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SCIENZE NATURALI ED UMANESCIENZE NATURALI ED UMANESCIENZE NATURALI ED UMANESCIENZE NATURALI ED UMANE

Ambiente fisico e biologico: interazioni con le attività umane

nel passato e nel presente

UNITA’ BIOMEDICA: La UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia applicata alle Microscopia applicata alle scienze biomediche, quale scienze biomediche, quale

mezzo di studio per l’ambiente mezzo di studio per l’ambiente biologico.biologico.

UNITA’ BIOMEDICA: La UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia applicata alle Microscopia applicata alle scienze biomediche, quale scienze biomediche, quale

mezzo di studio per l’ambiente mezzo di studio per l’ambiente biologico.biologico.

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SommarioSommarioParte Teorica (1Parte Teorica (1a a lezione)lezione)

1) Il microscopio ottico come punto di partenza1) Il microscopio ottico come punto di partenza

2) Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: 2) Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: Principi di funzionamento di TEM e SEMPrincipi di funzionamento di TEM e SEM

3) Il microscopio confocale (CLSM): principi di 3) Il microscopio confocale (CLSM): principi di funzionamentofunzionamento

4) Principi di immunocitochimica: metodiche di 4) Principi di immunocitochimica: metodiche di evidenziazione di molecole e strutture cellulari per evidenziazione di molecole e strutture cellulari per l’osservazione al CLSMl’osservazione al CLSM

5) Esempi applicativi di TEM, SEM e confocale a 5) Esempi applicativi di TEM, SEM e confocale a ricerche in campo biomedicoricerche in campo biomedico

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Scala logaritmica delle dimensioniScala logaritmica delle dimensioniScala logaritmica delle dimensioniScala logaritmica delle dimensioni

1mm1mm

100 100 mm

10 10 mm

0,01 0,01 m (100 m (100 ) )

0,0001 0,0001 m (1 m (1 ))

Cellule epiteliali 40 Cellule epiteliali 40 mm

1 1 mmBatteri 2Batteri 2mm

Emazie 6-7 Emazie 6-7 mm

0,1 0,1 m (1000 m (1000 ))Micoplasmi 0,1-0,2 Micoplasmi 0,1-0,2 mm

Virus 0,1-0,01Virus 0,1-0,01mm

ProteineProteine 0,005-0,010,005-0,01mm

0,001 0,001 m (10 m (10 )) AminoacidiAminoacidi 8-12 8-12

AtomiAtomi 1-4 1-4

Limite dell’occhio Limite dell’occhio umanoumano75 75 mm

Limite Limite microscopio microscopio ottico a luce ottico a luce

biancabianca 11mmLimite Limite

microscopio microscopio ottico a luceottico a luceultraviolettaultravioletta

0,2-0,10,2-0,1mm

Limite Limite microscopio microscopio elettronicoelettronico

4 4

Onde Onde radioradio

InfrarossoInfrarosso

VisibileVisibile

UltraviolettoUltravioletto

4

Il microscopio ottico Il microscopio ottico come punto di come punto di

partenzapartenza

Il microscopio ottico Il microscopio ottico come punto di come punto di

partenzapartenzaUn po’ di storia...Un po’ di storia...

Microscopio ottico semplice: 5 secoli faMicroscopio ottico semplice: 5 secoli fa

Microscopio ottico composto: alla fine del 1600 ad Microscopio ottico composto: alla fine del 1600 ad opera dei fratelli Jonssen in Olanda e Galileo Galilei in opera dei fratelli Jonssen in Olanda e Galileo Galilei in Italia Italia Dal 18° secolo in poi la microscopia ottica ha raggiunto Dal 18° secolo in poi la microscopia ottica ha raggiunto livelli di grande qualità, dovuti allo sviluppo di livelli di grande qualità, dovuti allo sviluppo di componenti ottici e meccanici.componenti ottici e meccanici.

Dalla fine 19° secolo la competizione ha permesso Dalla fine 19° secolo la competizione ha permesso una produzione qualitativamente alta e a prezzi una produzione qualitativamente alta e a prezzi contenuticontenuti

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Dal microscopio ottico Dal microscopio ottico al microscopio al microscopio

elettronico: Principi di elettronico: Principi di funzionamento di TEM funzionamento di TEM

e SEMe SEM

Dal microscopio ottico Dal microscopio ottico al microscopio al microscopio

elettronico: Principi di elettronico: Principi di funzionamento di TEM funzionamento di TEM

e SEMe SEM

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Un po’ di storia...Un po’ di storia...Berlino 1931Berlino 1931: Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), : Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), intuisce che un campo elettromagnetico funzionava intuisce che un campo elettromagnetico funzionava come una lente per gli elettroni.come una lente per gli elettroni.

7 Aprile 19317 Aprile 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max : Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico (17.400 X) (17.400 X) Nascita della Microscopia ElettronicaNascita della Microscopia Elettronica

1933:1933: E. Ruska sviluppa il vero prototipo di E. Ruska sviluppa il vero prototipo di Microscopio Elettronico a Trasmissione (Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEMTEM))

19391939: : TEMTEM disponibile sul mercato disponibile sul mercato

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

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Un po’ di storia...Un po’ di storia...Un po’ di storia...Un po’ di storia...

Tra il 1935 e 1938Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini : M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia della superficie di un relative alla topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico a costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (Scansione (SEMSEM).).

19381938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo : in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumentostrumento

19651965 il SEM diventa commercialmente disponibile il SEM diventa commercialmente disponibile

Microscopio elettronico a scansione (SEM)Microscopio elettronico a scansione (SEM)

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Confronto tra MO, TEM e SEMConfronto tra MO, TEM e SEMConfronto tra MO, TEM e SEMConfronto tra MO, TEM e SEM

OtticoOtticoOtticoOttico ElettronicElettronico o a a scansionescansione

ElettronicElettronico o a a scansionescansione

Elettronico Elettronico a a trasmissionetrasmissione

Elettronico Elettronico a a trasmissionetrasmissione

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Microscopio Elettronico Microscopio Elettronico a Trasmissionea Trasmissione

Microscopio Elettronico Microscopio Elettronico a Trasmissionea Trasmissione

REQUISITI DEL CAMPIONEREQUISITI DEL CAMPIONE: : sezioni sottili (60-80nm) di sezioni sottili (60-80nm) di materiale incluso in resine plastiche, oppure preparati liberi materiale incluso in resine plastiche, oppure preparati liberi di spessore molto limitato.di spessore molto limitato.

INFORMAZIONI OTTENIBILIINFORMAZIONI OTTENIBILI:: relative alla struttura interna del relative alla struttura interna del campione.campione.SISTEMA ILLUMINANTESISTEMA ILLUMINANTE: : sorgente ottenuta da un filamento di sorgente ottenuta da un filamento di tungsteno riscaldato sotto vuoto. Il fascio elettronico tungsteno riscaldato sotto vuoto. Il fascio elettronico originato viene focalizzato sul campione mediante lenti originato viene focalizzato sul campione mediante lenti elettromagnatiche.elettromagnatiche.SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINESISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: : l’immagine della l’immagine della zona osservata viene ottenuta in modo simultaneo su di un zona osservata viene ottenuta in modo simultaneo su di un apposito schermo fluorescente sotto il campione.apposito schermo fluorescente sotto il campione.

LIMITE DI RISOLUZIONELIMITE DI RISOLUZIONE:: in relazione ai parametri di in relazione ai parametri di osservazione scelti può essere molto elevato: 0,2-0,3nm.osservazione scelti può essere molto elevato: 0,2-0,3nm.

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Modificazioni subite da un Modificazioni subite da un fascio elettronico primario fascio elettronico primario

che interagisce con un che interagisce con un materialemateriale

Modificazioni subite da un Modificazioni subite da un fascio elettronico primario fascio elettronico primario

che interagisce con un che interagisce con un materialemateriale

DIFFUSIONE ELASTICA DIFFUSIONE ELASTICA (e(e- - - nucleo atomico): - nucleo atomico): Variazione di direzione senza apprezzabile perdita Variazione di direzione senza apprezzabile perdita

di energia.di energia.

DIFFUSIONE ANELASTICADIFFUSIONE ANELASTICA (e (e- - - e- e- - orbitale esterno orbitale esterno

atomo):atomo): Diminuzione di energia senza apprezzabile perdita di Diminuzione di energia senza apprezzabile perdita di

direzione.direzione.

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Segnali emessi da un campione Segnali emessi da un campione biologico colpito da un fascio di biologico colpito da un fascio di

elettroni elettroni

Segnali emessi da un campione Segnali emessi da un campione biologico colpito da un fascio di biologico colpito da un fascio di

elettroni elettroni Elettroni Secondari (SE)Elettroni Secondari (SE) fascio di elettroni primario - e fascio di elettroni primario - e- -

orbitali esterni. Bassa energia orbitali esterni. Bassa energia 50 eV. Informazioni da 50 eV. Informazioni da

stati superficiali (10stati superficiali (10nm) nm) MORFOLOGIA DI SUPERFICIEMORFOLOGIA DI SUPERFICIE

Elettroni Retrodiffusi o backscattered (BSE)Elettroni Retrodiffusi o backscattered (BSE) urti elastici Energia urti elastici Energia

50 eV. Informazioni di tipo compositivo o morfologico di 50 eV. Informazioni di tipo compositivo o morfologico di

strati profondi (alcuni strati profondi (alcuni m.m.

CatodoluminescenzaCatodoluminescenza presenza di sostanze luminescenti presenza di sostanze luminescenti

Radiazioni XRadiazioni X emissione di emissione di SE SE da orbitali interni: a seconda da orbitali interni: a seconda

dello spettro di r. X emesse si può risalire agli elementi dello spettro di r. X emesse si può risalire agli elementi

costituenti il campione (costituenti il campione (MICROANALISI)MICROANALISI)

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REQUISITI DEL CAMPIONEREQUISITI DEL CAMPIONE: : frammenti di materiale da pochi frammenti di materiale da pochi mmmm33 sino all’ordine di cm sino all’ordine di cm33 (per i campioni biologici, da (per i campioni biologici, da cellule in coltura a frammenti di tessuti).cellule in coltura a frammenti di tessuti).

INFORMAZIONI OTTENIBILIINFORMAZIONI OTTENIBILI:: relative, nella modalità principale relative, nella modalità principale di osservazione, alla superficie del campione, con la di osservazione, alla superficie del campione, con la formazione di immagini di aspetto tridimensionale.formazione di immagini di aspetto tridimensionale.

SISTEMA ILLUMINANTESISTEMA ILLUMINANTE: : stessa sorgente del TEMstessa sorgente del TEM

SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINESISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: : non esistono lenti non esistono lenti magnetiche al di fuori di quelle utilizzate per la magnetiche al di fuori di quelle utilizzate per la focalizzazione del fascio. L’immagine viene ottenuta sulla focalizzazione del fascio. L’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione.campione.LIMITE DI RISOLUZIONELIMITE DI RISOLUZIONE:: in relazione ai vari parametri di in relazione ai vari parametri di osservazione scelti può essere da 5 a 30nm.osservazione scelti può essere da 5 a 30nm.

Microscopio Elettronico Microscopio Elettronico a Scansionea Scansione

Microscopio Elettronico Microscopio Elettronico a Scansionea Scansione

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Elettronico a trasmissioneElettronico a trasmissioneElettronico a trasmissioneElettronico a trasmissione

Elettronico a scansioneElettronico a scansioneElettronico a scansioneElettronico a scansione

Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessipatologici degli stessiLocalizzazione di molecole interne a cellule o tessuti Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcatipreventivamente marcatiOsservazione di virus Osservazione di virus

Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessipatologici degli stessiLocalizzazione di molecole interne a cellule o tessuti Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcatipreventivamente marcatiOsservazione di virus Osservazione di virus

Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessutistati fisiologici o patologici di cellule o tessutiLocalizzazione di recettori di superficie Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcatipreventivamente marcati

Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessutistati fisiologici o patologici di cellule o tessutiLocalizzazione di recettori di superficie Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcatipreventivamente marcati

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Il microscopio Il microscopio confocale (CLSM): confocale (CLSM):

principio di principio di funzionamentofunzionamento

Il microscopio Il microscopio confocale (CLSM): confocale (CLSM):

principio di principio di funzionamentofunzionamento

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REQUISITI DEL CAMPIONEREQUISITI DEL CAMPIONE: tecnologia non invasiva, consentendo l’osservazione : tecnologia non invasiva, consentendo l’osservazione del preparato a pressione ambiente, è ideale per lo studio di campioni biologici del preparato a pressione ambiente, è ideale per lo studio di campioni biologici viventi (es. cellule in coltura) rendendo accessibile lo studio dinamico dei viventi (es. cellule in coltura) rendendo accessibile lo studio dinamico dei fenomeni vitali. Inoltre, sono osservabili tutti i campioni i cui componenti, fenomeni vitali. Inoltre, sono osservabili tutti i campioni i cui componenti, strutturali e non, siano stati in qualche modo “colorati “ con sostanze o capaci di strutturali e non, siano stati in qualche modo “colorati “ con sostanze o capaci di emettere luce colorata se colpite da un raggio laser (fluorocromi) od in grado di emettere luce colorata se colpite da un raggio laser (fluorocromi) od in grado di deviare il laser stesso (es. atomi ad alto peso molecolare come oro, argento, deviare il laser stesso (es. atomi ad alto peso molecolare come oro, argento, platino, cadmio)platino, cadmio)

INFORMAZIONI OTTENIBILIINFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla distribuzione, nell’intero volume del : relative alla distribuzione, nell’intero volume del campione (sia esso un frammento di tessuto o cellule in coltura) di componenti campione (sia esso un frammento di tessuto o cellule in coltura) di componenti strutturali e non dello stesso capaci di emettere, da soli od in seguito ad strutturali e non dello stesso capaci di emettere, da soli od in seguito ad opportune colorazioni, un segnale luminoso quando colpito da un raggio laser.opportune colorazioni, un segnale luminoso quando colpito da un raggio laser.

SISTEMA ILLUMINANTESISTEMA ILLUMINANTE: una sorgente di luce laser costituita da una miscela di gas : una sorgente di luce laser costituita da una miscela di gas tale da generare raggi luminoso nell’intero spettro della luce viusibile od tale da generare raggi luminoso nell’intero spettro della luce viusibile od ultravioletta.ultravioletta.SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINESISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine viene ottenuta sulla : l’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione.segnale proveniente dal campione.

LIMITE DI RISOLUZIONELIMITE DI RISOLUZIONE: : circa 0,2circa 0,2mm

Microscopio Confocale Microscopio Confocale Laser (Laser (CLSMCLSM))

Microscopio Confocale Microscopio Confocale Laser (Laser (CLSMCLSM))

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Il laser: la sorgente Il laser: la sorgente luminosaluminosa

Si utilizzano lasers a gas ionizzato e ciascun tipo di Si utilizzano lasers a gas ionizzato e ciascun tipo di laser ha delle linee di emissione per un limitato numero laser ha delle linee di emissione per un limitato numero di di ..Tipi di lasers:Tipi di lasers:Tipi di lasers:Tipi di lasers:ARGONARGON Blu (488nm) e Verde (514nm)Blu (488nm) e Verde (514nm)Blu (488nm) e Verde (514nm)Blu (488nm) e Verde (514nm)

He-NeHe-Ne Verde (543nm) e Rosso (633nm)Verde (543nm) e Rosso (633nm)Verde (543nm) e Rosso (633nm)Verde (543nm) e Rosso (633nm)

KRIPTONKRIPTON Giallo (568nm) e Rosso (647nm)Giallo (568nm) e Rosso (647nm)Giallo (568nm) e Rosso (647nm)Giallo (568nm) e Rosso (647nm)

ARGON ad alta potenza ARGON ad alta potenza Ultravioletto Ultravioletto < 400nm < 400nm Ultravioletto Ultravioletto < 400nm < 400nm

ELIO-CADMIOELIO-CADMIO

Necessitano di un sistema di Necessitano di un sistema di raffreddamento liquido (molto costosi)raffreddamento liquido (molto costosi)Necessitano di un sistema di Necessitano di un sistema di raffreddamento liquido (molto costosi)raffreddamento liquido (molto costosi)

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Microscopio Confocale Microscopio Confocale Laser (Laser (CLSMCLSM))

Vantaggi Vantaggi Vantaggi Vantaggi

Informazioni relative ai vari piani Informazioni relative ai vari piani focali del campione (informazioni di focali del campione (informazioni di profondità)profondità)

Maggiore nitidezza delle Maggiore nitidezza delle immaginiimmaginiStruttura tridimensionale del Struttura tridimensionale del campionecampione

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Microscopio confocale Microscopio confocale laserlaser

Microscopio confocale Microscopio confocale laserlaser

Localizzazione di molecole Localizzazione di molecole autofluorescenti o marcate con sonde autofluorescenti o marcate con sonde fluorescentifluorescenti Visualizzazione di strutture cellulari Visualizzazione di strutture cellulari (es. citoscheletro)(es. citoscheletro) Osservazioni sul ciclo cellulare Osservazioni sul ciclo cellulare (marcatura del nucleo con opportuni (marcatura del nucleo con opportuni coloranti fluorescenti)coloranti fluorescenti) ApoptosiApoptosi

Localizzazione di molecole Localizzazione di molecole autofluorescenti o marcate con sonde autofluorescenti o marcate con sonde fluorescentifluorescenti Visualizzazione di strutture cellulari Visualizzazione di strutture cellulari (es. citoscheletro)(es. citoscheletro) Osservazioni sul ciclo cellulare Osservazioni sul ciclo cellulare (marcatura del nucleo con opportuni (marcatura del nucleo con opportuni coloranti fluorescenti)coloranti fluorescenti) ApoptosiApoptosi

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Sommario Sommario

Parte Teorico-pratica (2Parte Teorico-pratica (2a a lezione)lezione)

1) Cenni introduttivi per la preparazione di 1) Cenni introduttivi per la preparazione di campioni per TEM e SEMcampioni per TEM e SEM2) Osservazione diretta di campioni biologici al 2) Osservazione diretta di campioni biologici al SEMSEM3) Passaggi fondamentali per la preparazioni di 3) Passaggi fondamentali per la preparazioni di campioni biologici per il SEMcampioni biologici per il SEM4) Colorazioni citologiche per l’osservazione al 4) Colorazioni citologiche per l’osservazione al microscopio otticomicroscopio ottico

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Fasi principali della preparazione di campioni Fasi principali della preparazione di campioni per la Microscopia Elettronica a Trasmissione ed per la Microscopia Elettronica a Trasmissione ed

a Scansionea Scansione

1) 1) PrelievoPrelievo1) 1) PrelievoPrelievoParticolare cura nell’evitare Particolare cura nell’evitare

traumatizzazioni della zona da esaminare traumatizzazioni della zona da esaminare Il campione ottimale deve avere le minime Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per attuare dimensioni richieste per attuare un’adeguata fissazione, disidratazione ed un’adeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resinainclusione in resinaDelicata pulizia del campione con soluzione Delicata pulizia del campione con soluzione fisiologica o tamponefisiologica o tamponeLe suddette operazioni devono essere Le suddette operazioni devono essere eseguite in tempi brevieseguite in tempi brevi

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2) Fissazione2) Fissazione

I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone.I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone.Principali tamponi:Principali tamponi:a) Tampone fosfato (+ usato);a) Tampone fosfato (+ usato);b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato);b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato);c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)

Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e macromolecolari dell’architettura molecolari e macromolecolari dell’architettura cellulare, provocando l’arresto istantaneo di cellulare, provocando l’arresto istantaneo di tutte le attività chimico-fisiche cellularitutte le attività chimico-fisiche cellulari

Tipi di fissativi (+ usati):Tipi di fissativi (+ usati):a) a) GLUTERALDEIDE GLUTERALDEIDE 2-4% 2-4% reticola le proteine reticola le proteineb) b) TETROSSIDO DI OSMIOTETROSSIDO DI OSMIO 1-2% 1-2% fissa lipidi e proteine fissa lipidi e proteine

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3) Disidratazione3) DisidratazioneHa lo scopo di allontanare completamente i Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione, per poterlo poi fluidi presenti nel campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione sottoporre ai procedimenti di inclusione (trasmissione), ricopertura (scansione) e (trasmissione), ricopertura (scansione) e osservazione sotto vuoto.osservazione sotto vuoto.

Passaggi:Passaggi:Etanolo 50% 10minEtanolo 50% 10min “ “ 70% 10min70% 10min “ “ 85% 10min85% 10min “ “ 90% 10min90% 10min “ “ 95% 10min95% 10min “ “ 100% 2x20min100% 2x20min

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44aa) Inclusione in resina) Inclusione in resina

La resina fornisce il sostegno necessario per La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua un’impregnazione nei monomeri resinosi (fluidi) un’impregnazione nei monomeri resinosi (fluidi) che verranno successivamente polimerizzati e che verranno successivamente polimerizzati e resi solidi.resi solidi.Passaggi:Passaggi:Etanolo 100% + Acetone assoluto (1:1) 15minEtanolo 100% + Acetone assoluto (1:1) 15minAcetone assoluto (rischiarante, miscibile con le resine) 15minAcetone assoluto (rischiarante, miscibile con le resine) 15minResina + Acetone (1:1), 24hResina + Acetone (1:1), 24hResina pura 24-48hResina pura 24-48hResina da inclusione 3-4gg in stufa a 70°CResina da inclusione 3-4gg in stufa a 70°C

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55aa) Taglio con ultramicrotomo) Taglio con ultramicrotomo2 Tipi di sezioni:2 Tipi di sezioni:

A) Semi-fine A) Semi-fine ottico, colorandole con blu di metilene, spessore 1- ottico, colorandole con blu di metilene, spessore 1-22mmB) Fine B) Fine elettronico, spessore 400-600nm (0,4-0,6 elettronico, spessore 400-600nm (0,4-0,6m)m)

66aa) Contrasto) ContrastoMediante applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato Mediante applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato peso atomico (Acetato di uranile e citrato di piombo)peso atomico (Acetato di uranile e citrato di piombo)

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44bb) Critical Point Drying) Critical Point DryingCompleta la disidratazione del campione, permettendo di mantenere il più Completa la disidratazione del campione, permettendo di mantenere il più possibile inalterata la superficie del campionepossibile inalterata la superficie del campione

Passaggi:Passaggi:Etanolo assoluto + Acetone assoluto (1:1) 15minEtanolo assoluto + Acetone assoluto (1:1) 15minAcetone assoluto 15minAcetone assoluto 15minCPD in COCPD in CO22 liquida liquida

55bb) Montaggio) MontaggioMediante vernicette colloidali costituite da elementi Mediante vernicette colloidali costituite da elementi conduttivi (Ag, Cu, C) o nastri adesivi.conduttivi (Ag, Cu, C) o nastri adesivi.Attacco del campione al substratoAttacco del campione al substratoAssicura la conducibilità termica ed elettricaAssicura la conducibilità termica ed elettrica

66bb) Ricopertura) RicoperturaPerché la ricopertura:Perché la ricopertura: conducibilità elettrica del campione conducibilità elettrica del campione minori effetti di carica minori effetti di carica danneggiamento termicodanneggiamento termico emissione elettronica secondariaemissione elettronica secondaria

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Fasi principali della preparazione di campioni per laFasi principali della preparazione di campioni per la

1) Fissazione1) FissazioneUn fissativo ottimale deve:Un fissativo ottimale deve:

A) Mantenere l’antigenicità del campioneA) Mantenere l’antigenicità del campione

B) Minimizzare la comparsa di artefatti.(es. la gluteraldeide dà origine a B) Minimizzare la comparsa di artefatti.(es. la gluteraldeide dà origine a derivati autofluorescenti derivati autofluorescenti da non usare) da non usare)

In genere si usa paraformaldeide (2-4%) o metanolo a freddoIn genere si usa paraformaldeide (2-4%) o metanolo a freddo

2) Immunomarcatura2) ImmunomarcaturaAntigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazioneAntigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione

Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazioneAntigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione

3) Controcolorazione, 3) Controcolorazione, per evidenziare strutture cellulari (nucleo, citischeletro etc.) per evidenziare strutture cellulari (nucleo, citischeletro etc.)