1

HIV e AIDS

Acquired Immuno Deficiency Syndrome

• Malattia causata da un agente infettivo:

un retrovirus

2

3

La stragrande maggioranza dei casi (>90%)è nell'Africa sub-Sahariana (tasso di infezione 20-25%) e nel Sud-Est asiatico.

•Circa 6.300 nuove infezioni da HIV al giorno nel mondo 700 di queste avvengono in bambini <15 anni di età Il 47% delle infezioni nell’adulto in donne e 39% in individui <25 anni • Prima dell’introduzione di terapie combinate anti-HIV, l’incidenza dell’AIDS aumentava ad un tasso di quasi il 5% annuo

Persone viventi con HIV/AIDS Casi totali stimati:

35 milioni

Morti totali stimati: 25 milioni

4

HIV e AIDS

5

Il Virus

Il virus si replica solo in cellule T4 proliferanti in risposta ad uno stimolo immunologico

Trascrittasi inversa in cellule T4 attivate nel sangue di pazienti con AIDS •Robert Gallo : HTLV-3 • Luc Montagnier: LAV

Virioni di HIV al microscopio elettronico. Notare il core centrale e l’envelope

Human Immunodeficiency

Virus (HIV)

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Struttura dell'HIV Env gp120

Glicoproteina di superficie

Env gp41 Glicoproteina transmembrana

Gag p17 Proteina matrice

Gag p24 Capside

RNA (2 molecole)

Pol Proteasi p9

Polimerasi /RNAsi p66 Integrasi p32

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Antigeni di superficie

Envelope di derivazione cellulare Due glicoproteine: gp160 gp120 e gp41

gp120 è antirecettore e variabile gp41 è fusogena e immunosilente

problema per vaccino • gene ENV

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Antigeni Gruppo-Specifici

• gene GAG

p17: superficie interna – miristoilata MATRICE

p24: capside

p9: nucleocapside associata con RNA

Poliproteina

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Enzimi

• Polimerasi/RNAsi

• Integrasi

• Proteasi (taglia le poliproteine)

• gene POL Poliproteina

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Il Genoma di HIV

Tre geni strutturali (GAG, POL, ENV)

Sequenze LTR (promotori, enhancer e siti di legame per fattori trascrizionali cellulari)

Altri open reading frames codificano per piccole proteine regolatrici e accessorie che inducono anticorpi

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Il Genoma di HIV

PRECOCI TAT: Transattivatore di Trascrizione

REV: Regolatore di Espressione delle proteine Virali

(promuove trasporto mRNA non sottoposto a splicing da nucleo a citoplasma)

NEF: Fattore di Regolazione Negativa (erroneamente, sottoregola proteine cell)

TARDIVE VIF: Fattore che aumenta infettività virale in alcune cellule

VPU: (facilita assemblaggio e rilascio)

VPR: (media trasporto genoma nel nucleo cellulare)

mRNA sono fatti con splicing multipli del cDNA

TAT e REV sono essenziali per la replicazione di HIV

Piccole proteine non-strutturali

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HIV-1 e HIV-2

•HIV-1 in tutto il mondo, il più diffuso

•HIV-2 in Africa occidentale, Caraibi, America

meridionale, meno virulento HIV-2 solo 40% di omologia con HIV-1 ma 75% di omologia con SIVmac HIV-1 filogeneticamente simile a SIVcpz

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HIV-1 e HIV-2 Notevole variabilità genetica

HIV-1 Gruppo M (major)

N O Africa centro-occidentale

11 sottotipi (A- K) HIV-2

6 sottotipi (A-F)

Divergenza 25-35% tra i sottotipi e fino al 20% all’interno di un sottotipo.

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HIV Tropismo

Linfociti T CD4+

Macrofagi

• Distruzione specifica dei linfociti CD4+

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Entrata nella cellula Le cellule T4 (CD4+) sono il

bersaglio principale

Cellule umane HeLa

Cellule umane HeLa transfettate con l’antigene CD4

NON INFETTATE INFETTATE

Ma la proteina CD4 NON è sufficiente poichè l’infezione non avviene se CD4 è transfettato in cellule di TOPO

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Corecettore

CD4

CD4 CD4

HIV

CCR5 CCR5

chemochina CCR5 Mutato

macrofago I recettori per le chemochine sono corecettori necessari insieme al CD4

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HIV e AIDS

Persone esposte non infette

Long term non-progressors

La storia del recettore per le chemochine

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Corecettori e infezione da HIV

• CCR5 è un recettore per le chemochine

• Cellule con molecole CCR5 mutanti omozigoti non sono infettate da HIV

• Persone con molecole CCR5 mutanti eterozigoti progrediscono verso l’ AIDS più lentamente

•25% dei long term survivors sono mutanti in CCR5 o CCR2 (delezioni)

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antigene CD4

Corecettore cellula CD4+

HIV gp120 si lega a CD4/corecettore

HIV - Adsorbimento

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antigene CD4

Corecettore

cellula CD4+

21

gp120

gp41 antigene CD4

Corecettore

gp41 HIV cellula T4

22 Gp120 si lega a CD4/corecettore

Matrice

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Il legame causa un cambiamento conformazionale nelle molecole gp120

Trascrittasi inversa

Proteasi Integrasi

tRNA

24

Gp41 è esposta e si inserisce nella membrane della cellula CD4

25 Le membrane cominciano a fondersi

26 Le membrane fondono

27

Il nucleocapside entra nella cellula CD4

28

Entrata per fusione • Fusione a pH neutro

• Non ha bisogno degli endosomi per l’entrata

• Sincizi

Importante per la progressione della malattia: diffusione cellula-cellula

Importante per la terapia: gli anticorpi non bloccano questo tipo di diffusione, necessaria immunità cellulo-mediata

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RETROVIRUS - REPLICAZIONE

3 diverse attività enzimatiche •Trascrittasi inversa •RNasi H •DNA pol DNA dipendente

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Uscita per gemmazione

• Il virus esce immaturo dalla cellula

• La proteasi scinde la poliproteina gag

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Trasmissione

Orizzontale Rapporti sessuali Sangue Verticale Transplacentare Perinatale Latte

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HIV Patogenesi Tropismo per linfociti T CD4 (citocida) Cellule della linea macrofagica (persistente) (macrofagi, monociti, cellule microgliali cerebrali, cellule dendritiche della cute) Effetto citopatico per: • accumulo di copie di genoma come DNA circolare non intergrato • aumento di permeabilità della membrana citoplasmatica • formazione di sincizi • induzione di apoptosi

Immunosoppressione per diminuzione di cellule T CD4 da: • citolisi indotta da HIV • citolisi mediata dalle cellule immunitarie T-citotossiche

Patologie neurologiche da: • rilascio di sostanze neurotossiche o fattori chemiotattici da parte di monociti e cellule microgliali infettate risposta infiammatoria nel cervello • effetti citopatici nei neuroni

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HIV e AIDS Andamento della malattia – Quadro cellulare e immunologico

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HIV e AIDS Quadro cellulare e immunologico

Decorso della malattia

1. Infezione acuta

• Alto titolo virale (fino a 107 virioni per ml di sangue)

• Sintomi modesti

• Diminuzione di cellule CD4+ e poi recupero

• Aumento di cellule CD8+ e poi recupero

• Macrofagi infettati I macrofagi portano HIV nell’organismo in caso di trasmissione sessuale

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HIV e AIDS

2. Una forte risposta immune

Il virus scompare in gran parte dal sangue (persiste nei infonodi e nei macrofagi) • Buona risposta di cellule T citotossiche (CTL) • La maggior parte del virus in questa fase viene prodotto da cellule CD4+ recentemente attivate (che si dividono) e infettate • La produzione di nuove cellule CD4+ compensa la perdita dovuta alla lisi per ECP e alla distruzione delle cellule infette da parte dei CTL

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HIV e AIDS

3. La latenza

Latenza del virus e dei sintomi

• Il virus persiste nei tessuti extra-vascolari

• Le cellule CD4+ della memoria (non attivate) albergano il provirus per lungo tempo (anni)

•Quando le cellule si attivano c’è produzione di virus

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HIV e AIDS 4. L’inizio della malattia

Perdita massiva di cellule CD4+ • Le cellule CD4+ sono il bersaglio del virus • Le cellule che proliferano per rispondere al virus sono uccise dal virus • La variabilità antigenica permette al virus di sottrarsi alla risposta immune proprio nel momento in cui questa diminuisce • Apoptosi delle cellule CD4+

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HIV e AIDS 5. Malattia avanzata - AIDS

• La perdita di cellule CD4+ significa assenza di controllo di virus e cellule infette

• Quando il n. di CD4+ è < 200/ml il titolo virale aumenta rapidamente e la risposta immune residua collassa

• Infezioni opportunistiche

• Morte entro ~2 anni in assenza di terapia

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HIV - latenza

L’infezione da HIV non si manifesta come malattia per anni

Durante la latenza clinica apparente, il virus si replica a basso titolo ed è eliminato

Latenza Cellulare

Solo cellule T4 attivate possono replicare il virus

La maggior parte delle cellule T4 infettate sono lisate ma sono rimpiazzate

Alcune cellule T4 revertono a cellule della memoria (quiescenti) di lunga vita

Le cellule T4 di memoria non possono replicare il virus se non diventano attivate

Latenza - Clinica

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Latenza

In assenza di qualsiasi stimolo attivante:

Omeostasi

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Rottura della Latenza

T4 quiescenti

Risposta immune (interazione di citochine o antigeni con recettori sulla

membrana cellulare) T4 attivati

Produzione di HIV

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Terapia – inibitori dell’entrata

Peptidi capaci di legarsi alla gp41

Bloccano l’interazione di gp41 con le proteine della membrana cellulare durante la fusione

T-20: nei trials clinici, quasi 2 log di riduzione nei livelli plasmatici di HIV

ENFUVIRTIDE T-20

MARAVIROC Si lega a CCR5 e lo stabilizza in una

conformazione inattiva

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Terapia – Inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa

AZT-azidotimidina e d4T,

analoghi della timidina

Sono analoghi strutturali dei nucleosidi

•La fosforilazione alla forma trifosfata è opera di enzimi

cellulari

ddI-dideossiinosina analogo della inosina

ddC-dideossicitidina E 3TC-lamivudina

analoghi della citidina

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AZT – meccanismo di azione

P

P

P

P

Sintesi normale di cDNA

HIV RNA

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P

P

P

P

P

AZT P-P-P

Termine

Inibisce anche:

• HBV

AZT agisce in 2 modi:

• Compete con TTP

• Terminatore della catena

Selettiva:

• AZT-TP ha affinità 100 volte > per trascrittasi inversa che per polimerasi a e b cellulari

HIV RNA

cDNA

T

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Terapia - Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa

In genere derivati delle benzodiazepine che, complessandosi direttamente con

l'enzima, ne inibiscono la funzione.

Molto efficaci e ottimamente tollerati, ma selezionano rapidamente mutanti resistenti ==> impiegati solo per rafforzare altre combinazioni di 2-3 farmaci.

Agiscono solo su HIV

Nevirapina, delavirdina e loviride

Terapia - Inibitori dell’integrasi

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RALTEGRAVIR (recentemente introdotto), inibisce l’attività dell’enzima virale INTEGRASI

Causano facilmente lo sviluppo di mutanti

resistenti

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Terapia - Inibitori di proteasi

La proteasi virale consente la maturazione dei virioni

Gli inibitori della proteasi (indinavir, ritonavir, saquinavir , nelfinavir) sono composti a basso peso molecolare capaci di complessarsi con il sito attivo

della proteasi e di inibirne così la attività.

Inducono sintesi di particelle virali difettive che non hanno attività infettante.

Hanno alta attività antivirale e indice di selettività di 1000. In vivo inibiscono la viremia plasmatica di oltre 2 log.

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Strategie Anti-HIV • Educazione

Trasmissione sessuale

Non altamente infettivo

• Chemioterapia Seleziona mutazioni Resistenza

ma

Sopprime la replicazione Incapacità di mutazione

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Strategie Anti-HIV Highly

Active

Anti-

Retroviral

Therapy

HAART: Due analoghi nucleosidici inibitori di RT e 1 inibitore della proteasi

Ora anche: Due analoghi nucleosidici inibitori di RT e 1 inibitore non nucleosidico

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Polimorfismo

Trascrittasi inversa e Pol II hanno un alto tasso di errore: 1/2.000-10.000

Il genoma di HIV ha 9749 nucleotidi Quindi OGNI nuovo virus ha almeno una mutazione!

L’HIV che infetta il paziente è molto diverso da quello che ha prodotto l’infezione primaria

HIV è un retrovirus (trascrittasi inversa) I Retrovirus usano la RNA polimerasi II cellulare per replicare il loro

genoma

Problema per il vaccino

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Polimorfismo Prime fasi dell’infezione:

• Tropismo per macrofagi (corecettore CCR5)

• Non induce sincizi

• Lenta replicazione

Fasi tardive dell’infezione •Tropismo per cellule T4 (corecettore fusina o CXCR4)

• Induce sincizi

• Elevata replicazione Problema per il vaccino

Polimorfismo dovuto all’alto tasso di mutazione risultante dalla mancanza dell’attività di correzione (proof-reading) della

trascrittasi inversa e della RNA pol II

Comparsa di sottopopolazioni con tropismo cellulare alterato

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Polimorfismo • La proteina virale più variabile è la gp120

• La sequenza aminoacidica in un singolo paziente varia dell’1-6%

• Fino al 30% nella popolazione

La co-infezione con diversi virus può portare a ricombinazione

• I carboidrati mascherano i siti conservati

Problema per il vaccino

Problema per il vaccino

Problema per il vaccino

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Polimorfismo

Problema per i farmaci

• Variazioni nella trascrittasi inversa portano a resistenza agli analoghi dei nucleosidi e agli inibitori non nucleosidici

• Variazioni nella proteasi portano a resistenza agli inibitori di proteasi

Problema per i farmaci