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BIOLOGIA MOLECOLARE

ESTRAZIONE: AA1001 E AA898 NON COMPRESE

Interleuchina 28-B Real Time Test (FRET)

Analisi genetica dei polimorfismi

rs12979860 e rs8099917

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 SITO INTERNET: www.nlm.it – E-MAIL: info@nlm.it

NLM 6371 VER 03/04/2012

AA1181 50 TEST

MQI013-3

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Lindh et al. Journal of Viral Hepatitis 2011

UTILIZZO Il kit fornisce il materiale necessario per la genotipizzazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) presenti nel gene dell’interleuchina 28B (rs12979860 e rs8099917) associati alla risposta alla terapia interferonica in pazienti affetti da HCV (genotipo 1) .

Il prodotto è compatibile con gli strumenti Rotorgene 3000, 6000 e Q, i sistemi di estrazione su colonnina (cod NLM AA1001, “QIAamp DNA blood Mini kit” Qiagen) ed Estrazione Rapida (cod. NLM AA898), sistemi da ordinare a parte.

SPECIFICITA’ La specificità del test è del 100%

INTRODUZIONE Circa 170 milioni di persone nel mondo sono affette da HCV e tale infezione è la causa principale dell’epatite cronica che spesso evolve in cirrosi o carcinoma epatocellulare. Attualmente la terapia standard nel trattamento dell’epatite è rappresentata dall’associazione tra peg-interferone e ribavirina (PEG-RBV), ma solo nel 50% dei pazienti affetti da HCV di genotipo 1 (il più frequente nella popolazione caucasica) si osserva una remissione virale sostenuta (SVR); oltretutto questi farmaci comportano gravi effetti collaterali che richiedono talvolta la sospensione o la modifica della dose somministrata. Molteplici studi hanno dimostrato che l’esito di tale terapia è influenzato sia dal genotipo virale che da cause legate all’ospite. L’identificazione di fattori predittivi della risposta terapeutica quindi si presenta come un valido approccio per la determinazione dei candidati più adatti a questo tipo di cura; a tal proposito, studi di associazione genome-wide hanno evidenziato come la variabilità genetica del paziente possa influenzare la risposta al trattamento farmacologico. Studi indipendenti hanno individuato una regione del gene IL28B sul cromosoma 19 che codifica per la proteina INF-λ3 implicata nella risposta immunitaria contro HCV. In particolare in questa regione sono emersi due polimorfismi (rs12979860 e rs8099917) fortemente associati alla variabilità interindividuale.

Molteplici studi hanno dimostrato che le due varianti correlano con un’aumentata SVR in pazienti con infezione da HCV di genotipo 1. La riduzione di HCV-RNA dopo 7 giorni di terapia si è dimostrata più pronunciata in pazienti con C/C (rs12979860) o T/T (rs8099917) rispetto a soggetti portatori delle altre due varianti. I due SNPs sono in linkage disequilibrium (D_ = 1, r2 = 0,44), ma il C/C (rs12979860) è meno comune (43% vs 71%) rispetto al genotipo T/T (rs8099917). I portatori degli alleli favorevoli mostrano dopo un mese di terapia, elevate percentuali di SVR rispetto a quelli con CT o TT (rs12979860) e GG (rs8099917); la frequenza del genotipo GG di rs8099917 inoltre è significativamente più elevata nel gruppo dei soggetti non-responder (NR).

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Lindh et al. Journal of Viral Hepatitis 2011

Ciò si verifica anche e nonostante la presenza di alta carica virale al basale, età elevata o fibrosi epatica grave. La clearance virale sembra perciò significativamente influenzata dai polimorfismi indipendentemente dai fattori predittivi tradizionali. In particolare, gli individui portatori degli alleli protettivi in questo locus genetico hanno una probabilità di eliminare l'infezione del virus doppia rispetto ai non portatori, e, anche se non arrivano ad eradicarlo, rispondono alla terapia in modo molto più efficace. Una valutazione di questi SNPs in combinazione con gli altri fattori predittivi tradizionali di risposta terapeutica possono permettere di suddividere i pazienti in cosiddetti “non responder”, per i quali dovrà essere valutata la possibilità di somministrare terapie alternative anche in base ai nuovi farmaci antivirali presenti, e pazienti invece “responder” con genotipo favorevole, ai quali può essere somministrata la terapia standard magari personalizzandola in termini di durata.

Referenze bibliografiche 1. Lindh et al. IL28B polymorphisms determine early viral kinetics and treatment outcome in patients receiving

peginterferon/ribavirin for chronic hepatitis C genotype1.Journal of Viral Hepatitis, 2011 2. Villano SA, Vlahov D, Nelson KE, et al.: Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after

acute hepatitis C infection. Hepatology 1999, 29:908–914. 3. Thomas DL, Astemborski J, Rai RM, et al.: The natural history of hepatitis C virus infection: host, viral, and

environmental factors. JAMA 2000, 284:450–456. 4. Thomas DL, Thio CL, Martin MP, et al.: Genetic variation inIL28B and spontaneous clearance of hepatitis C

virus. Nature 2009, 461:798–801. 5. McHutchison JG, Lawitz EJ, Shiffman ML, et al.: Peginterferon alfa-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of

hepatitis C infection. N Engl J Med 2009, 361:580–593. 6. Rauch A, Kutalik Z, Descombes P, et al.: Genetic variation inIL28B is associated with chronic hepatitis C and

treatment failure: a genome-wide study. Gastroenterology 2010, 138:1338–1345. 7. Grebely J, Petoumenos K, Hellard M, et al.: Potential role forIL28B genotype in treatment decision-making in

recent hepatitis C virus infection. Hepatology 2010, 52:1216–1224. 8. McCarthy JJ, Li JH, Thompson A, et al.: Replicated association between an IL28B gene variant and a sustained

response to pegylated interferon and ribavirin. Gastroenterology 2010,138:2307–2314. 9. Thompson AJ, Muir AJ, Sulkowski MS, et al.: Interleukin-28Bpolymorphism improves viral kinetics and is the

strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in genotype1 hepatitis C virus. Gastroenterology 2010, 139:120–129.

10. PearlmanBL. The IL-28 Genotype: How it will affect the care of patients with Hepatitis C Virus infection. Curr Gastrenterol Rep 2011, 13:78-86.

PRINCIPIO DEL TEST Il test si basa sulla Real Time PCR, tecnica che permette di monitorare in tempo reale l’amplificazione dei campioni d’interesse. L’andamento della PCR viene seguito mediante la quantificazione della fluorescenza emessa da molecole legate a sonde di ibridazione (specifiche per la sequenza di DNA d’interesse) in seguito al trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET). Il DNA estratto viene fatto amplificare in presenza di due sonde adiacenti e complementari alla regione che comprende la mutazione: la sonda posizionata in 5’ è marcata col fluoroforo donatore, la sonda in 3’ porta invece il fluoroforo accettore. Quando le sonde si appaiano al DNA i due fluorofori vengono a trovarsi in prossimità e, in presenza di una fonte luminosa, si ha il trasferimento di energia dal donatore all’accettore, il quale a sua volta emette un segnale luminoso ad una specifica lunghezza d’onda che ci indica l’andamento della PCR.

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In assenza del bersaglio non avviene il trasferimento di energia; la quantità di coppie di sonde ibridate ed il conseguente segnale luminoso aumentano proporzionalmente al prodotto di PCR. Le sonde di ibridazione permettono di identificare varianti della sequenza bersaglio mediante la curva di dissociazione (melting curve), sottoponendo l’amplificato ad una rampa crescente di temperatura con conseguente distacco delle sonde dal DNA. Se la sonda in 5’ è complementare al filamento mutato di DNA, l’ibridazione tra i due sarà più stabile rispetto al duplex tra la sonda medesima ed il filamento che non porta la mutazione (single point mismatch), con conseguente picco di dissociazione ad una temperatura più elevata. Mediante l’analisi della curva di melting si possono pertanto distinguere i tre genotipi in base alla posizione dei picchi: singoli a due diverse temperature, per i campioni omozigoti (normale/mutato); doppio per l’eterozigote.

a) Il trasferimento dell’energia di risonanza (E) è basso quando le sonde non sono appaiate al DNA

b) L’ibridazione delle sonde determina l’avvicinamento tra il fluoroforo donatore (D) e l’accettore (A), con conseguente incremento del trasferimento dell’energia di risonanza

COMPONENTI DEL KIT

MODULARITA’ DEL KIT: 10 tests per seduta Nota:

il kit contiene i reagenti necessari per l’esecuzione di 5 sedute da almeno 10 tests l’una. Il non rispetto della modularità indicata e l’uso del kit con una modularità inferiore, comporta l’insufficienza dei reagenti necessari all’uso di tutti i test previsti dal kit.

Reagenti Quantità vials Volume/vial Mix 1 5x 10 test 280µl

Mix 2 rs12979860 (tappo rosso) 5x 10 tests 120µl

Mix 2 rs8099917 (tappo blu) 5x 10 tests 120µl

Enzima di amplificazione abbinato: tappo di colore verde. Tutti i reagenti vanno conservati a -20°C. PRECAUZIONI I campioni vanno manipolati seguendo le buone pratiche di laboratorio e devono essere considerati come pericolosi in quanto potenziale fonte di infezione.

La procedura va eseguita utilizzando le buone pratiche di laboratorio ed i comuni dispositivi di protezione individuale. Utilizzare guanti monouso per ogni passaggio

Tutti i consumabili (puntali e provette) devono essere sterili. I puntali devono avere il filtro per evitare la contaminazione delle pipette. Utilizzare un nuovo puntale ogni volta che viene dispensato un volume.

Eliminare il materiale monouso utilizzato, i guanti indossati e tutti i reattivi come rifiuti speciali.

Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree preposte all’esecuzione del test.

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Se vi è esposizione di occhi, cute o mucose alle sostanze utilizzate, lavare abbondantemente con acqua e contattare al più presto un medico.

E’ opportuno assicurare una temperatura il più possibile costante ed uniforme in laboratorio ed evitare di posizionare gli strumenti in prossimità di fonti di calore/raffreddamento che possano comprometterne il corretto funzionamento.

MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO Strumento per amplificazione in “Real-Time” .

Cappa a flusso laminare.

Set di pipette a volume variabile.

AMPLIFICAZIONE

IMPORTANTE!

Prima di iniziare la seduta, verificare la modularità di utilizzo del kit nel paragrafo “Componenti del kit”. ATTENZIONE:

Mantenere in ghiaccio tutti i reagenti per l’amplificazione durante l’esecuzione dell’intera procedura.

L’utilizzo di campioni di sangue o di estratti che abbiano subito ripetuti scongelamenti o un’impropria conservazione può pregiudicare l’esito positivo del test.

Evitare ripetuti scongelamenti delle mix. Le sonde contenute nella Mix 2 sono fotosensibili: evitare l’esposizione prolungata alla luce. Utilizzare solo provette da PCR dedicate: Provette da 0,2 ml con tappo piatto per RotorGene 3000, 6000 o Q.

Impostare il profilo termico (vedi paragrafi successivi) prima

di preparare le mix.

Preparare la mix di amplificazione come segue: Reagenti Volume (1 reazione)

Mix 1 10,75µl

Mix 2 rs12979860 10µl Taq polimerasi (tappo verde) 5 U/µl 0,3µl

Reagenti Volume (1 reazione) Mix 1 10,75µl

Mix 2 rs8099917 10µl Taq polimerasi (tappo verde) 5 U/µl 0,2 µl

Si consiglia di preparare la mix di amplificazione per un quantitativo di test pari al numero di campioni +1 (per n ≤ 10) o + 2 (per n >10). Miscelare la soluzione ottenuta evitando la formazione di schiuma. Dispensare 21 µl di mix di amplificazione in ciascuna provetta precedentemente marcata . Aggiungere 4 µl di DNA (La concentrazione del DNA estratto da analizzare deve essere di circa 30-40 ng/µl). Se si effettua una seduta mista si consiglia di posizionare le provette nel rotore nel seguente ordine: rs12979860 poi rs8099917.

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IMPOSTAZIONE DEL PROFILO TERMICO E ANALISI DEI RISULTATI:

ROTORGENE CORBETT 3000, 6000 e Q

Posizionare le provette nel rotore del Rotor Gene, chiudere il coperchio dello strumento ed utilizzando la funzione “Edit Samples” programmare la posizione delle provette.

Nella funzione “Setting” impostare il volume di reazione (25 µl) ed il rotore utilizzato (36/72 pozzetti); controllare che nella finestra “Channels” sia riportato il canale fret 1 (Source 470 nm, Detector 610 hp), altrimenti impostarlo cliccando su “Create new”.

Nella funzione “ View → gain calibration” impostare l’autocalibrazione a 54°C sul canale fret 1 (Min reading 20 FI; Max reading 25 FI) e selezionare l’icona “Perform calibration before first acquisition”.

Nella funzione “Profile” impostare il profilo termico come segue:

Cycle

Per il Rotor Gene 3000:

Cycle Point Denature: 95°C, 2 min Cycling (45 repeats) Step 1: 95°C, 20 sec

Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret 1). Activate the Touchdown box and select 0,2°C for 30cycles

Step 3: 72°C, 20 sec Hold: 95°C20 sec Hold 2: 45°C, 1 min Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

Nella fase “Melt”, lasciare impostato l’aumento della temperatura a 1 grado per volta: non variare il parametro pre-impostato

Cycle

Per il Rotor Gene 6000 e Q

Cycle Point Denature: 95°C, 2 min Cycling (45 repeats) Step 1: 95°C, 20 sec

Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret 1). Activate the Touchdown box and select 0,2°C for 30 cycles

Step 3: 72°C, 20 sec Hold: 25°C, 3 min Hold: 95°C, 20 sec Melt: (45-80°C), hold 90 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

Selezionare la casella “Gain optimisation” e impostare “90” come valore massimo di fluorescenza RG3000 e 6000/Q: Nella fase “Melt”, lasciare impostato l’aumento della temperatura a 1 grado per volta: non variare il parametro pre-impostato! Avviare l’esperimento ciccando su “Start”. La seduta dura circa 110 minuti.

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INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Cliccare su “Analysis” e scegliere l’opzione “Melt”: si aprirà la finestra col grafico che illustra l’analisi effettuata dal software. Effettuare l’analisi di un polimorfismo per volta.

I picchi del polimorfismo rs8099917 potrebbero essere più alti di quelli del rs12979860; benché ciò non vada in alcun modo ad inficiare il risultato finale, analizzandoli uno per volta si ottengono risultati migliori.

Sul grafico sono rappresentate le curve di melting di ciascun campione che possono avere:

rs12979860

un singolo picco in corrispondenza di 65± 1,5°C per i campioni omozigoti TT;

un singolo picco in corrispondenza di 58± 1,5°C per i campioni omozigoti CC;

un doppio picco per i campioni eterozigoti.

rs8099917

un singolo picco in corrispondenza di 62,5°C± 1,5°C per i campioni omozigoti GG;

un singolo picco in corrispondenza di 54,5°C± 1,5°C per i campioni omozigoti TT;

un doppio picco per i campioni eterozigoti.

NON CONSIDERARE I PICCHI CHE CADONO AL DI FUORI DEL RANGE INDICATO

Per ottenere la tipizzazione dei campioni selezionare “New bin”: sul grafico comparirà un cursore che va posizionato in corrispondenza del primo picco (bin A); selezionare width in cycles 3; ripetere l’operazione per il secondo picco (bin B).

- rs12979860: cliccare sull’icona “ Genotypes ”: si aprirà una finestra dove vanno impostate le voci omozigote CC (bin A), eterozigote (bin A, bin B) e omozigote TT (bin B).

- rs8099917: cliccare sull’icona “ Genotypes ”: si aprirà una finestra dove vanno impostate le voci omozigote TT (bin A), eterozigote (bin A, bin B) e omozigote GG (bin B).

Ciccare su “Report” per ottenere il risultato finale. Ripetere la stessa procedura per l’altro polimorfismo. Esempio di analisi eseguita sui differenti tipologie di campioni:

Fig. 1: rs12979860

bin A

bin B

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Fig. 2: rs8099917

ATTENZIONE:

• Se la tipizzazione riportata nel Report finale non corrisponde ai picchi rappresentati graficamente bisogna alzare la soglia in modo da escludere dall’analisi il segnale di fondo, eliminando così le eventuali interferenze che falsano il risultato. Per fare ciò cliccare sulla finestra “Threshold”: sul grafico comparirà un cursore per lo spostamento della soglia (linea blu). Esempio:

fig. 1 (soglia = 0) ⇒ tipizzazione errata (eterozigote)

fig. 2 (soglia = 0,44) ⇒ tipizzazione corretta (omozigote)

FIG.1

FIG.2

bin A

bin B

bin A

bin B

bin A

bin B

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• Se l’ampiezza dei picchi non è elevata si può ripetere lo step di melting sugli stessi amplificati aumentando il gain:

a) selezionare l’icona “New” per effettuare un nuovo esperimento

b) nella funzione “Profile” impostare il profilo termico come segue (durata 15 minuti circa): Cycle Denature: 95°C, 30 sec Hold: 45°C, 1 min Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

c) nella funzione “ View → gain calibration” deselezionare l’autocalibrazione

d) selezionare l’icona “Gain” ed aumentare il valore corrispondente a fret1 di una unità

e) far partire l’esperimento.

Solo per il Rotor Gene 3000

• Se il segnale registrato durante la rampa di melting (raw data) è a saturazione (fig. a sinistra) si rischia di perdere parte dei picchi, con conseguente tipizzazione scorretta; la melting va pertanto ripetuto come indicato

:

nel paragrafo precedente ma diminuendo il gain (fig. a destra). Esempio:

ATTENZIONE

Se si utilizzano campioni di sangue o DNA estratto scongelati più volte o conservati scorrettamente si potrebbero ottenere dei picchi piuttosto bassi o addirittura l’amplificazione potrebbe non avvenire. Si consiglia pertanto l’utilizzo di campioni freschi o congelati non più di una volta.

SICUREZZA Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle zone di lavoro. Utilizzare guanti nel maneggiare

reagenti e campioni.

Considerare tutti i campioni biologici come potenzialmente capaci di trasmettere infezioni. Pulire e disinfettare tutte le superfici che siano venute a contatto con i campioni.

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MOLECULAR BIOLOGY

EXTRACTION: AA1001 AND AA898 NOT INCLUDED

Interleukin 28-B Real Time Test (FRET)

Genetic analysis of polymorphisms

rs12979860 and rs8099917

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 WEB: www.nlm.it – E-MAIL: info@nlm.it

NLM 6371 VER 03/04/2012

AA1181 50 TEST

MQE013-3

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Lindh et al. Journal of Viral Hepatitis 2011

INTENDED USE This kit is an in vitro diagnostic test for genotyping single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the Interleukin 28-B gene (rs12979860 e rs8099917) involved in the different response to interferon-based therapy of HCV (genotype 1) infected patients. This product is compatible with Rotorgene 3000, 6000 and Q (Corbett Research), column based extraction kit (cod NLM AA1001, “QIAamp DNA blood Mini kit” Qiagen) and with the NLM Rapid Extraction (cod. NLM AA898).

SPECIFICITY

Test specificity 100%.

INTRODUCTION Over 170 million people worldwide are infected with the hepatitis C virus (HCV) and it has become the most common cause of liver-related death in the United States. Although the standard-of-care treatment for chronic HCV infection is interferon (IFN)-based therapy, only about half of patients with genotype 1 infection achieve sustained virologic response (SVR) to peg-interferon/ribavirin. Recent genome-wide association studies have identified single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in or near the interleukin-28 gene that help define variants in treatment response. The IL28-B gene on chromosome 19 codes for INF-λ3, a protein involved in the immunological response to HCV. Investigators have begun to reveal the genetic basis for not only differential responses to HCV treatment but also for discrepant rates of spontaneous viral clearance when patients are exposed to the HCV. Several studies focused in particular on two polymorphisms (rs12979860 and rs8099917) involved in the response to standard therapy.

Different researcher suggested that the two variants correlate with SVR during treatment and natural viral clearance in patients infected with HCV genotype 1. The reduction of HCV RNA after 7 days of treatment was more pronounced in patients with C / C (rs12979860) or T / T (rs8099917) than subjects with the other two variants. The two SNPs are in linkage disequilibrium (D_ = 1, r2 = 0.44), but the C/C of rs12979860 is less common than the T/T of rs8099917. Patients carrying both favourable genotypes achieved lower levels of HCV RNA at week 4 than those with CT or TT at rs12979860 and GG rs8099917 and this independently of baseline viral load, age or high or severe liver fibrosis. GG genotype frequency of rs8099917 is significantly more frequent in the group of non-responder subjects. Viral clearance seems therefore influenced by polymorphisms independently of traditional predictors. In particular, individuals carrying the protective alleles in these loci have the double chance to eliminate the viral infection than non-carriers, and their response to the standard treatment is much more effective. A combined assessment of these SNPs in conjunction with standard response predictors may better foretell the outcome in difficult-to-treat patients, thereby sparing them the expense and side effects of a treatment that would be unlikely to be beneficial. These patients could be given the possibility of receiving alternative therapies, like the next discovered antiviral drugs.

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Lindh et al. Journal of Viral Hepatitis 2011

REFERENCES

1. Lindh et al. IL28B polymorphisms determine early viral kinetics and treatment outcome in patients receiving peginterferon/ribavirin for chronic hepatitis C genotype1.Journal of Viral Hepatitis, 2011

2. Villano SA, Vlahov D, Nelson KE, et al.: Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after acute hepatitis C infection. Hepatology 1999, 29:908–914.

3. Thomas DL, Astemborski J, Rai RM, et al.: The natural history of hepatitis C virus infection: host, viral, and environmental factors. JAMA 2000, 284:450–456.

4. Thomas DL, Thio CL, Martin MP, et al.: Genetic variation inIL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus. Nature 2009, 461:798–801.

5. McHutchison JG, Lawitz EJ, Shiffman ML, et al.: Peginterferon alfa-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of hepatitis C infection. N Engl J Med 2009, 361:580–593.

6. Rauch A, Kutalik Z, Descombes P, et al.: Genetic variation inIL28B is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: a genome-wide study. Gastroenterology 2010, 138:1338–1345.

7. Grebely J, Petoumenos K, Hellard M, et al.: Potential role forIL28B genotype in treatment decision-making in recent hepatitis C virus infection. Hepatology 2010, 52:1216–1224.

8. McCarthy JJ, Li JH, Thompson A, et al.: Replicated association between an IL28B gene variant and a sustained response to pegylated interferon and ribavirin. Gastroenterology 2010,138:2307–2314.

9. Thompson AJ, Muir AJ, Sulkowski MS, et al.: Interleukin-28Bpolymorphism improves viral kinetics and is the strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in genotype1 hepatitis C virus. Gastroenterology 2010, 139:120–129.

10. PearlmanBL. The IL-28 Genotype: How it will affect the care of patients with Hepatitis C Virus infection. Curr Gastrenterol Rep 2011, 13:78-86.

TECHNOLOGICAL PRINCIPLE The test is based on the Real Time PCR, a technology that allows monitoring in real time of the amplification process. Hybridization of the specific fluorescent probes to the target DNA results in fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two fluorophores. Extracted DNA is amplified in the presence of two contiguous probes that are both complementary to the sequence which contains the mutation: probes at the 5’ is marked by a donor-fluorophore, probe in 3’ carries the acceptor-fluorophore. During the PCR, probes hybridizes to the target DNA and fluorophores are very closer; in presence of a source of light there is the energy transfer from the donor to the acceptor which emits a signal (with a specific wavelength) that allows monitoring of the PCR process. Emitted signals are proportional to the accumulation of PCR product. Without a target DNA no energy transfer is possible. Hybridization probes allow identification of mutations in the target sequence through the melting curve analysis; PCR product is submitted to a crescent temperature with consequent detachment of the probes from the DNA. Because the probe is an exact complement of the mutant sequence, mutant templates will form stronger hybrids with the probe and will consequently melt at a higher temperature than wild type templates. The distinctly different melting temperatures of the two possible hybrids allow identification of each unknown sample as mutant, wild type, or heterozygous (one allele of mutant and one allele of wild-type sequence). a) Resonance energy transfer (E) is low when probes are dissociated from target DNA

b) During the hybridization step, donor-fluorophore(D) and acceptor-fluorophore(A) are closer with consequent increment of the resonance energy transfer

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MATERIALS PROVIDED TESTS/RUN: this kit is optimized for use with 10 test/run Note: kit contains all necessary reagents required for at least 10 tests/run in 5 distinct experiments Use with a number of tests lower than 5 in each single run, may lead to the impossibility to use all the tests provided with the kit.

Reagents Vials number Volume/vial Mix 1 5 X 10 tests 280µl

Mix 2 rs12979860 (red cap) 5 X 10 tests 120µl

Mix 2 rs8099917 (blue cap) 5 X 10 tests 120µl

Amplification enzyme assigned: green cap. All reagents must be stored at -20°C.

WARNINGS Perform the procedure using universal precautions and handle samples as if capable of transmitting infection.

Handle this product according to established good laboratory practices and universal precautions; wear personal protective apparel, including disposable gloves, throughout the assay procedure. Dispose gloves as bio hazardous waste.

All disposable items (tips and tubes) must be sterile. Use aerosol-resistant pipette tips to avoid pipettes contamination. Use a new tip every time a volume is dispensed.

Discard all used material as bio hazardous waste.

Do no eat, drink, smoke or apply cosmetics in areas where reagents or specimens are handled.

In case of contact with reagents rinse immediately with water and seek medical advice.

It is advisable to have constant and uniform laboratory temperature, avoid to place the instruments near heating/cooling sources that may compromise the right working.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Real Time PCR instruments .

Vertical down-flow airbox

Adjustable micropipettes set

AMPLIFICATION STEP Warning! Before starting check modularity in the “ Materials Provided” paragraph! Note:

Avoid repeated thawn of amplification mix.

Avoid using blood sample after repeated thawing procedures or not correctly stored in order to avoid bad assay results.

Specific probes in the Mix 2 are photosensitive: avoid direct and prolonged exposure to light.

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Use only dedicated PCR tubes

no-domed tube 0.2 ml (RotorGene 3000, 6000 or Q)

:

Set the term profile (see paragraphs below) before

Prepare the amplification mix as follow:

starting to prepare the mix.

Reagents Volume (1 reaction)

Mix 1 10,75µl

Mix 2 rs12979860

10 µl

Taq polimerase (green cap)5 U/µl 0,3 µl

Reagents Volume (1 reaction) Mix 1 10,75µl

Mix 2 rs8099917 10 µl

Taq polimerase (green cap)5 U/µl 0,2 µl

Prepare the amplification mix for “n”+1 samples ( if “n” ≤ 10) or + 2 (if “n” >10). Mix gently by pipetting up and down in order to avoid foam formation Pipette 21 µl of amplification mix in each tube (previously marked) Add 4 µl of DNA sample

(DNA concentration to be used in this test should be 30-40 ng/µl)

We recommend in case of assay(s) with multiple coagulation factors to sort tubes in the rotor as follows: rs12979860 then rs8099917. .

TERM PROFILE SETTING AND ANALISYS

ROTORGENE 3000, 6000 and Q

Place tubes in the RotorGene and close the lid; use the software function “Edit Samples” in order to insert samples positions.

In the “Setting” section set the “reaction volume” to 25 µl and select the used rotor (36/72 position). Check in the “Channels” window if fret 1(Source 470 nm, Detector 610 hp) is already present, otherwise click on “Create new” in order to insert it.

In the menu “ View → gain calibration” set autocalibration temperature to 54°C on channel fret 1 (Min reading 20 FI; Max reading 25 FI) and activate the checkbox “Perform calibration before first acquisition”.

In the “Profile” section set “thermal-profile” as follow:

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Cycle

RotorGene 3000

Cycle Point Denature: 95°C, 2 min Cycling (45 repeats) Step 1: 95°C, 20 sec Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret 1). Activate

the Touchdown box and select 0,2°C for 30 cycles Step 3: 72°C, 20 sec Hold: 95°C, 20 sec Hold 2: 45°C, 1 min Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

In “melt” step, keep selected 1 degree in temperature increasing parameter: do not change the pre-selected parameter!

Cycle

RotorGene 6000 and Q

Cycle Point Denature: 95°C, 2 min Cycling (45 repeats) Step 1: 95°C, 20 sec Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret 1). Activate

the Touchdown box and select 0,2°C for 30 cycles Step 3: 72°C, 20 sec Hold: 25°C, 3 min Hold: 95°C, 20 sec Melt: (45-80°C), hold 90 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

Select the option “Gain optimisation” and enter “90” as maximum fluorescence value RG3000 and 6000/Q: In “melt” step, keep selected 1 degree in temperature increasing parameter: do not change the pre-selected parameter!.

Run the assay by clicking the “Start” button . Assay length is approximately 110 minutes.

INTERPRETATION OF RESULTS Click “Analysis” and select the “Melt” option: a window with the graphic analysis of the assay will be displayed . IMPORTANT: Analyze each polymorphism separately.

The curves of rs8099917 could be higher than those of rs12979860; although this doesn’t invalidate the final result, when analyzing the two polymorphisms separately, you’ll have better curves. The graph shows the melting-curve of each sample(s) that could be:

rs12979860

a single peak at 65 ± 1,5°C for homozygous TT

a single peak at 58 ± 1,5°C for homozygous CC

a double peak for heterozygous samples

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rs8099917 a single peak at 62,5 ± 1,5°C for homozygous GG

a single peak at 54,5 ± 1,5°C for homozygous TT

a double peak for heterozygous samples

In order to obtain the typing samples select “New bin”: on the graph will appear a cursor that must be placed in correspondence of the 1

DO NOT CONSIDER PEAKS OUT OF THE TEMPERATURE RANGE

st peak (Bin A); set the width in cycles at 3; repeat the same operation for the 2nd

- rs12979860: homozigous CC (bin A), heterozigous (bin A, bin B) and homozigous TT (bin B).

peak (Bin B). Click the “Genotypes” icon; a new window will be displayed. Set item as follow:

- rs8099917: homozigous TT (bin A), heterozigous (bin A, bin B) and homozigous GG (bin B). Click “Report” in order to obtain the final result.

Example of analysis performed on different samples

Fig. 1: rs12979860

Fig. 2: rs8099917

bin A

bin B

bin A

bin B

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WARNING • If there is a mismatch between typization in the final-Report and peaks on the graph adjustment of the

threshold-line is required in order to exclude background-signal causing erroneous results. Click on the “Threshold” window: on the graph will appear a cursor required for adjusting of the threshold-value (blue-line).

Example:

fig. 1 (threshold = 0) ⇒ incorrect typization (heterozygous sample) fig. 2 (threshold = 0,44) ⇒ correct typization (homozygous sample)

FIG. 1

FIG. 2

• If “peak(s) amplitude” isn’t good (peaks too low), it’s possible to increase the “gain-value” and repeat the melting step on the same PCR-product:

f) select the “New” icon in order to perform a new assay

g) in the “Profile” function set “thermal-profile” as follow (lenght about 15 minutes):

Cycle Denature: 95°C, 30 sec Hold: 45°C, 1 min Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 5 sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

bin A

bin B

bin A

bin B

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h) in “ View → gain calibration” deselect autocalibration

i) Select the “Gain” icon and increase the fret1-value of 1 unit

j) Start the assay

• If the signal registered during the melting-ramp (raw-data) leads to saturation (see fig. on the left) there is a significant risk to lose peaks, with consequent erroneous typization; in this case repeat the assay as previous described but decreasing the gain-value ( see fig. on the right)

Only for RotorGene 3000

Example:

WARNING • Do not use blood samples or DNA which has been kept frozen for more than one year, or gone trough many

freeze-thaw cycles in order to avoid low peaks or problem related to the amplification step. We recommend the use of fresh blood o frozen samples thawn only one time.

SAFETY

Do not eat, drink smoke or make up in working areas. Use disposable latex gloves when handling reagents and samples. Do not pipette with mouth. Consider any biological samples as potentially dangerous and infected. Clean and disinfect each surface

where biological samples were handled.

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LEGEND

Lot number

Catalogue number

Temperature limitation

Use by

Consult instruction for use

European Conformity

In vitro diagnostic device

Control