M. (%) 1,131,13 0,39
Total carbonates 15,6 6,4
Clay % 20 12
Silt % 28 18
Sand % 52 72
Texture SCL SL
C/N ratio 9,9 9,6
CEC (meq/100g) 10,7 7,7
Calcium_exc (meq/100g) 9,8 7,3
Magnesium_exc
(meq/100g) 0,53 0,25
Sodium_exc (meq/100g) 0,04 0,04
Potassium_exc (meq/100g) 0,28 0,11
EC 0,124 0,4730,473
• Wine: sensory
evaluation
• Grape: sugar
content
• Grape: sugar
accumulation
rate
• Grape: mean
berry weight
• Grape:
extractable polyphenol
index (EPI)
Vine Performance of Sangiovese (VPS)Vine Performance of Sangiovese (VPS)
BRO 11
BRO 12
Agricoltura di precisione e produzione di vino nella regione del Chianti
Soil morphology: Pliocenic marine sands and conglomerates. Substrate: Marine deposits, alternations of clays, silts, sands and
conglomerates. Period: Pliocene . Soil description: Inceptisols (USDA); weakly developed, not well
structured with sandy topsoil. The content of stones/rocks can vary from5% to 60% with coarse gravels. Drainage is almost always too high.
Materiali e MetodiMateriali e Metodi
Area sperimentaleArea sperimentale
• Campionamento di suolo ed estrazione del DNA: due vigneti adiacenti (BRO11 and BRO12) di Sangiovese sono stati individuati su suoli
simili nel cuore del Chianti Classico (Brolio, SI). Tre repliche di suolo sono state prelevate ad una profondità di 0-30cm, vagliati a 2mm e conservati a -30°C. Il DNA totale è stato estratto da 5 g di suolo con un protocollo manuale (Richard et al., 2001).
• Analis Geochip: il DNA genomico totale è stato trattato preliminarmente mediante TempliPhi kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ) per 6 ore a 30°C. Il DNA ottenuto è stato fatto ibridare su Geochip 3.0 (He et al., 2010). Le ibridazioni sono state condotte a 45°C per 10 ore con 50%
di formammide mediante un TECAN HS4800. Gli array ottenuti sono stati scansionati mediante il sistema ScanArray 5000 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). E’ stata applicata una soglia di segnale pari a 2000, e solo spots con un rapporto segnale-rumore [SNR = (signal intensity-
background intensity)/standard deviation of the background] maggiori di 2.0 sono stati considerati per le analisi.• Amplificazione e pirosequenziamento dei geni 16S rRNA e 18S rRNA: per il 454 pyrosequencing del gene 18S rRNA, sono stati utilizzati
i primer universali FR1 e FF390, che amplificano una regione di 350 bp che include le regioni ipervariabili V7 e V8 del gene SSU rRNA(Prévost-Bouré et al., 2011). Per il sequenziamento del gene 16S rRNA sono stati utilizzati i primer UNI515F and UNI806R (regione V4). Il pirosequenziamento è stato eseguito dalla ditta Macrogen inc. (Seoul, Korea) mediante GS FLX titanium (Roche, Basel, Switzerland).
L’analisi delle sequenze è statoeffettuato mediante Qiime 1.2.1 con interfaccia Galaxy (Goecks et al., 2010). Tutti I barcode, linker e tags sono stati rimossi attraverso il tool Denoiser 0.91 e clusterizzati al 97% di similarità mediante UCLUST 1.2.21 algorithm.
• Analisi enzimatiche: le attività enzimatiche arilsulfatasi (aryS), β-glucosidasi (gluc), leucina-aminopeptidasi (leu), fosfomonoesterasi (alkP), fosfodiesterasi (bis-P) and pirofosfatase (pyro) sono state determinate mediante una procedura di estrazione/desorbimento in micropiastra,
utilizzando analoghi fluorescenti dei substrati di ciascun enzima (Fornasier et al., 2007).
References• Fornasier, F. and A. Margon. 2007. Bovine serum albumin and Triton X-100 greatly increase phosphomonoesterases and arylsulphatase extraction yield from soil. Soil Biol. Biochem. 39: 2682-2684
• Goecks J, Nekrutenko A, Taylor J. 2010. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11:13
• He ZL, Deng Y, Nostrand JD, Tu Q, Xu M, Hemme CL, Li X, Wu L, Gentry TJ,Yin Y, Liebich J, Hazen TC, Zhou J: GeoChip 3.0 as a high-throughput tool for analyzing microbial community composition, structure and functional activity. ISME J 2010a, 4:1–13.
• Prévost-Bouré NC, Christen R, Dequiedt S, Mougel C, Lelièvre M, Jolivet C, Shahbazkia HR, Guillou L, Arrouays D, Ranjard L. 2011. Validation and application of a PCR primer set to quantify
fungal communities in the soil environment by Real-Time Quantitative PCR. PLoS One 6:13• Richard AH, Qiu XY, Wu LY, Roh Y, Palumbo AV, Tiedje JM, Zhou JZ: Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl Environ Microbiol 2001, 67:4495–4503
RisultatiRisultati
Stefano Mocali1, Flavio Fornasier2, Simone Priori1, Arturo Fabiani1, Maurizio Castaldini1, Giuseppe Valboa1, Edoardo Costantini1
(1) Consiglio per la ricerca in agricoltura e l'analisi dell'economia agraria - Centro di Ricerca Agricoltura e Ambiente (CREA - AA), Firenze
(2) Consiglio per la ricerca in agricoltura e l'analisi dell'economia agraria - Centro di Ricerca Viticoltura e Enologia (CREA - VE), Gorizia
Contact: [email protected]
Ge
oc
hip
mic
roa
rra
ys
0
5
10
15
20
25
30
35
40
BRO12
BRO11
45
4 -
Py
ros
eq
ue
nc
ing
Gene category BRO11 BRO12
Carbon degradation 1730 ± 74 1511 ± 66
Nitrogen 1549 ± 87 1349 ± 59
Nitrification 242 ± 12 210 ± 8
Denitrification 670 ± 45 591 ± 24
Nitrogen fixation 205 ± 6 165 ± 8
Sulfur oxidation 587 ± 26 525 ± 26
Sulfate reduction 154 ± 14 187 ± 12
Nitrogen limitation 300 ± 19 261 ± 18
Cold shock 12 ± 1 9 ± 1
Heat shock 299 ± 14 258 ± 13
Osmotic stress 91 ± 6 80 ± 4
Radiation stress 230 ± 12 199 ± 7
Oxygen stress 962 ± 57 842 ± 32
Phosphate limitation 888 ± 43 785 ± 36
Phosphorous 269 ± 18 244 ± 9
Aromatic pollutant remediation 3656 ± 212 3299 ± 146
Herbicides related compound remediation 422 ± 22 375 ± 15
Pesticides related compound remediation 133 ± 10 120 ± 6
Media geni individuati ± deviazione standard
RicasoliRicasoli è una delle aziende
vitivinicole più antiche d’Italia
(http://www.ricasoli.it), ed è la
cantina più grande nell’area
del Chianti Classico.
Il Il CastelloCastello didi BrolioBrolio è il luogo
in cui il Barone Bettino
Ricasoli inventò la formula del
ChiantiChianti nel 1872; è circondato
da 240 ettari di vigneti e 26 di
uliveti.
L’Italia è uno dei maggiori produttori mondiali di vino. Il Chianti è uno dei vini rossi più
conosciuti e riconoscibili e viene prodotto in Toscana. La viticoltura di precisione viene
applicata per ottimizzare la performance dei vigneti, perciò l’identificazione delle relazioni tra
parametri del suolo e quelli produttivi è fondamentale per l’individuazione delle tecniche
colturali più appropriate per la gestione di differenti aree viticole.
Alcune aree sono risultate più costanti nel tempo,
probabilmente condizionate
dalle proprietàdei suoli
Due suoli
simili hanno
dato luogo a
dei vini di
qualità e
caratteristiche
molto diverse
ConclusioniConclusioni
I risultati di questo lavoro sembrano indicare un ruolo attivo da parte delle comunità
microbiche nella definizione del concetto di “Terroir”. In particolare, il metabolismo dello zolfo
sembra essere un potenziale parametro discriminante della qualità delle uve e, quindi, del
vino. Infatti, BRO12 presenta una maggior presenza di geni per la sulfito reduttasi (es. cysJ,
fccAB, sir) rispetto a BRO11 in cui , invece, prevalgono i geni per l’ossidazione dello zolfo (es.
dsr, aprA). A conferma di ciò, in BRO11 si rileva sia un maggior contenuto di solfati solubili
(7.64ppm) rispetto a BRO12 (7.18ppm) che una maggior presenza di specie coinvolte nel
metabolismo ossidativo dello zolfo come, ad esempio, Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
Infine, anche l'analisi delle attivita enzimatiche hanno evidenziato una maggiore attivita
arilsulfatasica (aryS) nei campioni BRO11. E’ quindi opportuno approfondire maggiormente lo
studio delle relazioni tra microbiota del suolo e vigneti per orientare sempre più le scelte
agronomiche ed enologiche verso una gestione che esalti l'unicità del nostro territorio e la sua
sostenibilità.
Bucelli et al., 2010 - International journal of vine and wine sciences, 44(4): 207-218
NormalizedNormalized DifferenceDifference VegetationVegetation IndexIndex (NDVI)(NDVI)
I suoli
BRO11 e
BRO12
presentano
caratteristiche
chimico-
fisiche molto
simili
Soil chemicalSoil chemical--physical dataphysical data
Enzymatic assays
0
50
100
150
200
250
300
alkP aryS bis-P gluc leu pyro
pm
ol/
g s
oil
BRO11
BRO12
dsDNA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
BRO11 BRO12
µg
DN
A/g
so
il
36,0dsDNA
4,1Pyroposphatase (pyro)
3,1Leucine-aminopeptidase (leu)
3,8β-glucosidase (gluc)
3,0Phosphodiesterase (bis-P)
5,5Arylsulfatase (aryS)
3,3Phosphomonoesterase (alkP)
Activity ratio (BRO11/BRO12)
Similarity percentage analysis (SIMPER) Analisi delle componenti principali
(PCA)
Contribution to variation (%)
Cumulative contribute to variation (%)
Sulfate_reduction 3,27 3,27
Clay_ 3,04 6,31
Ca_exc 3,02 9,34
CEC 3,01 12,35
Sand 3,01 15,36
Silt 2,93 18,29
Mg_exc 2,91 21,20
k_ass 2,82 24,02
K_exc 2,80 26,82
Actinobacteria 2,78 29,60
Unknown_fungi 2,77 32,37
Carbonates_tot 2,72 35,09
aryS 2,65 37,74
Nitrogen_fixation 2,46 40,20
Ascomycota 2,45 42,65
N_tot 2,44 45,09
bis-P 2,32 47,41
Organic_matter 2,30 49,71
C_org 2,30 52,01
Category Genes BRO12 BRO11 Shared Tot %shared
adenylylsulfate reductase aprA 0 4 30 34 88,2
adenylylsulfate reductase APS_AprA 1 3 40 44 90,9
adenylylsulfate reductase APS_AprB 1 5 19 25 76,0
Sulfite reductase cysJ 12 3 146 161 90,7
Sulfite reductase dsrA 6 38 206 250 82,4
Sulfite reductase dsrB 12 20 154 186 82,8
sulfide oxidation fccAB 9 0 41 50 82,0
Sulfite reductase sir 10 0 50 60 83,3
Sulphur oxidation sox 8 13 135 156 86,5
sulfide oxidation sqr 2 0 5 7 71,4
Sulfur tot 61 86 826 973 84,9
Category Genes BRO12 BRO11 Shared Tot %shared
adenylylsulfate reductase aprA 0 4 30 34 88,2
adenylylsulfate reductase APS_AprA 1 3 40 44 90,9
adenylylsulfate reductase APS_AprB 1 5 19 25 76,0
Sulfite reductase cysJ 12 3 146 161 90,7
Sulfite reductase dsrA 6 38 206 250 82,4
Sulfite reductase dsrB 12 20 154 186 82,8
sulfide oxidation fccAB 9 0 41 50 82,0
Sulfite reductase sir 10 0 50 60 83,3
Sulphur oxidation sox 8 13 135 156 86,5
sulfide oxidation sqr 2 0 5 7 71,4
Sulfur tot 61 86 826 973 84,9
Total bacteria (463)
BRO12
BRO11
Shared82,3%
Total bacteria (463)
BRO12
BRO11
Shared82,3%
-25 -20 -15 -10 -5 0 5 10
Actinobacteria
Alfa-Proteobacteria
Beta-Proteobacteria
Delta-Proteobacteria
Gamma-Proteobacteria
Epsilon-Proteobacteria
Archea
Bacteroides
Firmicutes
Cyanobacteria
Chlorobi
Other
unique BRO12
unique BRO11
BRO12
(4,3%)
BRO11
(13,5%)Unique taxa:
4242°° Congresso Nazionale della Congresso Nazionale della
SocietSocietàà Italiana di Scienza del Suolo Italiana di Scienza del Suolo
55--7 Dicembre 2017, Firenze7 Dicembre 2017, Firenze
An
alis
i e
nzim
ati
ch
e