Anti-CD44Una molecola multi-uso

Dr. Angelo Micozzi

Auto-antigeni e allergeni

Sebbene le immunoreazioni cutanee di tipo I siano state ben studiate negli ultimi sei decenni, solo con le recenti applicazioni di biologia molecolare la ricerca allergologica ha potuto caratterizzare il legame IgE-allergene.

Uno degli aspetti più interessanti della questione èrappresentato dalle omologie tra allergeni ambientali e auto-antigeni, quali superossido dismutasi manganese dipendente, tioredoxina e ciclopilina.

Auto-antigeni

La capacità di tali molecole nello stabilire un legame con le IgE può essere spiegata mediante il loro mimetismo molecolare con gli allergeni ambientali.

La risposta dei linfociti, in questi casi, èconsiderata determinante per la insorgenza delle reazioni cutanee, come la dermatite atopica.

Tioredoxina 1

La tioredoxina-1 (Trx-1) è una piccola proteina composta da 105 amminoacidi, con peso molecolare di 12.5 kDa, che svolge un importante ruolo antiossidante nelle cellule animali.

Possiede, infatti, proprietà enzimatiche legate ai cicli di ossidoriduzione. È espressa in tutti i tipi di tessuto umano studiato ed èfilogeneticamente molto conservata.

Produzione di Trx-1

La Trx-1 si trova soprattutto nel citoplasma, sebbene sono note condizioni fisio-patologiche in cui può traslocare nel nucleo cellulare (ad esempio, per ridotta ossigenazione cellulare).

È anche facilmente inducibile da molti tipi di stimolazione: produzione di radicali liberi, eccessiva esposizione cellulare ai perossidi o ai raggi UV, intossicazione acuta o cronica di certi metalli pesanti come piombo o arsenico.

Diverse funzioni

Le cellule tumorali sfruttano questo processo, sintetizzando molta più Trx-1 delle cellule normali.

Il carcinoma gastrico, pancreatico, mammario ed epatico, alcuni tipi di leucemia e anche tumori dei tessuti riproduttivi sintetizzano più Trx-1 del normale e la loro frequente chemio-resistenza è direttamente legata a tale fenomeno.

La Trx-1 è stata identificata come uno dei fattori rilasciati nel sangue delle donne gravide, per sopprimere la risposta immunitaria verso l'embrione, dopo il suo impianto.

Funzione principale

A livello intracellulare, la Trx-1 funge da maggiore proteina antiossidante assieme ad un'altra piccola molecola, nota col nome di glutatione.

Quest'ultimo è decisamente molto piùabbondante della Trx-1, ma con una efficienza inferiore. I due sistemi anti-ossidanti lavorano, ovviamente, in parallelo, ma in diversi compartimenti cellulari.

Proto-oncogeni

La grande scoperta riguardo alla Trx-1 fu fatta agli inizi degli anni '90, quando alcuni autori dimostrarono che a livello nucleare la Trx-1 catalizza la riduzione dei ponti S-S di due proteine nucleari, i proto-oncogeni noti con i nomi di c-Fos e c-Jun.

Queste due proteine sono dei fattori di trascrizione, ossia legano il DNA in regioni specifiche per indurre l'espressione di nuovi geni.

p53

Un altro importante fattore sotto il controllo della tioredoxina èl’oncosoppressore p53, la cui mutazione è responsabile di svariati tipi di cancro.

Anche p53 può essere soggetto all'azione dei radicali liberi e diventare inattivo.

Steroidi

La tioredoxina può controllare anche il recettore intracellulare degli steroidi.

Dopo la sua formazione, il complesso ormone-recettore migra dentro il nucleo cellulare per legare il DNA e portare all'espressione genica specifica.

Tale fenomeno spiega l’utilità del cortisone nell’asma.

Inefficacia del cortisone

Tuttavia, ci sono casi in cui la terapia steroidea ha una scarsa efficacia, nonostante la frequenza delle dosi.

Alla base di questa inefficacia, si ammette che lo stress ossidativo, prodotto nell'infiammazione polmonare asmatica, porta all'inattivazione del complesso recettore/cortisone.

Il farmaco steroideo ha scarsissima affinità per il recettore ossidato e quindi non può entrare nel nucleo e trascrivere i geni per le proteine anti-infiammatorie, che normalmente sono indotte dalla terapia steroidea.

>Trx-1

I soggetti allergici e asmatici hanno una maggiore concentrazione di tioredoxina nel plasma in quanto la sua forma ossidata è espulsa dalle cellule, prima ancora che possa essere riconvertita dalla sua reduttasi.

Il depauperamento intracellulare impedisce la funzione anti-ossidante della molecola.

Di conseguenza, i radicali liberi mantengono ed esasperano lo stato infiammatorio, generando una steroido-resistenza.

Protezione dal sole

La pelle umana normale possiede molta tioredoxina concentrata nelle ghiandole sudoripare, nelle ghiandole sebacee e nello strato esterno della radice del bulbo pilifero.

La molecola è ulteriormente prodotta, a scopo protettivo, a seguito di esposizione solare, soprattutto per la componente ultravioletta.

Aterosclerosi

Analoghe osservazioni sono state messe in relazione con la progressione del processo aterosclerotico.

In questi casi, la produzione di tioredoxina, da parte delle cellule endoteliali e dendritiche, ha un evidente significato protettivo.

Auto-immunità

Considerando la conservazione filogenetica delle tioredoxine, è possibile che le molecole prodotte da agenti infettivi possano determinare una reattività crociata con quelle umane.

Questo fenomeno è stato proposto nella patogenesi dell’asma e dell’eczema.

Trx da aspergillo

Tutte le tioredoxine, comprese quelle umane, sono in grado di legare le IgE specifiche dei pazienti con aspergillosi broncopolmonare allergica, oltre a indurre reazioni cutanee positive.

Il mimetismo molecolare tra le due forme, umana e fungina, è alla base della manifestazione clinica, la quale deve essere considerata una vera e propria condizione allergica di tipo autoimmune.

Malassezia

Identiche osservazioni sono state proposte per la malassezia sympodialis, nella patogenesi dell’eczema.

Ancora una volta, il mimetismo molecolare rappresenta un momento essenziale nell’insorgenza del fenomeno allergico.

Proteasi condivise

Partendo da queste interessanti considerazioni, dobbiamo ammettere che gli allergeni contengono epitopi condivisi con diverse molecole umane.

Ad esempio, Der p 1 e Der p 2, di dermatophagoides pteronyssimus hanno una intensa attività proteasica della cisteina, analogamente a quanto si verifica per alcuni frutti, quali kiwi, papaya, ananas, fichi.

SOD

La reattività IgE-mediata verso autoantigeni èstata dimostrata, ormai da tempo, con metodiche ELISA e Western Blot.

In vivo, tali reazioni sono in grado di indurre atopia, come nel caso della manganese superossido dismutasi, la quale provoca eczema nei soggetti sensibili.

Ciò si verifica per mimetismo molecolare con allergeni ambientali.

Switch Th1-Th2

Molte recenti osservazioni indicano che i disturbi autoimmuni e le allergie sono strettamente connessi tra loro.

In ambedue i casi, la modalità patogenetica piùimportante è rappresentata dalla deviazione della risposta, da Th1 a Th2.

È stato ampiamente dimostrato che i pazienti atopici sviluppano autoanticorpi, tanto quanto i pazienti autoimmuni sviluppano allergie.

Ruolo di CD44 nello switch

La polarizzazione dei linfociti attivi, da Th1 a Th2, è un processo di differenziazione, dovuto a diversi fattori, tra i quali l’espressione di una molecola, denominata CD44.

Sostanzialmente, tale molecola ècoinvolta nella infiltrazione dei linfociti, a livello dei tessuti infiammati.

Modelli sperimentali

Nei modelli sperimentali di induzione dell’asma sui topi, le cellule T-CD4+, che esprimono anche CD44, risultano determinanti per la insorgenza delle risposte di ipersensibilità.

Al contrario, i topi che non esprimono il CD44 non manifestano risposte asmatiche.

Ciò si verifica anche nei topi con linfociti CD44+, cui si somministrano anti-CD44.

Eosinofili…perchè

Molto interessante è anche l’osservazione che gli eosinofili, come i linfociti CD4+, esprimono alti livelli di CD44 nei polmoni dei soggetti asmatici, a seguito della interazione con allergeni.

Questo fenomeno si verifica mediante l’azione della IL-13, come è stato dimostrato nei topi anziani.

CD44

Il CD44 è una glicoproteina di membrana, implicata nelle interazioni tra cellula e cellula, nell’adesione e nella migrazione cellulare.

Ciò si verifica a seguito del suo legame con lo ialuronato presente nelle membrane basali.

Altri ligandi della molecola sono: laminina, collagene, fibronectina, osteopontina, selectina (CD62E) e metalloproteinasi.

Marcatore vario

È anche considerato un marcatore importante dei linfociti B attivati, oltre a svolgere un ruolo nello sviluppo dei linfociti T, nell’aggregazione, chemiotassi e adesione dei leucociti all’endotelio.

È pure un marcatore valido nelle fasi di attivitàdella sclerosi multipla.

Alcune isoforme di CD44 mediano l’invasione del trofoblasto nei tessuti materni.

Early placental development is associated with

complex regulatory mechanisms, and molecular pathways involved during

placental development are

critical for pregnancy progression.

Molecole di adesione

CD44

Term

placenta

Results:CD44

A down-regulation of CD44 was observed in decidual (D) cells.

CD44-I Tr.

CD44-I Tr. CD44-I Tr.

CD44-II Tr. CD44-II Tr.

CD44-III Tr. CD44-III Tr.

Decreased MVD in CTs in spontaneous abortion cases can suggest that MVD is critical in uteroplacental adequacy. Moreover,a down-regulation of E-cadherin could be responsible for impaired CTs differentiation and loss of the pregnancy. Furthermore, decreased CD44 expression in D cells may be cause of impairing stroma-villous connections.Their analysis in spontaneous abortions will provide useful information for clarifying the physiopathology of spontaneous abortions.

Altre funzioni

Il CD44 svolge anche una importante funzione: permette la disseminazione, la migrazione e la progressione di molte forme tumorali.

Inoltre, partecipa alla trasformazione dei macrofagi in cellule schiumose, promuovendo le tipiche lesioni aterosclerotiche.

Fibrosi polmonare

La fibrosi polmonare è un processo patologico irreversibile, dovuto alla deposizione di matrice extracellulare nell’interstizio degli alveoli

I miofibroblasti esprimono CD44, si accumulano nei tessuti e rimodellano i componenti della matrice, soprattutto acido ialuronico e collagene, compromettendo la funzionalità respiratoria.

Il trattamento con anti-CD44 riduce in modo significativo, nei topi, l’insufficienza respiratoria dovuta alla fibrosi.

Asma

Le caratteristiche principali dell’asma sono rappresentate da uno stato di infiammazione cronica e dal rimodellamento delle vie aeree.

L’a. ialuronico si accumula negli interstizi e stimola macrofagi e cellule dendritiche a produrre citochine, corresponsabili del quadro clinico asmatico.

Citofluorimetria

Mettendo a confronto 21 soggetti asmatici con un gruppo di controllo di 25 sani sono stati prelevati dei campioni bioptici mediante broncoscopia, sui quali si è osservata l’espressione di ialuronato, CD44, TLR-2 e TLR-4 nei fibroblasti, macrofagi e cellule dendritiche.

La metodica usata è stata la citofluorimetria.

Come anti-CD44

I fibroblasti dei soggetti asmatici mostravano un significativo aumento di acido ialuronico, rispetto ai controlli.

I macrofagi e le cellule dendritiche, invece, evidenziavano una marcata riduzione di CD44 a livello alveolare, oltre a un aumento di TLR-2 e TLR-4 in risposta a all’acido ialuronico.

Trasduzione del segnale

CD44 ha il suo ligando nell’acido ialuronico.

Quest, a sua volta, lega TLR-2 e TLR-4. Tale complesso attiva la trasduzione del segnale infiammatorio, a livello dei tessuti coinvolti, regolando il reclutamento delle cellule mononucleate, la loro migrazione e il rilascio di citochine.

Trasd

uzion

e del segnale

Figura

Dalla figura si può notare come il segnale di acido ialuronico e lipopolisaccaridi sia molto simile. LPS usano TLR-4 e CD14 per trasdurre il segnale infiammatorio. Acido ialuronico interagisce ancora con TLR-4 e anche CD44 per trasdurre lo stesso segnale.

L’acido ialuronico è un componente ad alto peso molecolare della matrice extracellulare polmonare. La lesione del polmone genera frammenti a basso peso molecolare di questa molecola, i quali legano CD44 e TLR-4 e permette ai macrofagi e cellule dendritiche di attivarsi.

Trasduzione del segnale

TLR4 TLR4

Trasduzione del

segnale

Nucleo

NF-kB

Citochine

infiammatorie

Acido ialuronico

L’acido ialuronico è un componente ad alto peso molecolare della matrice extracellulare polmonare.

La lesione del polmone genera frammenti a basso peso molecolare di questa molecola, i quali legano CD44 e TLR-4 e permette ai macrofagi e cellule dendritiche di attivarsi.

Penicillium chrysogenum

Un esempio di questo fenomeno si evidenzia con un allergene, denominato Pen Ch 13, che proviene da Penicillium chrysogenum e funziona da proteasi alcalina sulla serina.

Tale allergene contribuisce a una regolazione negativa del CD44, fenomeno fondamentale nella genesi dell’asma allergica, prolungando la disfunzione delle cellule epiteliali bronchiali danneggiate.

Ancora sul CD44

Il CD44 è una molecola di adesione altamente glicosilata, coinvolta nella infiltrazione linfocitaria dei tessuti infiammati.

Tali linfociti sono marcati Th2, come si dimostra nei modelli murini di asma acuta.

La presenza di acido sialico nel CD44 gioca un ruolo fondamentale nella genesi di questo fenomeno.

Anti-CD44

CD44 gioca un ruolo importante nella migrazione dei linfociti nelle malattie autoimmuni e nei fenomeni immuno-mediati di tipo 1.

Tale fenomeno può essere prevenuto dalla somministrazione di anticorpi anti-CD44, precedente a quella di allergeni nei topi sensibilizzati e soggetti a manifestazioni allergiche cutanee.

Molte patologie

È stato da tempo osservato che la cistite interstiziale èspesso associata a diverse altre condizioni patologiche, quali allergie, malattia infiammatoria intestinale, fibromialgia, LES e sindrome di Sjogren.

La prevalenza delle allergie è riportata, nei diversi lavori, dal 40 all’80% dei casi di cistite interstiziale, tanto che il trattamento allergico riesce, in molti casi, a migliorare i disturbi urinari.

Nella forma ulcerativa, il CD44 è sovra-espresso.

Eosinofilia

Un paradosso della medicina è rappresentato dal rapido aumento nella incidenza delle malattie immuno-mediate.

Tra questi paradossi, il più intrigante èl’aumento degli eosinofili, sia a livello sistemico, sia a livello locale.

Tale eosinofilia è mediata dalla maggiore espressione di CD44 su tali cellule, con un importante effetto pro-infiammatorio e di reclutamento.

Anti-CD44

Il CD44 sembra avere un effetto protettivo sulle manifestazioni autoimmuni e allergiche. In queste ultime servirebbe a risolvere il processo infiammatorio indotto dalle cellule dendritiche.

Questo aspetto protettivo è stato dimostrato con la esacerbazione degli stati asmatici e delle fasi di riacutizzazione delle malattie autoimmuni, somministrando nei topi anticorpi anti-CD44.

Alopecia areata

L’anti-CD44 è in grado di impedire l’insorgenza di molte malattie immuno-mediate, come nel caso dell’alopecia areata.

Tale condizione patologica è caratterizzata da una risposta di ipersensibilità ritardata, mediata dai linfociti T e l’anticorpo è in grado di neutralizzarla nei topi.

PAF

La somministrazione di anti-CD44 induce uno shock sistemico nei topi, mediante il platelet activating factor (PAF).

Tale studio è stato riportato nei topi, osservando l’esasperata permeabilitàvascolare a livello cutaneo.

Artrite reumatoide

È stata evidenziata l’osservazione che i pazienti con artrite reumatoide mostrano un considerevole aumento di CD44 nella sinovia articolare, così come di acido ialuronico.

Anti-CD44 agisce in senso pro-infiammatorio nei casi di artrite indotta nei topi, mediante somministrazione di collagene e proteoglicani.

Streptococcus A

Lo Streptococcus pyogenes si lega alle cellule epiteliali di faringe e cute mediante CD44.

Ciò induce un movimento delle cellule epiteliali stesse e un riarrangiamento della matrice extracellulare, permettendo la rottura delle giunzioni.

Questo fenomeno è la conseguenza della trasduzione del segnale, mediata proprio dalla molecola CD44.

Mycobacterium tuberculosis

Un altro aspetto interessante del CD44 è la sua capacità di legame recettoriale per Mycobacterium tuberculosis.

Questo recettore è fondamentale per il riconoscimento del batterio, soprattutto a livello polmonare, da parte delle cellule infiammatorie, in modo particolare delle cellule dendritiche.

IpaB di Shigella

L’internalizzazione della Shigella nelle cellule epiteliali è caratterizzata da una transitoria riorganizzazione del citoscheletro nei siti di interazione batterica.

È stato dimostrato che il CD44 funziona da recettore per la proteina IpaB di tale batterio.

Il pre-trattamento con anti-CD44, impedisce alla infezione di progredire.

CD44 FUNCTIONS:

CD44 is a multifunctional receptor involved in :

• Cell-cell and cell-matrix interactions

• Cell traffic on endothelium and ECM and cell migration

• Cytoskeletal reorganization

• Presentation of cytokines and growth factors to traveling cells

• Uptake followed by intracellular degradation of HA

• Activation of cell cycle, cell proliferation, differentiation and development

• Cell survival: resistance / induction of apoptosis

• Activation of inflammatory genes (via NFκB pathway)

GENOMIC STRUCTURE OF GENOMIC STRUCTURE OF

CD44 MOLECULECD44 MOLECULE

Exon Map 3’5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

LP v2 v3 v4 v5 v6 v7 v8 v9 v10 TM CT

Alternative Spliced Transcripts

CD44s

CD44v of

keratinocytes

Epithelial CD44

pMeta-1 CD44v4-v7

CD44v8-v10

CD44v3-v10

~800 different isoforms of CD44

Rheumatoid

Arthritis

Specific CD44 Variants Express in Different Diseases Specific CD44 Variants Express in Different Diseases

NormalCancer Diabetes Atherosclerosis Colitis

Anti-CD44 mAbs reduce pathological activities in the following experimental

diseases:

Disease Target CD44 Epitope

Malignant lymphoma in BALB/c mice Constant

Diabetes in NOD mice Constant

Experimental allergic encephalomyelitis in (PLxSJL) F1 mice

Constant

Experimental colitis in BALB/c mice V7

Collagen-induced arthritis in DBA/1 mice Constant

Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Human V6

Anti-CD44 mAbs for

Treatment of Human Diseases

DiseaseTarget CD44

EpitopeDrug Company Development status

Chron’s CD44v7 Hu-ARH460-16-2

ARIUSCanada

1. One antibody (conjugated to toxic payload) was dropped because of toxicity.2. Completion of pre-clinical studies / pre-IND

CarcinomasBrest, Prostate

& AMLCD44std. AR001

ARIUSCanada Pre-clinical studies

Advanced Carcinomas CD44v6

Bivatuzumab-mertansine

Boehringer Ingelheim

GmbHGermany

1.The antigen is expressed on normal epidermal cells.

2. The antigen is expressed on normal keratinocytes.

3. Failed in Phase 1 trials because of Skin-Toxicity

Rheumatoid arthritis

CD44vRA MD101 MaimoniDexIsrael & UK

Completion of the proof of concept / Pre-clinical studies

CD44vRA sequence

VARIANT EXON 4

AT GTA GAC

V D

VARIANT EXON 5

ATG ACT G

M T

CA G

A D

75% of RA Patients

alanine

RHEUMATOID ARTHRITIS

NormalJoint Tibia

BM

Tarsus

Meta-TarsusBones

BM

Cartilage

Cartilage

Histopathology Analysis

Negative ControlAnti-pan-hCD44 mAb

TalusMeta-TarsalBones

Fibro VascularProliferation

Inflammatory Cells

Fibrin

CartilageDestruction

Histopathology Analysis

Anti-mouse-TNF-αααα

BM

Tibia

Talus

Tarsus

Capsule

Inflammatory CellsModerate Inflammation

Fibro VascularProliferation

Moderate

Blood Vessels

Fibrin

Histopathology Analysis

Anti-hCD44vRA(F8:33)

Tibia

BM

Talus

TarsusMeta-Tarsus

Synovial Membrane

Inflammatory CellsMild-Moderate

Infiltrate

FibrinLess

FibrinCartilage

Destruction

Anti-hCD44vRA(F8:33) Tibia

BM

Tarsus

Ligament

Capsule

Synovial Line

Meta-Tarsus

JointSpace

IEL

Si legano al collagene, tramite

integrine

Riconoscono gli antigeni presentati dai macrofagi e

dalle cellule epiteliali dell’intestino

Aumentano nelle allergie

gastrointestinali

Non modificano il numero e la funzione con l’amento dell’età

Derivano dal midollo, ma maturano il TCR nel MALT extratimico

IEL

TCR/γδ

Aggravamenti da antigeni

polifosforici

ATOPIA

Anti-CD44 valutazione dello switch IgG->IgE

strepto, staphylo

CD44

H-CAM (hyaluronan cell adhesion molecule)

Aggregazione cellula-cellula, cellula-matrice, segnale cellula-matrice, internalizzazione recettore-mediata, degradazione acido jaluronico

CD44Homing Cellular Adhesion Molecule

Lega collagene, fibronectina e altre molecole

Epitelio, endotelio, cellule stromali ed ematopoietiche

Hyaluronan (HA)

ankyrin

Osteopontin (OPN)

ankyrin

Cell adhesion Migration

CD44 CD44

CD44 LIGANDS

ECM CELL SURFACE

* Hyaluronic acid * Mucosal vascular addressin

* Collagen * Serglycin/gp600

* Fibronectin * Osteopontin (OPN)

* Fibrinogen * Class II invariant chain (li)

* Laminin * E-selectin

* Chondroitin Sulfate * L-selectin

Galectin-8

Multiple sclerosis

Rheumatoid arthritis

Diabetes

Cancer

Ulcerative Colitis

DISEASE-SPECIFIC

CD44

Atherosclerosis

Normal