Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a

fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per

la caratterizzazione di proteine

F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda

(Università di Bologna)

Relazione Struttura/Funzione nelle molecole proteicheRelazione Struttura/Funzione nelle molecole proteiche

Condizioni Denaturanti

Condizioni Pseudo-Native

ES/MS e conformazione proteicaES/MS e conformazione proteica

A.E. Ashcroft et al (2002) J Biol Chem. 277(36):33115-26

ES/MS e complessi proteiciES/MS e complessi proteici

M. Fändrich, et al, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14151-5.

•RP-HPLC: Altamente denaturante

•Gel Filtration: Difficoltà di interfacciamento

•Elettroforesi Capillare: Blandamente denaturante Difficoltà di interfacciamento

Sistemi separativi classici e analisi on-line di proteine e complessi proteici in condizioni

native

Sistemi separativi classici e analisi on-line di proteine e complessi proteici in condizioni

native

Analytical Chemistry (2003)In press

Principio della "Field-Flow Fractionation"Principio della "Field-Flow Fractionation"Principio della "Field-Flow Fractionation"Principio della "Field-Flow Fractionation"

Spessore

Campo esterno Introduzione del campione

Flusso

Detector

Lunghezza

Larghezza

Flusso parabolico

Sp

esso

re

Campione

Il canale HF FlFFFIl canale HF FlFFFIl canale HF FlFFFIl canale HF FlFFF

1/8” 1/8” PEEK ferrulePEEK ferrule1/8” 1/8”

PEEK ferrulePEEK ferrule

1/8” 1/8” Teflon tubeTeflon tube

cPVC / PSfcPVC / PSfHF membraneHF membrane24x0.08 ID cm24x0.08 ID cm

1/8” 1/8” PE fittingPE fitting

1/8” 1/8” PE TeePE Tee

Vin Vout

Vrad

Modo normale in HF FlFFFModo normale in HF FlFFF Meccanismo di ritenzione BrownianoMeccanismo di ritenzione Browniano

vFlussoFlusso

z

CampoCampo

L

Ux

rrff

2

2

12fr

zvzv

D

Uzczc exp0

Vin

Vout

Vrad

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

se

gn

ale

UV

@2

80

nm

(m

AU

)

t e m p o ( m i n )

Frazionamento di proteine in HF FlFFFFrazionamento di proteine in HF FlFFF

Fase mobile: Ammonio acetato 50 mM ;pH7Vin=0.70 ml/min ;Vrad=0.38 ml/min

BSA 2% in FM ;mw 66 kDaHrp 1% in FM ; mw40 kDaAP 1% in FM ; mw 160 kDaFer 1% in FM ; mw 449 kDa

Costruzione della retta di taratura lnD vslnM

9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5

-8,5

-9,0

-9,5

-10,0

-10,5

-11,0

AP

Hb

ln D

ln M

Y = A + b * X

Parameter Value Error

A -5.92967 0.30651

b -0.37513 0.02702

tR= —8D

ln —V out

V in

D= kT3 d

rf2

D=A M -b

BSAHrp

Mio

Fer

HF FlFFF-ES/Q-TOF MSHF FlFFF-ES/Q-TOF MS

Fase mobile

Scarico

Valvola a 4 vie

Valvola a T

012

3

Scarico

Valvola d’iniezione

Valvola a spillo

Fase mobile

0.75

0.750.75

0.50

Pompa 1

0.75

0.750.75

0.50

Pompa 2F

ibra

Manometro

Manometro0

123

UV-DAD

ES/Q-TOF

Valvola a spillo

Valvola di splitting

Canale HF FlFFFCanale HF FlFFF

Valvola Valvola di splittingdi splitting

Sorgente ESSorgente ES

UV/vis DADUV/vis DAD

0 2 4 6 8 10 12 14

0

50

100

150

200

250

300

segnale

UV

@280 n

m(m

AU

)

tempo(min)

0 1 2 3 4

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

TIC

tempo(min) 56000 58000 60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000 80000mass0

100

%

+55

1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850m/z0

100

%

+50+45

+40

+36+60

66397.8Peso Molecolare misurato:66397.81±1.74 DaPeso Molecolare teorico: 66398.61 Da

Analisi HF-FlFFF-MS della BSAAnalisi HF-FlFFF-MS della BSA

Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

0 2 4 60

200400600800

10001200140016001800

0 2 4 6 8 10 120

1020304050607080

TIC

tempo (min)

seg

na

leU

V@

28

0 n

m(m

AU

)Analisi HF-FlFFF-MS della HRPAnalisi HF-FlFFF-MS della HRP

Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0

100

%

1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600m/z0

100

%

D212021.55

F221967.09D22

1929.76C22

1925.72F231881.54D23

1845.88

C231842.05

A221888.27

C212017.34

B211982.61

F212060.65

E212056.50

D202122.62

C202118.21

A202077.15

F202163.65

E202159.32

F192277.42D19

2234.34

C192229.48

2168.61

F182403.89D18

2358.292353.22

2281.38B18

2312.61

E182399.04

2364.08

D172497.09

C172491.802409.55

2412.89

F172545.25

2497.97 2550.92

2601.99

A41521.5

B41600.4

C42343.1

D42422.0 E

43165.0

F43244.1

41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0

100

%

C42343.1

D42422.0

E43165.

0

F43244.1

GlicosilazioneGlicosilazioneA

41521.5

B41600.

4

2 Ca 2+

2 Ca 2+2 Ca 2+

Fase mobile:ammonio acetato 50mM ;pH7

Analisi HF-FlFFF-MS della mioglobina da cavallo

Analisi HF-FlFFF-MS della mioglobina da cavallo

17400 17450 17500 17550 17600 17650 17700 17750 17800 17850mass0

100

%

1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0

100

%

2196.71

1952.90

1757.67

1959.69

1970.98 2189.54

2510.602204.62

2212.08 2928.752519.242704.01

+9 +8

+7+6

17566.70 P. M. Mioglobina:16951.51 DaP. M. Eme:615.35 Da

P. M. Misurato:17566.69±0.58 Da

1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600

m/z0

100

%

0

100

%

2196.71

1952.90

1757.67

1959.69

1971.08 2189.54

2510.712204.62

2212.08 2519.24

1542.04

1696.15

1546.95

1551.66

1615.49

1884.521701.41

1706.88

1785.45

2119.911890.46

1995.272422.66

B11 B10

B9

B8B7

A10

A9 A8

A7

A:17566.69±0.58 Da

B:16951.48±0.27 Da

HF-FlFFF-MS

LC-MS

1925 1930 1935 1940 1945 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995m/z0

100

%

0

100

%

1952.86

1946.83

1955.23

1957.74

1960.11

1973.461971.011962.10 1975.60

1952.90

1947.11

1959.71

1955.43 1970.981964.60

+9

+9

+Na+

+2Na+

+3Na+

+CH3COO-

Introduzione Diretta

HF-FlFFF

Confronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/EmeConfronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/Eme

1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700m/z0

100

%

B81968.66

B91750.03

B101575.07A10

1513.59A9

1681.84

A81891.89

B72249.57

A72161.831971.30

1972.41

B62624.36

A62521.782252.79

2627.70

14400 14600 14800 15000 15200 15400 15600 15800 16000 16200 16400 16600mass0

100

%

A15125.9

B15740.6

P.M. teorico Hb-: 15126.23 DaP.M. teorico Hb-: 15867.19 Da

Eme

0 5 10 15

0

100

200

300

400

500

600

segn

aleU

V@28

0 nm

(mAU

)

tempo (min)

0 2 4 6 8

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

TIC

tempo (min)

Analisi HF-FlFFF-MS dell’emoglobina umana

Analisi HF-FlFFF-MS dell’emoglobina umana

Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

ConclusioniConclusioniL’accoppiamento HF-FIFFF/spettrometria di massa costituisce un sistema semplice e robusto per l’analisi di proteine e complessi proteici in condizioni native:

1) L’interfacciamento non presenta problemi rilevanti.

2) L’assenza di interazione con una fase stazionaria e la possibilità di utilizzare qualsiasi tipo di solvente garantiscono il mantenimento della stabilita’ delle proteine e dei complessi in esame.

ProspettiveProspettivea) Miniaturizzazione del sistema separativo per interfacciamento diretto con sorgente nanospray

b) Valutazione dell’efficienza nell’analisi di miscele più o meno complesse

c) Possibilità di utilizzo dell’HF-FlFFF all’interno di un sistema cromatografico multidimensionale accoppiato con uno spettrometro di massa, per sudi nel campo della proteomica.

Ringraziamenti

EfficenzaEfficenza in HF FlFFF in HF FlFFFEfficenzaEfficenza in HF FlFFF in HF FlFFF

van Bruijnsvoort, M.; Kok, W.Th; Tijssen, R. Anal Chem 2001, 73, 4736

0*

2

min 2LL

Dc

crHt LoDf

r

ipolylongneq

HinjHHHHH

FocalizzazioneFocalizzazione

L0

radV

inV outV

EluizioneEluizione

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0

100

%

13600 13700 13800 13900 14000 14100 14200 14300 14400 14500 14600 14700 14800 14900mass0

100

%

+8

+7

+9

Peso Molecolare misurato:14305.06±1.05 Da

14305.1

Spettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSASpettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSA

1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450m/z0

100

%

60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000mass0

100

%

Peso Molecolare misurato:66399.53±4.38 Da

66399.53

Liso+8Liso+7

+40

+35

+30

+27

+43

Spettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozimaSpettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozima