Appendice

II lettore che voglia approfondire gli aspetti biologici trova in que­st'appendice alcune nozioni, riassunte in termini un po' piu detta­gliati di quanto non si e fatto nel teste, sulle tappe che portanol'uovo fecandato a diventare un essere campleto, ovvero su cameavviene 10 sviluppo embrionario.

Lo sviluppo dell'embrione

Lo sviluppo embrionario coinvolge sia i processi di moltiplicazione,sia quelli di differenziazione - cioe di specializzazione - cellulare.Questi processi avvengono attraverso tappe complesse, che pur siverificano a velocita impressionanti. Occorre analizzare brevemen­te tali tappe. Anzitutto quelle relative ai processi di replicazione,che comprendono di norma: la replicazione del materiale geneticoall'interno del nucleo cellulare, la condensazione e la distribuzionedel materiale genetico duplicato a ognuna delle due cellule figlie(segregazione), la divisione del citoplasma, di tutti gli organelli edella membrana citoplasmatica.

La divisione cellulare, che porta a due cellule figlie genetica­mente identiche alia cellula che Ie ha generate, viene chiamatamitosi e interessa Ie cellule somatiche, mentre la divisione cellulare,che porta al dimezzamento del materiaIe genetico e a cellule gene­ticamente differenti, si chiama meiosi. La meiosi, che si realizzanelle cellule germinali, e alia base della variabilita genetica, rime­scola il materiale ereditario e produce nuove combinazioni geniche:svolge un ruolo fondamentale nei cicli biologici sessuati.Nell'intervallo fra due divisioni la cellula si trova in una condizionenota come interfase.

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II clclo cellulare

Lecellule sono, dunque, caratterizzate da un cicio cellulare con duefasi: interfase e mitosi, 0, nel caso delle cellule germinative, meio­si. L'interfase a sua volta viene suddivisa in tre sottofasi: G1, Se G2.La cellula duplica il proprio materiaIe genetico durante la fase S ­sintesi. II periodo compreso fra la fine della mitosi e I'inizio dellafase S viene indicato come G1 - dall' inglese gap, lacuna. Unaseconda fase gap, G2, separa la fine della fase S dall' inizio dellamitosi, quando awengono la divisione del nucleo e quella del cito­plasma e si formano due nuove cellule.

La mitosi e la divisione citoplasmatica vengono complessiva­mente indicate come fase M del cicio cellulare. Sebbene la faseS sia caratterizzata da un evento indispensabile, la replicazionedel materia Ie genetico, anche nelle fasi G1 e G2 si svolgono pro­cessi fondamentali del cicio cellulare. Nella fase G1 infatti la cel­lula si prepara a entrare in fase S e la decisiane di iniziare unnuovo cicio cellulare viene presa quando la cellula passa dallafase G1 a S. Durante la fase G2 la cellula completa i preparativiper la mitosi, sintetizzando, per esempio, i microtubuli che rnuo­veranno i cromosomi verso i poli opposti della cellula in procin­to di dividersi.

Gli stimoli alia replicazione cellulare sono in genere di naturachimica: nell'embrione sona numerosissimi e vengono chiamatifattori di crescita. Essi agiscono nel microambiente in modo sostan­zialmente simile: si legano aile rispettive proteine bersaglio graziealia presenza di particolari complessi recettoriali posti sulla superfi­cie cellulare. II legame specifico innesca determinati eventi all' in­terno della cellula bersaglio, cosicche questa inizia un nuovo cidocellulare. II controllo di tipo endogeno, all'interno della cellula, sullevarie fasi del cicio cellulare e esercitato da alcuni complessi protei­ci chiamati chinasi cic/ina dipendente. Oltre a questi complessianche altre proteine risultano importanti per il controllo del ciciocellulare. Fra queste la proteina pRb del retinoblastoma - definitain base a una neoplasia infantile, in cui la proteina e stata indivi­duata per la prima volta - che controlla il punta di restrizione ameta della fase G1, passato il quale una cellula prosegue in modo

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irrevocabile il resto del cicio cellulare. Questa proteina, quando none fosforilata, cioe quando a essa non e stato aggiunto un gruppofosfato, blocca il cicio cellulare, rna. quando viene fosforilata dauna chinasi cicline dipendente, cessa di bloccare il punta di restri­zione, permettendo alia cellula di procedere oltre la fase Gl perentrare nella fase S.

Edegno di nota il fatto che una funzione cellulare si svolgeperche un inibitore, quale la proteina del retinoblastoma, e statea sua volta inibito da una piccola modifica avvenuta dopo che laproteina e stata sintetizzata, nel caso specifico da un processo difosforilazione.

E un fenomeno questa piuttosto comune nel controllo delmetabolismo e dei processi vitali cellulari. Lo vedremo piu avantianche nei meccanismi responsabili della morte cellulare program­mata: nel caso dei meccanismi di controllo della vita e della mortecellulare, alcune molecole si comportano come Giano bifronte conuna faccia impegnata nell'autodistruzione e un'altra nella soprav­vivenza cellulare.

Oltre alia proteina pRb anche la proteina p53 risulta importan­te per il controllo del cicio. Essa interviene nei casi di danneggia­mento del DNA, portando alia sintesi della proteina p21, cheimpedisce I'attivazione delle chinasi durante la fase Gl e arresta ilcicio cellulare, in modo da permettere alia cellula di riparare idanni genetici.

Dopo la riparazione del DNA la p21 si degrada, permettendoaile chinasi dclina dipendenti di riprendere la loro funzione e di farripartire il cicio cellulare. Come si e visto, i fattori di differenziazio­ne regolano nelle cellule tumorali Ie funzioni delle proteine del reti­noblastoma e di p53 e ne arrestano il cicio cellulare: in questamodo vengono riparate Ie mutazioni che sono all'origine dellarnaliqnita e Ie cellule si ri-differenziano, come testimoniato da unaumento dei markers, che indicano un avvenuto differenziamentocellulare, quali Ie e-caderine.

Quando perc i danni genetici non sono riparabili, viene attiva­ta la morte cellulare programmata e Ie cellule muoiono. Le muta­zioni, come si sa, consistono in una alterazione del materiaIe gene­tico, che usualmente e costituito da DNA.

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II codice genetico

Nel materiale genetico - un gene e un segmento di DNA, che spe­cifica la produzione di una catena polipeptidica di una proteina - edepositata I'informazione ereditaria di un organismo. I geni sonocioe responsabili della trasmissione dei caratteri ereditari, cosl comeci appaiono in ciascun organismo - fenotipo.

In genere ognuno di noi ha varie caratteristiche fenotipiche,quali il colore degli occhi 0 dei capelli, la conformazione del voltoe del corpo, in base al genotipo da cui e costituito. II DNA si repli­ca in modo precise nel cicio di divisione cellulare. La molecola,costituita da due filamenti, si replica in modo semiconservativo:ogni filamento cioe agisce da stampo per la sintesi di un nuovo fila­mento complementare; in questa modo, ognuno dei doppi fila­

menti prodotti dalla replicazione di una molecola di DNA e costi­tuito da un filamento parentale, che deriva cioe dalla molecola di

origine, che e servita da stampo e da un filamento neosintetizzato.II corredo molecolare che provvede alia replicazione del DNA e

molto complesso e compie un errore ogni milione di nucleotidiaggiunti. I nucleotidi costituiscono i mattoni-base della molecola;ognuno di essi ecostituito da uno zucchero, desossiribosio. un grup­po fosfato, e da una delle seguenti basi: adenina, guanina, timina ecitosina. Le basi nei due filamenti sono dislocate in modo che l'ade­nina e sempre accoppiata alia timina e la citosina alia guanina. Datoche i due filamenti sono complementari, e possibile, conoscendo lasequenza nucleotidica dell'uno. capire quella dell'altro.

II DNA, quando mutate. viene riparato attraverso tre differentimeccanismi: correzione di bozze, che corregge gli errori di replica­zione man mana che questi vengono commessi; riparazione dei

disappaiamenti, che provvede a effettuare una scansione del DNAneosintetizzato, correggendo gli errori; riparazione per escissione,

in cui vengono allontanati i pezzi danneggiati. Mentre negli orga­nismi inferiori, quali i batteri - procarioti - il DNA e costituito daun'unica lunga molecola associata a proteine, negli organismisuperiori - eucarioti - il DNA econtenuto in strutture discrete, visi­bili durante la divisione cellulare, chiamate cromosomi, il cui nume­ro e diverse nelle diverse specie - nella specie umana sono 46.

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Anche in questa caso il doppio filamento di DNA si trova associatoa numerose proteine, chiamate istoni. Durante I'interfase i cromo­somi sana compattati a costituire un materiale dense, chiamatocromatina, che e racchiusa nel nucleo, delimitato dal resto dellacellula dalla membrana nucleare. Durante la replicazione cellularela struttura cromatinica viene allentata e cia permette la duplica­zione del DNA oltre che la sua copiatura nei corrispondenti RNA.

L'RNA - acido ribonucleico - assomiglia molto al DNA, in quan­to in modo del tutto analogo si compone di una stringa di nucleo­

tidi, pur presentando una differenza riguardo allo zucchero in essocontenuto - ribosio invece che desossiribosio - e a una base - ura­cile al posta di timina. Le molecole di RNA differiscono, inoltre, daquelle di DNA per il fatto di essere costituite prevalentemente da unsingolo filamento e avere una lunghezza piuttosto limitata. II pro­cesso di copiatura del DNA in RNA, definito trascrizione, coinvolgesolo uno dei due filamenti del DNA. L'RNA subisce poi una serie dimodifiche e infine, come RNA messaggero (mRNA), viene traspor­

tato dal nucleo al citoplasma. Qui si associa a un ribosome. un vastocomplesso molecolare composto da proteine e da un altro tipo diRNA, I'RNA ribosomiale (rRNA): cia gli consente di dar luogo a unprocesso, chiamato traduzione, per cui specifiche triplette di nucleo­tidi dell'mRNA individuano specifici aminoacidi, che vengono uniti econgiunti a formare Ie catene polipeptidiche, che costituiscono Ieproteine. Ciascuna tripletta di nucleotidi, chiamata codone, codificadoe per uno specifico aminoacido i mattoni che costituiscono Ieproteine, oppure funziona da segnale di awio 0 di arresto della tra­duzione della catena polipeptidica. La traduzione della sequenza dinucleotidi dell'RNA a quella degli aminoacidi della catena polipepti­

dica coinvolge numerosi enzimi e altre molecole, tra cui vari tipi diuna forma piu piccola di RNA, chiamato RNA transfer (tRNA), cheagiscono come adattatori, portando gli aminoacidi al ribosoma eaggiungendoli alia catena polipeptidica in via di formazione nell'or­

dine dettato dalla sequenza dei codoni dell'RNA messaggero.In questa modo tutte Ie componenti di una cellula vengono

esattamente duplicate, cost che Ie cellule figlie risultano essere unacopia fedele della cellula madre. Ecia che awiene nell'embrionenelle prime fasi di sviluppo, nelle quali l'uovo fecondato si moltipli-

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ca senza andare incontro a eventi differenziativi. In questa fase, defi­nita di segmentazione, che porta alia formazione di una strutturachiamata morula per la sua forma di piccola mora, Ie cellule vannoincontro a una divisione simmetrica: da ogni cellula madre si origi­nano due cellule figlie del tutto identiche alia progenitrice. Questecellule sono pertanto definite cellule embrionali staminali totipoten­ti, in quanta capaci, come l'uovo fecondato, di originare tutti i tipicellulari di un organismo e quindi di dare vita a un nuovo essere.

L'inizio del differenziamento cellulare

Alia segmentazione, che e una fase meramente moltiplicativa,segue uno stadio in cui iniziano i primi processi di differenziazionecellulare: si forma cioe la blastocisti, una struttura costituita da unamassa interna di cellule da cui oriqinera tutto l'ernbrione. da unacavita priva di cellule e da un contorno, che nei mammiferi dara ori­gine aile membrane embrionali e alia placenta. A questa stadionon tutte Ie cellule embrionali sono totipotenti, in quanta dalle cel­lule del contorno della blastocisti iniziano a differenziarsi quelle chedanno origine aile membrane embrionali. Inoltre anche Ie celluletotipotenti della massa interna della blastocisti iniziano a differen­ziarsi in cellule figlie diverse, che danno origine ai tre fogliettiembrionali: ectoderma, da cui origineranno la cute, gli annessicutanei, il tessuto mammario e il sistema nervoso; endoderma, dacui origineranno i tessuti dell'apparato digerente, compresi quellidelle ghiandole digestive; mesoderma, da cui origineranno Ie ossa,i muscoli, il tessuto connettivo e i vasi sanguigni.

La perdita della totipotenza e il guadagno delle funzioni spe­cializzate da parte delle cellule econseguenza di una divisione defi­nita asimmetrica: Ie cellule progenitrici da un lato danno origine acellule figlie identiche, e dall'altro a cellule diverse che hanno ini­ziato a differenziarsi. In questa modo, in divisioni successive, si for­mana diversi tipi di cellule staminali, che a seconda del grado dispecializzazioneraggiunto, vengono definite pluripotenti, multi po­tenti, oligopotenti, cellule in via di differenziazione definitiva,oppure cellule completamente differenziate. Man mana che Ie cel-

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lule acquisiscono funzioni specializzate, perdono progressivamentela loro capacita di moltiplicazione, sicche Ie cellule completamentedifferenziate non sono piu in grade di moltiplicarsi. In alcuni tessu­ti dell'organismo adulto ci sono cellule che continuano a moltipli­carsi e quindi a differenziarsi, come Ie cellule del midollo osseo, chedanno origine aile cellule del sangue, Ie cellule dello strato germi­

nativo della cute, 0 quelle dei villi intestinali: si tratta di cellule sta­minali che permangono in un organismo adulto.

Ma in che cosa consiste la differenziazione di una cellula a par­tire da un progenitore totipotente? Quali sono i meccanismi che ne

stanno alia base? I progressi fatti dalla biologia molecolare, lasequenziazione del codice genetico e la comprensione, seppur par­ziale, dei meccanismi che regolano I'espressione genica hanno por­tate a capire come da una cellula completamente indifferenziata,totipotente, in rapida moltiplicazione, si possa arrivare a una cellu­la specializzata e stabile dal punta di vista replicativo. Occorre aquesta punto seguire la catena degli eventi attraverso cui si tra­smette I'informazione nella cellula e fra Ie cellule. In sintesi il nucleocentrale del problema e capire come questa informazione si tra­smette nei processi di replicazione/differenziazione, cosl da rende­re possibile il fatto che il codice genetico, che e il medesimo in tutteIe cellule di un organismo, svolga funzioni diverse in ciascuna cel­lula diversamente specializzata.

Molte delle acquisizioni, che ora andremo a illustrare, sono statepossibili dopo la sequenziazione del codice genetico. Questa tappafonda mentaIe per la biologia, che doveva dischiudere gli intimisegreti del funzionamento cellulare e che doveva svelare, comequalcuno in modo un po' retorico e pomposo aveva dichiarato, illinguaggio di Dio nella creazione della vita, in reaIta ci ha fatto com­

prendere che, per capire dawero come la vita si organizza, si eappena agli inizi. Questo del resto e I'aspetto affascinante della

scienza: quando si raggiunge un obiettivo che si pensa essere ton­damentale per la comprensione di un problema, ecco che si svela unmondo ancora piu grande e complesso. Bisogna allora rimboccarsi

nuovamente Ie maniche e cercaredi capire livelli di cornplessita sern­pre maggiori. II sequenziamento del DNA ci ha fatto comunquecapire molte cose interessanti riguardo alcuni aspetti della biologia.

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Da un lato, nella specie umana rneno del 2% del codice gene­tico. per un totale di circa 21.000 geni, serve a codificare proteine.

Prima di avviare il processo di sequenziamento, si stimava che ilnumero di geni umani codificanti fosse compreso fra 80.000 e100.000. Un numero di geni tanto inferiore aile aspettative, difatto di poco superiore a quello del moscerino della frutta - che neha 13.600 - sta a indicare che la diversita osservata nelle molecole

proteiche, che nell'uorno sono circa 100.000, e il risultato di diver­si processi di regolazione a cui vanno incontro singoli geni. Negliorganismi superiori, quali ruorno. dunque una maggior comples­sita si associa a un aumento delle capacita di regolazione, piutto­sto che a un aumento della quantita dei geni codificanti. Un geneeucariotico di medie dimensioni codifica in realta piu di una mole­cola proteica. Vi sono geni che in alcuni eucarioti arrivano a codifi­care oltre 3 mila diverse proteine.

Dall'altro lato, esiste una grande variabilita nella dimensione deigeni, a partire da 1.000 fino a 2,4 milioni di nucleotidi. E poi, quasitutto il genoma (99,9%) e identico in ogni membro di una specie.Nonostante questa apparente ornoqeneita, esistono comunquemolte differenze fra i diversi individui e sono state mappate pill di2 milioni di differenze fra singoli nucleotidi.

Da un altro lato ancora, i geni non sono distribuiti nel genomain modo uniforme. II cromosoma 1 e quello che ne contiene di pill(2968), il cromosoma Y, la cui presenza determina il sesso maschile,e quello che ne contiene di rneno (231). E infine, pill del 50% del

genoma e costituito da sequenze ripetitive. Da quanta si e detto,gran parte del genoma non serve dunque a codificare proteine. A

cosaserve allora il DNA che non codifica proteine? Un tempo si pen­

sava che esso fosse DNAspazzatura. Oggi risulta sempre piu chiaroche in gran parte svolge funzioni regolatrici, regola cioe gli stessigeni codificanti oltre che i meccanismi di segnale fra Ie cellule.

1/ codice epigenetico

Eemerso cioe con chiarezza che accanto al codice genetico, costi­tuito da geni che codificano proteine, vi euna fitta rete di moleco-

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Ie e una parte molto grande di DNA che hanno funzioni regolatri­ci. L'insieme di queste reti e del DNA regolatore puo essere defini­to codice epigenetico. Equesta in verita un vero e proprio codice,che costituisce il sistema preciso di regolazione dell'espressionegenica durante 10 sviluppo embrionario, determinando quali genidebbano rimanere attivi e quali spenti, quali prodotti proteici deb­bano essere sintetizzati e quali no, quali meccanismi di comunica­zione molecolare debbano rimanere operanti e quali disattivati, inche modo in ultima analisi i geni codificanti debbano interagire coni loro prodotti. Equesta dunque il codice che rende possibile il dif­ferenziamento e la specializzazione delle cellule durante 10 svilup­po embrionario. Equesta il codice che permette a una cellula sta­minale embrionale totipotente di diventare una cellula del fegato,del rene, del cervello, del polmone e cosl via. Come il direttore diorchestra decide la dinamica di un brano musicale, cos1 il codiceepigenetico regola la lettura del DNA il quale codifica ciascuna cel­lula, dal suo stesso interno. In questa modo alia fine dei processidifferenziativi risulta che tutte Ie cellule differenziate hanno aliabase il medesimo DNA, ma la parte di geni codificanti attivi in cia­scuna cellula diversamente specializzataespecificatamente diversae rappresenta solo una frazione dell'intero DNA che puc codifica­reo Con pochissime eccezioni, Ie differenze fra Ie cellule specializ­zate sono epigenetiche, non genetiche.

Oggi 10 studio dell'epigenetica sta cambiando il volto della bio­logia: il Ventunesimo secolo inizia come secolo dell'epigenetica,spostando I'attenzione finora esclusivamente incentrata sui codicegenetico. Non ci stiamo ancora ben rendendo conto di tali cam­biamenti, anche se Ie prospettive future in campo terapeutico siintravedono provenire da questa filone di ricerche, piu che dallagenetica, laddove i risultati legati aile manipolazioni geniche sonostate piuttosto deludenti, oltre che eticamente discutibili. Occorreora esaminare Ie varie tappe della regolazione epigenetica, cuivanno incontro Ie cellule staminali embrionali totipotenti fino adarrivare a cellule completamente differenziate. In un organismopluricellulare con cellule e tessuti specializzati, ogni cellula possie­de tutti i geni di quell'organismo: la differenza fra cellule specializ­zate e dovuta alia specifica attivita dei geni che sono rimasti fun-

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zionanti, dopo il silenziamento specifico e selettivo, a cui molti di

essi sono andati incontro durante il differenziamento embrionario.

Perche 10 sviluppo proceda normalmente e ogni cellula acquisisca e

mantenga una funzione specializzata, certe proteine debbono

dunque essere sintetizzate nel momenta giusto e nelle cellule giu­

ste. Quindi I'espressione genica deve essere controllata in modo

molto preciso. A differenza della replicazione del DNA, che in gene­re in ogni cellula e regolata dal principio del "tutto 0 nulla", I'e­

spressione genica e un processo altamente selettivo.

II rimodellamento della cromatina

Uno dei primi punti, in cui awiene un processo regolatore ea livello

della cromatina, che e il materiaIe contenuto nel nucleo delle cellule,

costituito da DNA addensato, awolto attorno a un centro composto

da proteine chiamate istoni, che svolgono un ruolo di rilievo nel com­pattare I'acido nucleico. Poco meno di 2 pieghe del DNA, costituiteda 146 nucleotidi, si awolgono attorno a un centro composto da

otto istoni, formando una struttura che ricorda una perla di una col­lana e che viene chiamata "nucleosoma". Con I'aiuto di altre protei­ne istoniche, che collegano il centro dei vari nucleosomi con il DNAinterposto fra loro. il filo di nucleosomi si piega a costituire una fibra

di cromatina che viene poi ulteriormente compattata.

II grado di addensamento della cromatina ne influenza I'accessi­

bilita ai fattori indispensabili per la trascrizione dei geni ivi contenu­

ti. Piu la cromatina e compattata e minore e l'accessibilita ai fattori

di trascrizione. Una delle modalita per impedire la trascrizione di un

gene equella di metilarlo, cioe di attaccare un gruppo CH3 ad alcu­

ne sue basi. In questa caso non viene modificata la sequenza del

DNA, ma la cromatina viene compattata, influenzando cos] la pro­

babilita di trascrizione, che risulta diminuita. AI contra rio I'aggiunta

di gruppi acetilici (C2Hs) ad alcuni aminoacidi degli istoni porta di

solito a una struttura cromatinica piu allentata con conseguente

maggiore probabilita di trascrizione. La rimozione invece dei gruppiacetilici dalle proteine istoniche, cosl come la metilazione dei loroaminoacidi, porta a una cromatina molto piu addensata, che non

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permette al DNA di essere trascritto. II rimodellamento della croma­tina puo riguardare un intero cromosoma, per esempio uno dei cro­mosomi X legato al sesso. Come si sa, una femmina di mammiferonormale possiede due cromosomi X, mentre un maschio normaIepossiede un cromosoma X e un cromosoma Y. Dunque tra maschi

e femmine esiste una grande differenza per quanta riguarda ildosaggio dei geni legato al cromosoma X. In altre parole ogni cel­lula di una femmina possiede due copie di geni presenti sui cromo­soma X e quindi puo potenzialmente produrre il doppio di proteinecodificate da questi geni rispetto aile cellule maschili. Cia non awie­ne, perche durante il differenziamento cellulare uno dei due cro­

mosomi X materni viene metilato e la sua cromatina condensata, inmodo da rendere Ie sequenze del DNA fisicamente inaccessibili almacchinario molecolare di trascrizione.

La regolazione trascrizionale e post-trascrizionale

La regolazione trascrizionale e legata anzitutto a proteine, dette

fattori di trascrizione, necessarie a un enzima, chiamato RNA poli­merasi, per formare un complesso, che determina il punta d'iniziodella trascrizione. Tale complesso si lega a una sequenza del DNAchiamata promotore e da inizio alia trascrizione della regione codi­ficante del gene. All'estrernita opposta di quest'ultimo si trova unaregione del DNA, chiamata terminatore, riconosciuta come puntadi terminazione della trascrizione. In questa modo si danno isegnali di start e di stop alia trascrizione del DNA in RNA.

A livello trascrizionale esistono molti eventi di regolazione checambiano in modo sostanziale I'espressione genica. Esistono regio­

ni regolatrici, recentemente scoperte, che sono raggruppate imme­diatamente a monte del promotore. A queste regioni possonolegarsi varie proteine regolatrici, che possono attivare la trascrizione.

Inoltre, molto lantana dal promotore, a distanza anche di 20.000

basi, sono localizzate sequenze, dette intensificatori. Questesequenze legano proteine attivatrici e questa legame stimola forte­

mente il complesso di trascrizione. Infine sui DNA esistono regioniregolatrici negative, dette sequenze silenziatrici, che hanno effetto

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opposto a quello degli intensificatori. I silenziatori arrestano la tra­scrizione, legando proteine chiamate per questo motivo repressori:i repressori si legano cioe aile sequenze silenziatrici e, a seguito dicia, viene arrestata la trascrizione.

In alcuni casi, I'espressione genica e regolata dallo spostamen­to di un gene in una nuova posizione sui cromosoma, che com­porta un riarrangiamento del DNA. Questo riarrangiamento eimportante per la produzione di proteine altamente variabili, comequelle che costituiscono il repertorio degli anticorpi umani, e anchenel determinare alcune patologie gravi come certe forme di cancro,in cui geni inattivi possono risultare spostati in posizioni adiacenti apromotori attivi.

Un altro tipo di regolazione e quello nota come amplificazionegenica, che si verifica, per esernpio, nelle cellule uovo mature dirane e di pesci, che contengono fino a mille miliardi di ribosomi,necessari per I'imponente sintesi proteica, che segue la feconda­zione. La cellula destinata a differenziarsi inizialmente contienerneno di mille copie di geni che codificano per I'RNA ribosomiale equindi impiegherebbe circa 50 anni per sintetizzare tutto questaRNA. La cellula uovo ha risolto questa problema amplificandoselettivamente il gruppo di geni per I'RNA ribosomiale, aumentan­done enormemente la quantita: in effetti questa gruppo di genipassa dallo 0,2% al 68% del DNA codificante totale. Questi milio­ni di copie, che trascrivono alia massima velocita, sintetizzano inpochi giorni i mille miliardi di ribosomi, necessari alia sintesi protei­ca successiva. Passando a esaminare i processi di regolazione alivello post-trascrizionale, e da sottolineare che un meccanismomolto importante negli organismi superiori e legato a un processonota come splicing alternativo dell'RNA. Infatti negli eucarioti ilDNA accanto a sequenze codificanti, chiamati esoni, presenta dellesequenze non codificanti note come introni. I trascritti degli intro­ni compaiono nei trascritti primari di RNA, chiamati pre mRNA, iquali pero. prima di arrivare nel citoplasma ai ribosomi, subisconoun processo di taglio, splicing, che avviene in grandi complessi diRNA e proteine, chiamati spliceosomi, in cui si eliminano gli intro­ni dalla trascrizione primaria dell'acido ribonucleico e vengonoaccorpati gli esoni fra di loro. Equesta RNA messaggero COS! trat-

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tato, mRNA maturo, a venire tradotto nei polipeptidi. Lo splicingspesso e molto piu elaborato, in quanto pub procedere a taglimolto diversi, in grade di dare origine a molteplici RNA messagge­ri e di conseguenza a prodotti proteici diversi: per esempio nellaDrosophila Melanogaster si arriva con questa processo a sintetiz­zare fino a tremila diverse proteine.

Un'altra rnodalita di regolazione post-trascrizionale e quellalegata alia revisione deIl'RNA, RNA editing, che avviene sostanzial­mente in due modi diversi: 0 con I'inserimento di nuovi nucleotidinell'mRNA, 0 mediante la modificazione chimica di un nucleotide.In entrambi i casi viene modificata la proteina sintetizzata. Anche iltempo di sopravvivenza dell'RNA messaggero nel citoplasma e sot­toposto a regolazione post-trascrizionale: quanta e minore iltempo passato da un mRNA nel citoplasma tanto piu ridotto e iltempo di utilizzazione di questa per la sintesi della proteina codifi­cata. Infine meccanismi importanti di regolazione sia a livello tra­scrizionale, sia a livello post-trascrizionale, ma anche, come vedre­mo. a livello traduzionale sono quelli legati all'azione degli RNAregolatori. Questi RNA sono stati scoperti in larga misura a seguitodel fallimento dei tentativi da parte dei ricercatori di ottenerenuove funzioni 0 modifiche nelle piante e negli animali, inserendonelle loro cellule frammenti di DNA 0 RNA. Per esempio introdu­cendo una copia in piu del gene, che sviluppa il colore rosso por­pora nelle petunie, i ricercatori hanno sperato di ottenere fiori piucolorati. AI contrario si sono trovati in presenza di fiori bianchioppure variegati, bianchi e porpora. Cio significava che sia il nuovogene introdotto, sia quello pre-esistente nella pianta, erano stati inqualche modo disattivati. Esempi analoghi di silenziamento genicosi sono riscontrati in funghi e animali. Per qualche tempo si ediscusso di tali anomalie, indicandole, di volta in volta, come (0­

soppressione nelle piante, soffocamento nei funghi e interferenza

da RNA negli animali. Alia fine si epreso atto che essi avevano ele­menti in comune. Ora sono indicati come interferenza da RNA.

L'interferenza da RNA, che porta al silenziamento genico,dipende da piccole molecole di RNA, chiamate siRNA (small inter­

fering RNAs), che derivano da molecole di RNA piu grandi, dotatedi strutture insolite. Tali molecole, che sono a doppio filamento,

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vengono rilevate da un enzima, chiamato Dicer- produttore di pic­coli cubi - che sminuzza Ie molecole in piccoli pezzi lunghi da 21 a23 nucleotidi.

Queste molecole di RNA sono in grado di causare la distruzio­ne delle copie di RNA messaggero aberrante, da cui sono derivate,associandosi alia sequenza complementare presente nell'mRNA einducendo quindi un altro enzima a degradarlo. Qualsiasi RNAmessaggero, dotato di sequenze complementari a questi piccoliRNA, subisce 10 stesso trattamento. Cia comporta di fatto la man­cata espressione del gene responsabile della trascrizione di taleRNA messaggero.

I piccoli RNA presentano altre caratteristiche bizzarre, quali lacapacita di spostarsi in altre cellule, anche di tipo diverse, produ­cendo cos] effetti di silenziamento genico a distanza. Inoltre sonoin grado di silenziare geni anche attraverso un altro meccanismo edoe una metilazione stabile del DNA. In questa caso, si tratta diuna regolazione a livello trascrizionale.

L'enzima Dicer e in grado di liberare un'altra c1asse di piccoliRNA, a partire da precursori a doppio filamento. Tali molecole, pro­cessate da Dicer, alia fine sono ridotte a molecole a filamento sin­golo e risultano costituite da 21-23 nucleotidi. Essi, indicati con ilnome di microRNA (miRNA), riconoscono Ie sequenze degli RNAmessaggeri bersaglio e vi si accoppiano, impedendo la traduzionedi questi ultimi in proteine. In questa caso quindi il meccanismod'azione ediverso: si tratta di una regolazione a livello traduziona­le, e non di un meccanismo di regolazione post-trascrizionale, cheporta alia degradazione dell'RNA messaggero. Questi microRNAsono coinvolti nel differenziamento cellulare e hanno un grandeimpatto sulla regolazione dell'espressione genica e quindi sullo svi­luppo di un organismo.

Studi in cui parte del processamento dei microRNA e statomesso fuori usc, hanno dimostrato che un organismo non puosoprawivere senza il ruolo regolatore di tali microRNA. AttraversoI'interferenza da RNAepossibile disattivare virtualmente in manie­ra selettiva qualsiasi gene, semplicemente introducendo unmicroRNA appropriato all'interno della cellula. I potenziali beneficidell'applicazione di questa tecnica sono enormi.

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Regolazione traduzionale e post-traduzionale

Si e appena visto un meccanismo di regolazione traduzionale daparte di specifici microRNA nel bloccare la traduzione di specificiRNA messaggeri. Cio comporta ovviamente il blocco della sintesidelle corrispondenti proteine. Esistono altre rnodalita di regolazio­

ne a livello traduzionale: queste sana spesso legate, per esempio,alia concentrazione delle specifiche proteine che debbono esseresintetizzate. Quando la loro concentrazione e bassa, aumenta lavelocita con cui vengono tradotte da parte dell'RNA messaggerogia presente nel citoplasma, quando la loro concentrazione e altasi verifica il contra rio. Infine esiste una regolazione delle proteinedopo che esse sana state sintetizzate.

Un'importante rnodalita di regolazione post-traduzionale equel­la legata al controllo del tempo di sopravvivenza delle proteine all'in­terno della cellule stesse. Siegia visto che alcune proteine implicatenella divisione cellulare, per esempio Ie cieline,vengono idrolizzate almomenta giusto affinche la sequenza degli eventi si sviluppi corret­tamente nel tempo. In molti casi a una proteina che deve esseredegradata viene legata una catena polipeptidica di 76 aminoacidi,chiamata ubiquitina, cos] definita per la sua presenza ubiquitaria:questa complesso si lega a sua volta a un altro grande complessocostituito da una dozzina di polipeptidi, chiamato proteasoma, checostituisce una specie di camera molecolare di distruzione, in cui laproteina destinata alia degradazione viene effettivamente distrutta.La concentrazione intracellulare di molte proteine non edetermina­ta dalla diversa veloota di trascrizione dei corrispondenti geni, madalla rapidita di distruzione attraverso il proteasoma.

Un esempio di regolazione post-traduzionale di una proteina,

che non ha niente ache vedere con il differenziamento embriona­rio, ma che qui viene ricordato per completezza di informazione, equello legata alia famosa sindrome della mucca pazza, cioe all'en­cefalopatia spongiforme bovina, detta anche BSE. Si tratta in que­sto caso, ovviamente, di una regolazione post-traduzionale patolo­

gica. Enota che molte proteine, come avviene del resto per diver­se altre macromolecole, possono assumere forme diverse in conte­sti diversi, pur mantenendo la stessa sequenza aminoacidica.

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Queste diverse conformazioni delle proteine, definite paesaggicanformaziona/i, hanno di solito funzioni diverse. La BSE derivadalla presenza di una forma non funzionante di una proteina, chenella sua forma normale e molto importante per la salute del cer­vello. La causa della BSE e la stessa proteina patologica, codificatadal gene corrispondente non mutato, la quale, dopo che e statatradotta, ha assunto una conformazione anomala. La proteina nonfunzionante invade Ie cellule del cervello, Ie quali vanno cos] incon­tro alia necrosi. La modalita con cui si forma la proteina anomala edel tutto particolare: quando la proteina anomala incontra la pro­teina, che si trova nella conformazione normale, si congiunge conquesta e ne cambia la forma rendendola uguale a se. Coslla malat­tia si propaga in modo devastante nel sistema nervoso fino aliamorte dell'individuo. II passaggio della malattia da un organismo aun altro avviene per ingestione di carne in cui sono presenti cellu­le del sistema nervoso che contengono proteine anomale. Questenel nuovo organismo si comportano nel modo sopradescritto, cau­sando la malattia.

Tutti i processi di regolazione genica che abbiamo esaminato,tranne I'ultimo, sono responsabili degli eventi differenziativi, che siverificano nell'embrione e quindi dei processi che portano una cel­lula uovo fecondata totipotente a un intero organismo. In sintesi sie visto dunque che la differenziazione cellulare consiste in una dif­ferenziale, specifica e selettiva regolazione di geni, che sostanzial­mente restringe il genoma espresso. L'espressione genica di una

cellula dopo ogni stadio di differenziazione ediversa dalla progeni­trice per diverse centinaia di geni espressi. Cia e possibile perche,come abbiamo visto, esiste una rete di regolazione, per cui il gene,che in passato si pensava essere un centro di controllo indipenden­

te e autonomo della sintesi proteica, in reaIta e sotto il controllodiretto e indiretto di questa rete e delle proteine sintetizzate.

Nell'embrione Ie interazioni tra nucleo e citoplasma e tra cito­plasma e microambiente sono cosl numerose ed estese da costitui­re un meraviglioso esempio di cornplessita, L'embrione che si svi­luppa e si differenzia e infatti un eccellente esempio di cia che i cul­tori della cornplessita definiscono sistema camp/esso adattativo.Esso infatti e una rete di molteplici cellule che agiscono in paralle-

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10, ha diversi livelli di organizzazione che sono cont inuamente sottorevisione e controllo. ha un' implicita predizione scritta nel codicegenetico e nelle rnodalita epigenetiche di regolazione, e in conti­nua transizione ed e caratterizzato da novita continuamente emer­gent i. In questa modo dalla cellula pragenitrice di tutte Ie altre,cioe dalla cellula staminale totipotente derivano dappr ima Ie cellu­le staminali pluripotenti, poi Ie cellule staminali multipotenti, quin­di Ie oligopotenti e cos] via: si forma doe un nuovo essere.

i blu - I'occhio e la lente

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D. Romani, A. Drioli

Science centree ricerca artistica s'incontrano per mettere in luce il ruolo

della scienza nella nostra societe. L'artista mette il nasa nelle faccende

scientifiche e si fa interprete di curiosito e aspettative, ma anche di rischi

e inquietudini che 10 scienza e Ie sue applicazioni portano con se. loscienziato percepisce nell'opinione pubblica un interesse crescente per

il proprio lavoro. Questo teste e un primo passo per descrivere una

reoltc in continua espansione, dominata do quella straordinaria e vita­

lissima entropia che caratterizza 10 saldatura tra due culture che non

possono piu stare separate.