Analisi degli alimenti tramite PCR Real-Time

Introduzione ad una tecnologia all'avanguardia

Obiettivi

Questa presentazione tratterà i seguenti argomenti:

• Quali sono le applicazioni della PCR Real-time?• Come funziona la PCR Real-time?• Che strumenti vengono usati?• Come si presentano i risultati di una Real-time?• Come possono essere usati questi dati per calcolare la

quantità di DNA?

Cos'è la PCR?

Qualsiasi essere vivente (batteri, piante, animali, virus, muffe, alghe) contiene acidi nucleici (DNA/RNA).

Anche alimenti e mangimi sono costituiti da esseri viventi.Gli acidi nucleici di un essere vivente possono essere

estratti utilizzando un metodo appropriato.

Pertanto, utilizzando il metodo appropriato, il DNA (o l'RNA) contenuto in alimenti e mangimi può essere

estratto e purificato dagli altri componenti.

Cos'è la PCR?

La Reazione Catena della Polimerasi (Polymerase Chain Reaction "PCR") è un processo che permette di copiare (amplificare in gergo tecnico) specifici frammenti di DNA (templato in gergo tecnico).

Grazie alla sua specificità, la reazione copia solo questi specifici frammenti di DNA, anche quando

sono dispersi in una moltitudine di altro DNA.Queste copie sono chiamate ampliconi

Cos'è la PCR?

DNA target (Templato)

DNA disperdente

PCR

Ampliconi

Cos'è la PCR?

Gli ampliconi possono essere marcati con degli specifici reattivi chimici che emettono fluorescenza in presenza di DNA.

La PCR quindi consente la rilevazione di DNA di

contaminanti indesiderati, anche se sono dispersi in matrici alimentari/mangimistiche ad abbondante

contenuto di DNA, grazie allo sviluppo di fluorescenza rilevata da un apposito strumento

Cos'è la PCR Real-time?

La PCR Real-time (qPCR) è una tecnica specializzata che permette di visualizzare in tempo reale la progressiva amplificazione di una reazione di PCR, attraverso uno strumento che rileva e misura la fluorescenza

Come vedremo, la PCR Real-time permette di misuraresequenze di DNA presenti in piccole quantità

all'interno di un campione

Le applicazioni della qPCR

La qPCR è diventata una pietra miliare della biologia molecolare nella ricerca di base e nelle diagnosi cliniche. Alcuni esempi di utilizzo: Analisi dell'espressione genica (es. ricerca sul cancro e sulle droghe) Diagnosi e gestione delle malattie (es. quantificazione della carica virale) Miglioramento genetico di animali e piante

Da un decennio la qPCR è anche utilizzata per l'indagine alimentare. Alcuni esempi di utilizzo: Identificazione di patogeni e di microorganismi alteranti Identificazione e quantificazione in percentuale degli OGM negli alimenti Verifica dell'autenticità dei prodotti alimentari Controllo e individuazione della presenza di allergeni nei prodotti alimentari Individuazione delle malattie negli animali da allevamento

Come funziona la PCR Real-time?• Per capire meglio la PCR Real-time, entriamo nel

dettaglio di come funziona in pratica un normale esperimento di PCR.

• Questo hamburger contiene soia anche se non è evidente?

Estrazione del DNA

DNA Soia

DNA disperdente: grano, sesamo,manzo, insalata, cipolla, pomodoro

Aggiungere il DNA estratto in

un tubo semplice(tubo PCR)

Aggiungere i reagenti PCR

nel tubo

Reagenti PCR:• Enzima DNA polimerasi• Primers• dNTPs• Buffer

Allestimento della reazione di PCR

Corsa della reazione PCR

Inserire il tubo PCR nello strumento

Reazione di amplificazione

Lo strumento avvia dei cicli di riscaldamento e raffreddamento dei reagenti presenti nel

tubo PCR

Durante ogni ciclo il templato si

duplica

Alla fine del processo (solitamente 30-40 cicli) la PCR ha amplificato la sequenza del DNA soia

Immaginiamo una PCR Real-time

Per capire meglio la PCR Real-time, proviamo ad immaginarci all'interno del tubo di reazione durante i cicli 23-24-25. Se partiamo da una singola copia di templato soia…

Un mix di reagenti PCR e 223 copie del

templato soia(8388608 copie)

Ciclo 23

Un mix di reagenti PCR e 224 copie del

templato soia(16777216 copie)

Ciclo 24

Un mix di reagenti PCR e 225 copie del

templato soia(33554432 copie)

Ciclo 25

Immaginiamo una PCR Real-time

Se dovessimo tracciare la quantità di DNA presente nel nostro tubo, dall'inizio dell'esperimento fino al ciclo 25, il grafico dovrebbe assomigliare a questo (curva logistica):

Ma…con l'avanzamento della reazione i reagenti si esauriscono progressivamente, di conseguenza questa crescita esponenzale non può continuare per sempre!

Ampl

icon

i

Cicli

Immaginiamo una PCR Real-time

La cinetica complessiva di una reazione PCR è una curva sigmoidale. Questa cinetica può essere monitorata utilizzando dei reagenti che emettono fluorescenza in presenza di DNA amplificato!

Fase di Plateau

Fase lineare

Fase esponenziale

Cicli

Ampl

icon

i

Strumento della Real-time PCR

Per una Real-time PCR occorrono TRE componenti principali:

1. Termociclatore (riscaldamento e raffreddamento del tubo PCR)2. Modulo ottico (rilevazione della fluorescenza nel tubo PCR)3. Computer (interpretazione dei dati di fluorescenza e loro

trasformazione in risultati comprensibili)

Dettaglio 3

Strumento della Real-time PCR

Gli strumenti per la Real-time PCR possono rilevare più di una fluorescenza contemporaneamente (multiplex), quindi:

1. Possiamo avviare più di una reazione nello stesso tubo sullo stesso campione e la cinetica di queste reazioni viene analizzata indipendentemente utilizzando differenti reporter di fluorescenza (per esempio possiamo verificare simultaneamente la presenza di soia e di sedano nel DNA estratto dall'hamburger).

2. Possiamo aggiungere in ogni reazione PCR un controllo interno di amplificazione (IAC) per osservare eventuali inibizioni ed evitare risultati falsi negativi

TargetIAC

Campione positivo Campione negativo Inibizione PCR

Calcolo delle quantità inReal-time PCRDal momento che la PCR segue una esatta cinetica nella

sua fase esponenziale:1. Ad ogni curva si può individuare il punto di intersezione con una

soglia arbitraria (threshold), valore definito "Valore Ct", ovvero il ciclo al quale la fluorescenza diventa significativamente rilevabile

2. L'aumento dei valori Ct è inversamente proporzionali alla quantità iniziale del DNA

3. Ad ogni ciclo di PCR si raddoppia la quantità di DNA rispetto al ciclo precedente (2n dove n=numero di ciclo): ad esempio un estratto di DNA diluito serialmente 10 volte mostrerà una distanza di 3,2 Ct tra una diluizione e l'altra (10=23,2)

threshold

Dal momento che è presente una corrispondenza tra distanza dei Ct e le diluizioni di DNA, la Real-time PCR consente una quantificazione accurata del target di interesse

Se abbiamo materiale standard quantificato disponibile possiamo

effettuare una curva di calibrazione traducendo quindi, attraverso interpolazione, una quantificazione relativa in una quantificazione assoluta, misurando così il campione incognito

Valo

reC

t

0 1 2 3 4 5 6 7

Logaritmo quantità

Punto Standard Campione incognito

Calcolo delle quantità inReal-time PCR

PCR Digitale

Con la PCR digitale il DNA estratto viene messo in piccole gocce, ogni singola goccia si comporta come un singolo tubo PCR

= DNA disperdente (15)

= DNA soia (5)

Risultati

1000 1000 1000 1000 1000

PCR Digitale

Se il DNA target è presente nella goccia, avviene la reazione PCR e si verifica la fluorescenza o in caso contrario rimane buio

Contando il numero di gocce fluorescenti possiamo

determinare il numero assoluto di DNA target presente nel campione di partenza (di seguito il grafico tipico)

= Gocce negative

= Gocce positive

pozzi