1

Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e

Tecnologica

Università degli studi di Palermo

Unione europea

Dottorato in “Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive”

XX CicloA.A.2005/06

Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Catania, V.le A. Doria, 6, Catania

“TECNICHE TERMOANALITICHE APPLICATE ALLO STUDIO DI COMPOSTI E SISTEMI COLLOIDALI BIOLOGICAMENTE

ATTIVI”

Dott.ssa Dorotea Micieli

Tutor:             Chiar.mo Prof. Francesco CastelliCoordinatore: Chiar.mo Prof. Gaetano Giammona

Università degli Studi di Catania

2

ARTICOLAZIONE DELLA RICERCA:

1. Studi cinetici e d’interazione con modelli di biomembrane:•Sitosterolo e -Ciclodestrine;Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A ; J.Agr.Food Chem. 2006; 54: 10228-10233 •Resveratrolo e suoi derivati;Sarpietro MG, Spatafora C, Tringali, Micieli D, Castelli F; J. Agric. Food Chem. 2007; 55: 3720-3728•Terpeni, derivati dell’origano;Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A, Bisignano G ; J. Agric. Food Chem. 2007 55: 6300-6308•Gemcitabina e Aciclovir: suoi prodrugs squalenici;Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Stella B, Rocco F, Cattel L. ; J. Coll. Interf. Sci. 2007 ; 316:43-52 Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., Ottimo S., Rocco F., Ceruti M.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 •Idrogel di Inulina: effetto del loading e del pH;Castelli F., M.G. Sarpietro, Micieli D., Ottimo S., Pitarresi G., Tripodo G., Carlici B., Giammona G. Eur J Pharm Eur J Pharm Sci. 2008 ; 35(1-2):76-85 •Prodrugs lipofilici del Naprossene;Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., PantòV., Pignatello R.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008•Lipopeptidi immunogenici a diverso numero e lunghezza di catena;Sarpietro MG, Micieli D, Pignatello R, Liang MT, Toth I, Castelli F.; Termoch. Acta 2008; 471(1-2):14-19 •SLN a base di DEET e OMC;Puglia C., Bonina F., Rizza L., Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008•Inquinanti ambientali;Castelli F., Micieli D., Minniti Z., Sarpietro M.G Librando V., Chemosphere 2008; 73: 1108-1114 Librando V, Sarpietro MG, Minniti Z, Micieli D, Castelli F; Environ Sci Technol. 2006; 40(7):2462-8

2. Sintesi e caratterizzazione di carriers colloidali osteotropici per il trasporto di antitumorali al tessuto osseo metastatico.

• Pignatello R, Cenni E, Micieli D, Fotia C, Salerno M, Granchi D, Sarpietro MG, Castelli F, Baldini N.; Nanomedicine 2009, 4:161-175

• Cenni E, Granchi D, Avnet S, Fotia C, Salerno M, Micieli D, Sarpietro MG, Pignatello R, Castelli F, Baldini N.; Biomaterials 2008; 29:1400-1411

3

Tecniche impiegate:

1.Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)

• Interazione con modelli di biomembrana• Cinetiche di contatto• Cinetiche di trasferimento

2.Langmuir Blodgett (LB)• Isoterme a 10°C• Isoterme a 37°C

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Liposomi come modelli di biomembrana

I liposomi sono vescicole lipidiche preparate con fosfolipidi sia sintetici:dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC; dimiristoilfosfatidilcolina, DMPC;acido dimiristoilfosfatidico, DMPA;dilaurilfosfatidilcolina, DLPC;che naturali:fosfatidilcoline, PC;fosfatidilserine, PS;fosfatidilglicerolo, PG;etc.In particolare, utilizzando opportune miscele di questi fosfolipidi è possibile creare un sistema modello che riproduca la carica superficiale negativa delle membrane cellulari.

TESTA

IDROFILICA

CODE IDROFOBICHE

FORMULA DI STRUTTURA MODELLO TRIDIMENSIONALE

COLINA

FOSFATIDILCOLINA

FOSFATO

GLICEROLO

ACIDI GRASSI

TESTA IDROFILICA

CODE

IDROFOBICHE

5

Le strutture vescicolari, cioè quelle sferoidali delimitate da uno o più doppi strati fosfolipidici, aventi un diametro compreso tra 20 nm e 20 m sono dette "liposomi".In queste strutture i fosfolipidi sono organizzati in modo tale da formare uno o più strati concentrici, detti lamelle, separati da uno o più strati acquosi (rispettivamente liposomi unilamellari e multilamellari).In base al metodo di preparazione si possono ottenere diversi tipi di liposomi, che possono essere così classificati:•Multilamellar Vesicles (MLV);•Large Unilamellar Vesicles (LUV);•Small Unilamellar Vesicles (SUV).

6

La natura anfifilica dei liposomi permette il loro uso come drug

delivery system, dal momento che all’interno delle lamelle le

sostanze si possono collocare in maniera differente in funzione

della loro idrofilia, infatti:

• le sostanze idrosolubili sono intrappolate negli spazi acquosi tra le lamelle o nello spazio acquoso interno dei liposomi;

• le sostanze liposolubili trovano collocazione tra le catene

idrofobiche degli acidi grassi;

• le sostanze anfotere si possono collocare con la parte idrofila

all’esterno dei bilayer e con la parte idrofoba all’interno.

Liposomi come drug delivery system

7

I fosfolipidi, quando idratati, presentano un liotropismo

(esistenza di fasi differenti) in funzione della differente % di

acqua presente e della temperatura di idratazione.

Diagramma di fase del sistema 1,2-dipalmitoil-l-fosfatidilcolina/H2O

8

Al variare della temperatura si ottiene una transizione di fase gel-cristallo

liquido, caratterizzata da una temperatura di transizione, Tm, e da una

variazione d’entalpia, H.

Questo processo può essere seguito mediante la tecnica della Calorimetria

Differenziale a Scansione.

9

Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)La Calorimetria a Scansione Differenziale è una tecnica che consente di determinare, durante una scansione effettuata con incrementi lineari della temperatura, la variazione d’entalpia di processo mediante misura del flusso di calore necessario per mantenere il campione della sostanza in esame alla stessa temperatura di un campione di riferimento (inerte). La tecnica consente, altresì, di eseguire misure di capacità termica, d'emissività termica e di purezza di campioni solidi; inoltre essa consente lo studio di equilibri di fase e della cinetica dei processi.

10

In generale composti lipofili posti a contatto con liposomi tendono a collocarsi tra le

catene alifatiche o tra gli strati dei bilayers lipidici, mentre, composti che possiedono

natura anfipatica, posti a contatto con i liposomi (ad una temperatura al di sopra di

quella di transizione), tendono a penetrare il bilayer lipidico (processo rapido) e migrare

verso gli strati più interni (processo più lento). Questa penetrazione è causata

dall’interazione tra la parte polare del farmaco e le teste polari dei lipidi, e tra la parte

apolare del farmaco e le catene alifatiche, causando una modificazione della struttura

del bilayer lipidico che si riflette in variazioni dei Tm e H.

Langmuir-Blodgett

11

KSV LangmuirMinitrough ( KSV, instruments Ltd., Finland)

Il monolayer è un sistema bidimensionale, generalmente studiato con il metodo del film-balance di Langmuir-Adam, che in seguito a variazioni di pressione superficiale, area e temperatura, fornisce utili informazioni sulla distribuzione e sull’orientazione molecolare.

Esso costituisce un valido strumento per lo studio dell’organizzazione dei fosfolipidi di membrana.L’uso dei monolayer, come modello di membrana, deriva dal fatto che esso rappresenta la metà di un doppio strato lipidico (bilayer) e che possiede caratteristiche direttamente legate alle proprietà di quest’ultimo apparentemente più simile alle membrane naturali.

Formazione del Film • Sostanze anfifiliche sono disciolte in

un solvente insolubile in acqua, volatile (cloroformio, esano, etc.)

• Sono posizionate con una microsiringa su una superficie liquida, la soluzione diffonde rapidamente coprendo tutta l’area disponibile

• Il solvente evapora e si foma il monolayer

12

Se l’area disponibile per la deposizione è grande le molecole sono molto distanziate (il monolayer è considerato un gas bidimensionale).

13

DEPOSIZIONE

d)

Area effettiva per molecola a vari gradi di compressione del monolayer. a) stato gassoso; b) stato di liquido espanso; c) stato di liquido condensato; d) collasso del film fosfolipidico.

Curva isoterma Tensione superficiale/Area per molecola

14

Parametri fondamentali alla base del processo sono:

Tensione superficiale

Tipo di molecole adoperate

Pressione superficiale

=tensione superficiale in assenza di monolayer

0=tensione superficcilae in presenza di momolayer

15

16X1

AP

Naprossene e suoi derivati lipoamminoacidici

17

Naprossene

OOH

OCH3

FANS

• Intensa attività antinfiammatoria

• Moderata attività antipiretica

•Antidolorifico

•Antiaggregantepiastrinico

18

La Demenza di Alzheimer (AD)• Descritta per la prima volta nel 1907 dal neurologo tedesco Aloïs

Alzheimer, è la più frequente causa di demenza nei paesi occidentali.

• Reazioni infiammatorie croniche, alti livelli di colesterolo, stress ossidativo sembrano essere importanti agenti promotori dei cambiamenti neurodegenerativi comunemente riscontrati nei pazienti affetti da AD.

ANALISI POST MORTEM DI PAZIENTI AFFETTI DA ADANALISI POST MORTEM DI PAZIENTI AFFETTI DA AD

Grovigli neurofibrillari intracellulari (NFT tangles) Proteina β–amiloide (Aβ), ruolo centrale nella patogenesi dell’AD Mediatori dell’infiammazione intorno alle placche amiloidi nel

cervello

EffettoEffetto neuroprotettivoneuroprotettivo deidei FANSFANS

19

ATTRAVERSAMENTO BEE

PRODRUG

Lipofilia AnfifilicitàMembrane like-character

NHCHCO

O

O

NH2CH3

NH

H3C

NHCHCO

O

O

NH2CH3

NH

H3C

Nap-EDA-LAA10

Nap-EDA-LAA14

20

Tecniche impiegate:

Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)Interazione con modelli di biomembrana• Cinetiche di contatto• Cinetiche di trasferimento

2. Langmuir Blodgett (LB)• Isoterme a 10°C• Isoterme a 37°C

21

Naprossene Nap-EDA-LAA 10 Nap-EDA-LAA 14

22

Cinetica di contatto

Cinetica di trasferimento

23

Naprossene Nap-EDA-LAA 10 Nap-EDA-LAA 14

24

In conclusione:

La coniugazione del Naprossene ai lipoamminoacidi migliora la sua interazione con i modelli di biomembrana: la porzione LAA potrebbe localizzarsi tra le catene fosfolipidiche con la parte del farmaco che protrude nel mezzo acquoso.

L’entità dell’interazione dipende dalla lunghezza della catena alchilica del lipoamminoacido.

La porzione lipoaminoacidica aiuta il prodrug a essere gradualmente rilasciato dal carrier liposomiale ai modelli di biomembrana.

25

Resveratrolo e suoi derivati•Il Resveratrolo è una sostanza fitochimica naturale presente in oltre 70 specie di piante, nell’uva e arachidi

•Esiste in due forme, cis e trans, la forma trans, maggiormente presente nel vino, sembra essere quella più attiva biologicamente

•Appartiene ad una classe di fitochimici nota come stilbeni

•Esso è noto, ed intensamente studiato per le svariate proprietà biologiche ad esso attribuite tra cui:

•attività antiossidante •inibizione della cicloossigenasi •inibizione dell’aggregazione piastrinica •attività antiestrogenica

•Il resveratrolo ed altri stilbenoidi ad esso correlati sono stati considerati per la loro abilità di agire come radical scavenger, di prevenire la perossidazione lipidica, di avere attività chemio-protettive nelle malattie degenerative umane come l’aterosclerosi ed il cancro.

26

Resveratrolo e suoi derivati

H3CO

OCH3

OCH3

HO

OH

OH

trans-Resveratrolo

Metilazione chimica

Acilazione chimica

OCOCH3

OCOCH3

H3COCO

3,5,4’-trimetilresveratrolo

3,5,4’-acetilresveratrolo

27

Resveratrolo e suoi derivati

Tecniche impiegate:

Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)Interazione con modelli di biomembrana• Cinetiche di contatto• Cinetiche di trasferimento

2. Langmuir Blodgett (LB)• Isoterme a 10°C• Isoterme a 37°C

28

Resveratrolo e suoi derivati

0 5 10 15 20 25 tinf

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

tempo (ore)

(T

/T°

m)

x 10

3

ResveratroloTrimetilresveratroloTriacetilresveratrolo

DSC

0 5 10 15 20 25 tinf

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

tempo (ore)

(T

/T° m

) x

103

ResveratroloTrimetilresveratroloTriacetilresveratrolo

0 0,05 0,1 0,15 0,2-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Frazione molare

(T

/T° m

) x

103

Resveratrolo

Trimetilresveratrolo

Triacetilresveratrolo

Resveratrolo v.c.

Trimetilresveratrolo v.c.

Triacetilresveratrolo v.c.

29

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

Resveratrolo

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

TrimetilResveratrolo

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

TriacetilResveratrolo

ESPERIMENTI A 10°C

ESPERIMENTI A 37°C

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

Resveratrolo

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

TrimetilResveratrolo

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area/m

oleco

la (Å

2)

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

TriacetilResveratrolo

LB

30

CONCLUSIONI

Esaminando i risultati ottenuti si evince che:

Il resveratrolo e il trimetil-derivato sono capaci di fluidificare i modelli di membrana di DMPC in dipendenza della loro concentrazione, modificando quindi la transizione di fase del lipide usato. Il triacetilresveratrolo, invece, provoca un piccolo aumento della fluidità di membrana;

Per quanto riguarda le cinetiche di contatto i risultati ottenuti dimostrano che solo il resveratrolo è capace di attraversare il mezzo acquoso e interagire con i doppi strati lipidici degli MLV. Per i due derivati non si osserva questa interazione probabilmente a causa della loro incapacità di dissolversi e attraversare il mezzo acquoso;

Dai dati relativi alle cinetiche di trasferimento si può osservare che tutti e tre i composti sono capaci di migrare dagli MLV contenenti lo stilbene a quelli di DMPC pura. Il resveratrolo completa il trasferimento dopo solo 4 ore di incubazione, quindi molto velocemente, i suoi due derivati anche dopo 24 ore non lo completano del tutto;

In accordo con i dati calorimetrici, anche quelli di Langmuir-Blodgett indicano che questi composti hanno un effetto fluidificante su monolayer fosfolipidici.

IDROGEL DI INULINA

31

O H O

H O

O H

O H

C H 2

C H 2 O H

O

C H 2

O

O H

m

O H

O H

C H 2 H O O

O H

O H

C H 2 HO O

INULINA

• Polisaccaride naturale trovato in vari vegetali

• Appartiene ai glucofruttani

• È costituita da molecole di fruttosio legate in β 2-1

• Può contenere una molecola di glucosio ad una estremità della catena

• Non tossica, biocompatibile, solubile in acqua, biodegradabile e poco costosa

GLI IDROGELI• Sistemi che assorbono una grande quantità di acqua senza passare in

soluzione o perdere l’integrità strutturale

• Formati da polimeri idrofili ramificati covalentemente, ma anche mediante legami idrogeno, legami ionici o Forze di Van der Waals

• Bassa tossicità, buona biocompatibilità

• Dispersi in mezzo acquoso rilasciano i soluti in essi contenuti

Adatti per sistemi di rilascio prolungato e/o controllato o in un sito specifico

32

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2HO O

C

CH3

CO

H2C C

CH3

CO

O

MA

24h/25 24h/25

DMFTEA

°C

DMFTEA

°C

H2C

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2HO O

C

CH3

CO

H2C C

CH3

CO

O

MA

24h/25 24h/25

DMFTEA

°C

DMFTEA

°C

H2C

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

OHO

HO

OH

O

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2HO O

C

CH3

CO

H

H

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2HO O

C

CH3

CO

H2C C

CH3

CO

O

MA

24h/25 24h/25

DMFTEA

°C

DMFTEA

°C

H2C

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2O O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

C

O

CH2CH2C

O

HO

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH324h/25 24h/25

DMFTEA

°C

DMF

O

O

OSA

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2O O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

C

O

CH2CH2C

O

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2O O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH3

C

O

CH2CH2C

O

HO

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH324h/25

HO

OHO

HO

OH

OH

CH2

CH2OH

O

CH2

O

OH

m

OH

OH

CH2HO O

OH

OH

CH2O OC

O

CCH2

CH324h/25 24h/25

DMFTEA

°C

DMF

O

O

OSA

Derivatizzazione dell’inulina (INU) con anidride metacrilica (MA)Derivatizzazione dell’inulina (INU) con anidride metacrilica (MA)Ramificazione fotochimica (Photocrosslinking) del derivato con irradiazione UVRamificazione fotochimica (Photocrosslinking) del derivato con irradiazione UV

Derivatizzazione con anidride succinica (SA)Derivatizzazione con anidride succinica (SA)

L’INU-MA ottenuto presenta:

Buona capacità di swelling

Bassa resistenza all’idrolisi acida

La presenza di gruppi carbossilici determina:

Ridotto swelling nel mezzo acido

Resistenza ai fluidi gastrici

33

L’idrogel di INU-MA-SA

• Potrebbe essere adatto per il rilascio di farmaci nel tratto intestinale

• Potrebbe permettere una minore degradazione dei farmaci sensibili al pH acido gastrico

• Potrebbe ridurre gli effetti collaterali sulla mucosa gastrica (ad es. per gli NSAID)

L’idrogel è stato caricato con un farmaco modello

diflunisaldiflunisal

È un derivato dell’acido salicilico

Poco solubile in acqua

Analgesico, antinfiammatorio

Effetti collaterali gastrointestinali

(emorragie, ulcerazioni)

F

FOH

HOOC

34

Esperimenti effettuati

Studi di swelling Studi di swelling Studi di degradazione chimica Studi di degradazione chimica Studi di degradazione enzimatica Studi di degradazione enzimatica Interazione LUV/diflunisalInterazione LUV/diflunisal

Cinetiche di rilascio: Cinetiche di rilascio: eseguite con idrogeli caricati con diverse quantità di farmaco e a pH 7,4 e 4,0

35

0

1

2

3

4

5

6

7

8

H2O distillata PBS pH 7,4 PBS pH 6,8 pH 1 1h

mezzo

q=W

s/W

d

STUDI DI SWELLING

q = Ws/WdWs = peso idrogel rigonfiatoWd = peso idrogel secco

H2Odistillata

PBS pH4,7 24h

PBS pH6,8 24h

PBS pH7,4 24h

pH 1 1hpH 1 2hpH 1 24h

0

20

40

60

80

100

H2O distillata

PBS pH 4,7 24h

PBS pH 6,8 24hPBS pH 7,4 24hpH 1 1hpH 1 2h

pH 1 24h

Resa % q

H2O distillata

H2O distillata

Degradazione chimica

ll saggio quantitativo del fruttosio, liberato dalla degradazione enzimatica con inulinasi dell’idrogel INU-MA-SA, effettuato usando il metodo colorimetrico dell’antrone ha evidenziato una degradazione dell’idrogel del 53 ± 3% in peso rispetto al campione iniziale.

Degradazione enzimatica

Dati calorimetrici

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

0,12 0,09 0,06 0,045 0,03 0,015 DMPC

pH 7,4

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

frazione molare

(T

/T° m

) x

10

00

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

WW

WW

WW

ww

WW

WW

W

WW

Wm

mm

m

mm

mm

W

0,09 pH 4,0 DMPC pH 4,0 0,09 pH 7,4 DMPC pH 7,4

Notevole decremento della temperatura di transizione, proporzionale all’aumento della frazione molare

A pH 4,0 il diflunisal causa la scomparsa del picco di pretransizione, l’ allargamento e lo spostamento a temperature più basse del picco di transizionevariazioni minori rispetto a quelle a pH 7,4

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h DMPC

Curve calorimetriche di LUV di DMPC in contatto con l’idrogel di INU-MA-SA a tempi di incubazione crescenti

pH 7,4

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

r

22 h

8 h

7 h

6 h

5 h

4 h

3 h

2 h

1 h

0.2 h

DMPC

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

endo

2 m

W

r

22 h

8 h

7 h

6 h

5 h

4 h

3 h

2 h

1 h

0.2 h

DMPC

pH 7,4

Curve calorimetriche di LUV diDMPC in contatto con diflunisal (frazione molare 0,09) a tempi di incubazione crescenti

0 2 4 6 8 10 22 r-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

tempo (ore)

(T

/T° m

) x

10

00

DFNidrogel + DFN 7,8%idrogel + DFN 17%idrogel + DFN 24%idrogelDFN X=0,09

pH 7,4

0 2 4 6 8 10 22 r-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

tempo (ore)

(T

/T° m

) x

10

00

DFNidrogel + DFN 7,8%idrogel + DFN 17%idrogel + DFN 24%idrogel (7,8%)idrogel (17%)idrogel (24%)DFN X=0,09

//

//

//

//

////

//

//

////

//

//

pH 4,0

• L’idrogel di INU-MA-SA non è degradato chimicamente• Subisce degradazione enzimatica da parte della • β-fruttosidasi inulinasi• Il rilascio del diflunisal dall’idrogel di INU-MA-SA è influenzato dal grado di loading• Il rilascio del diflunisal dall’idrogel di INU-MA-SA è influenzato dal pH del mezzo.

Infatti, a pH 7,4 la velocità di rilascio e la quantità rilasciata sono maggiori • L’idrogel di INU-MA-SA risulta un buon carrier per il rilascio di farmaci al colon

CONCLUSIONI

39

Terpeni, derivati dell’origano

• I terpeni, sono componenti degli oli essenziali delle piante che presentano attività antimicrobica su:

batteri Gram-positivi batteri Gram-negativi

• Tale attività sembrerebbe dovuta, almeno in parte, alla loro capacità di penetrare la membrana cellulare dei batteri, che dipende dalle loro caratteristiche strutturali ma soprattutto dalle loro proprietà lipofile.

• Le proprietà antimicrobiche e antiossidanti degli oli essenziali sono ormai note da lungo tempo e sono stati condotti numerosi studi per indagare sulla loro attività antimicrobica impiegando diversi tipi di batteri, virus e funghi.

40

Terpeni, derivati dell’origano

OH

OH

p-Cimene

TimoloCarvacrolo

Terpinene

41

Studi condotti:

1. Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)•Interazione con modelli di biomembrana•Cinetiche di contatto•Cinetiche di trasferimento

2. Langmuir Blodgett (LB)•Isoterme a 10°C•Isoterme a 37°C

3. Studi microbiologici•Minima concentrazione inibente (MIC)

Terpeni, derivati dell’origano

42

0 0.05 0.1 0.15 0.2-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Frazione molare

T

/T° m

) x 1

00

0

carvacrolop-cimene-terpinenetimolo

Cinetiche di contatto MLVStudi di interazione

0 5 10 15 20 25 t inf

-15

-10

-5

0

tempo (ore)

T

/T° m

) x

1000

carvacrolop-cimeneterpinenetimolo

Cinetiche di contatto LUV

0 5 10 15 20 25 t inf

-20

-15

-10

-5

0

tempo (ore)

T

/T° m

) x

1000

carvacrolop-cimene-terpinenetimolo

Cinetiche di trasferimento MLV

0 5 10 15 20 25 t inf

-15

-10

-5

0

tempo (ore)

T

/T° m

) x

1000

carvacrolocimene-terpinenetimolo

43

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

Timolo

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

-Terpinene

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

p-Cimene

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

Carvacrolo

Esperimenti a 10°C

44

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

20

40

60

80

100

Frazione molare

Area

per

mol

ecol

a (Å

2 )

10 mN/m

20 mN/m

30 mN/m

p-Cimene -Terpinene

Timolo Carvacrolo

Esperimenti a 37°C

45

TERPENE MIC (mg/ml)

S.aureus ATCC6538P

E.coli ATCC10231

CARVACROLO 1.25 (0.62-1.25) 2.50

TIMOLO 0.31 5.0 (2.5-5.0)

P-CIMENE 1.25 2.50

-TERPINENE 2.50 (1.25-2.50) 5.0 (2.5-5.0)

Attività antimicrobica

46

CONCLUSIONI

I dati di calorimetria permettono di evidenziare che i quattro composti studiati interagiscono con le membrane modello costituite da liposomi di DMPC causandone una destabilizzazione;

I dati ottenuti permettono di classificare i composti in due gruppi: il timolo e il carvacrolo, che per la presenza della funzione fenolica, interagiscono con le membrane in quasi uguale misura, ma con effetti più marcati rispetto al p-cimene e il γ-terpinene;

Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-MLV rivelano che i quattro composti sono in grado di attraversare lo strato acquoso, raggiungere la superficie degli MLV ed interagire con questi. Nel tempo tutti e quattro i terpeni tendono a raggiungere la massima interazione possibile, ma la cinetica di interazione è più lenta nel caso del γ-terpinene e del p-cimene, più veloce nel caso del timolo e soprattutto del carvacrolo;

47

Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-LUV mostrano che i terpeni attraversano lo strato acquoso, raggiungono la superficie dei LUV interagendo con essi. Il confronto tra gli esperimenti di cinetica di contatto condotti con gli MLV e con i LUV mostrano che tutti i terpeni interagiscono più velocemente con i LUV probabilmente per la maggiore superficie che questi espongono;

Le cinetiche di trasferimento indicano che i terpeni sono capaci di migrare dagli MLV carichi a quelli scarichi. Il -terpinene il p-cimene sono più veloci a trasferirsi dagli MLV carichi a quelli scarichi rispetto al timolo e al carvacrolo;

I risultati degli esperimenti con la tecnica di Langmuir-Blodgett sono in accordo con i dati calorimetrici. Tutti e quattro i terpeni hanno un effetto espansore sul monolayer di DMPC. Tale effetto è più evidente per il carvacrolo e il timolo;

Dai risultati ottenuti dalle prove d’attività antimicrobica è emerso che tutti e quattro i terpeni, anche se in misura diversa, sono capaci di impedire la crescita batterica sia di Escherichia coli che di Staphylococcus aureus.

CONCLUSIONI

Assorbimento del -sitosterolo mediato da -ciclodestrine• I fitosteroli sono sostanze che si trovano naturalmente nelle piante, sono le

controparti del colesterolo nei prodotti animali.

• I fitosteroli sono presenti in una dieta normale, in particolare b-sitosterolo, campesterolo and stigmasterolo presenti in maggior quantità in molte fonti, e sono assorbiti proporzionalmente al colesterolo ma in misura minore.

• L’interesse allo studio dei fitosteroli è dovuto inizialmente al loro effetto nel ridurre l’assorbimento del colesterolo introdotto con la dieta proteggendo quindi da malattie cardiovascolari.

48

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

H

H H

-sitosterolo

• Insieme a vitamine liposolubili e carotenoidi, i fitosteroli sono costituenti alimentari vegetali altamente lipofili; inoltre, similarmente al colesterolo, i fitosteroli, possiedono sostituzioni in posizione C-24 responsabili del loro scarso assorbimento. Infatti è stato suggerito che negli esseri umani e altri mammiferi approssimativamente solo il 5% degli steroli ingeriti sono assorbiti.

• Per questo motivo molte preparazioni sono state formulate in maniera specifica per aumentare la solubilità in acqua e la biodisponibilità dei fitosteroli.

49

CICLODESTRINE

50

Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC):

•Interazione con modelli di biomembrana

•Cinetiche di contatto

51

0.15 0.12 0.09 0.06 0.045 0.03 0.015 0.00

0 0.05 0.1 0.15 0.2

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

molar fraction

(T

/T0 m

) x

103

Frazione molare

0 0.05 0.1 0.15 0.2

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

molar fraction

(

H/

H0 )

Frazione molare

52

0 2 4 6 8 10

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

time (hr)(

T/T

0 m)

x 10

3 -CDs20

-CDs0.5-CDs1-CDs2

Tempo (ore)

• Quindi concludendo possiamo confermare che il -sitosterolo di per sè è molto idrofobo e quindi incapace di attraversare il mezzo acquoso, interagendo molto poco con il bilayer lipidico. Ciò è ben coerente con la ben nota scarsa disponibilità del -sitosterolo se introdotto per via orale. Inoltre la presenza di adeguate concentrazioni di -CDs possono migliorare l’interazione MLV/-sitosterolo.

• Infatti il -sitosterolo incapsulato in -CDs è reso più disponibile a diffondere nel mezzo acquoso e a raggiungere la superficie degli MLV, consentendo quindi una sua permeazione attraverso le biomembrane (modelli che mimano l’assorbimento cellulare).

• Alte concentrazioni di -CDs invece causano una variazione del comportamento termotripico della DMPC con un incremento della Tm. L’incremento della Tm della DMPC causato dall’interazione con -CDs è stato già riportato da alcuni ricercatori che studiarono l’effetto degli zuccheri sulle membrane fosfolipidiche.

53

CONCLUSIONI

• I nostri risultati sono in accordo con i dati in letteratura considerando che l’aumento della temperatura della transizione di fase gel-cristallo liquido è dovuto all’effetto stabalizzante dei carboidrati sul doppio strato fosfolipidico attraverso la formazione di legami idrogeno più probabile alla testa del gruppo fosfato.

• Inoltre è stato anche dimostrato che alte concentrazioni di CDs possono catalizzare il non assorbimento dal monolayer e bilayer delle membrane, ostacolando quindi le nostre condizioni sperimentali e quindi anche l’interazione del sistosterolo con i fosfolipidi. Pertanto la scelta di un opportune rapporto molare -sitosterolo/-CDs potrebbe essere importante per evitare modifiche al modello di biomembrana dato da eccessive concentrazioni di -CD.

54

CONCLUSIONI

Prodrug Gemcitabina-Squalene

55

•Antimetabolita pirimidinico derivato dal nucleoside naturale deossicitidina.

• Presenta caratteristiche strutturali e metaboliche simili alla Citarabina (Ara-C).

•Ampio spettro d’azione sia nei tumori murini che nei tumori eterotrapiantati.

Gemcitabina (2’,2’-difluoro-deossicitidina)

56

• Come l’Ara-C nella forma trifosfato è in grado di bloccare la sintesi del DNA.

• Una volta incorporato nel DNA in costruzione è in grado di legare un ulteriore nucleotide naturale che nasconde il farmaco agli enzimi di riparazione: le esonucleasi.

• Presenta inoltre un particolare meccanismo di autopotenziamento dell’attività citotossica (inibizione enzima inattivatore ad alte concentrazioni intracellulari).

Mec

cani

smo

d’a

zion

e

• Incorporazione del farmaco in liposomi a lunga emivita (approccio tecnologico)

• Sintesi di pro-drugs della Gemcitabina:

Aumento della lipofilia del farmaco

Protezione chimica del gruppo amminico in posizione N4 della citosina (che viene velocemente metabolizzato nel plasma)

Incremento della stabilità metabolica della Gemcitabina

57

CH3CH3

N

N

O

H

F

FOH

H

OH

H

CH3CH3

CH3

O

C

O

HN

GEM-SQUALENE

Studi condotti:

1. Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)

•Interazione con modelli di biomembrana

•Cinetiche di contatto•Cinetiche di trasferimento

2. Langmuir Blodgett (LB)•Isoterme a 10°C•Isoterme a 37°C

Risultati

DSC

58

0 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15-20

-15

-10

-5

0

5

frazione molare

T

/T° m

x 1

000

squalenesqualene acidogemcitabina

gem-squalene

0 5 10 15 20 tinf-20

-15

-10

-5

0

5

Tempo (ore)

SqualeneSqualene acidogemcitabina

Gem-squalene

T/T

° m

x 10

00

0 5 10 15 20 tinf

-20

-15

-10

-5

0

5

Tempo (ore)

T/T

° m x

10

00

SqualenesqualCOOHsqualCOOHgemcitabinaGem-squalene

Gem-squalene

Interazione

Cinetica

di contatto

Cineticadi trasferimento

59

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (gemcitabina)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m

20 mN/m

35 mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (gemcitabina)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

Gemcitabina

10°C

37°C

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (squalene)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (squalene)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

10°C

37°C

SqualeneR

isul

tati

LB

60

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (squalene acido)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (squalene acido)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

Squalene acido

10°C

37°C

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (gem-squalene)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

frazione molare (gem-squalene)

Are

a p

er m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m35 mN/m

Gem-Squalene

10°C

37°C

61

CONCLUSIONI

Gli studi effettuati mediante Calorimetria a Scansione Differenziale e le misure eseguite mediante il metodo del film-balance  (tecnica di Langmuir-Blodgett, LB) hanno dimostrato che:

a) la Gemcitabina e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello dovuto, nel caso della gemcitabina, alla sua localizzazione negli strati acquosi fra i doppi strati fosfolipidici e, nel caso dello Squalene alla sua insolubilità nell’ambiente idrofobo delle catene aciliche dei fosfolipidi; al contrario lo Squalene-acido, grazie alla presenza del gruppo carbossilico determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico.

b) la Gemcitabina per il suo carattere idrofilo è capace di attraversare la strato acquoso ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; lo squalene sia per la sua incapacità di attraversare lo strato acquoso sia per la sua insolubilità nel doppio strato lipidico non è in grado di avere effetti sul comportamento termotropico degli MLV di DMPC; sia lo Squalene-acido che lo Gem-squalene si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo.

62

CONCLUSIONI

c) La Gemcitabina non è capace di trasferirsi dagli MLV carichi a quelli vuoti. Lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello Squalene-acido che dello Gem-squalene e il loro successivo assorbimento da parte della membrana modello; la cinetica di rilascio dello Squalene-acido e dello Gem-squalene è graduale e lenta nel tempo.d) la tecnica di Langmuir-Blodgett ha permesso di avvalorare i risultati ottenuti mediante DSC evidenziando il diverso effetto dei composti esaminati sul monostrato di DMPC.

In conclusione il confronto di tutti i risultati ottenuti hanno dimostrano l’importanza del prodrug Gem-squalene nel consentire:•una migliore interazione con le membrane biologiche del prodrug rispetto alla Gemcitabina libera;•un rilascio del prodrug controllato e graduale nel tempo rispetto alla Gemcitabina libera.

63

LIPOPEPTIDI

m

porzione peptidica

un residuo aminoacidico

una catena lipidica (satura o insatura)

*H HN

O

n

Lys-Ala-Val-Tyr-Asn-Phe-Ala-Thr-Met-NH

( )

n

2

64

La coniugazione tra queste due porzioni comporta:

Aumento dela lipofilia del peptide

Aumento della resistenza del peptide alla degradazione enzimatica

Maggiore permeabilità attraverso le membrane biologiche

Aumento immunogenicità

Solubilità in acqua drasticamente ridotta

65

26

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

10 12 14 16 18 20 22 24 28 30 32 34 36 38 °C

LCMV

2 m

W

endo

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

2 m

W

endo

C12-LCMV

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

2 m

W

endo

2C12-LCMV

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

°C

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

2 m

W

end

o

C16-LCMV

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Curve DSC

66

0 0,05 0,1 0,151

2

3

4

5

Molar Fraction

T1

/2(°

C)

LCMVC12-LCMV

C16-LCMV

2C12-LCMV

Frazione molare

0 0,05 0,1 0,15-500

-400

-300

-200

-100

0

100

Molar Fraction

( H

/H

°) x

103

LCMVC12-LCMV

C16-LCMV

2C12-LCMV

Frazione molare

Risultati

CONCLUSIONI

• Il peptide puro mostra un interazione molto bassa con il bilayer di DMPC, mentre la coniugazione del peptide ai lipoaminoacidi migliora la loro capacità di interagire con i modelli di biomembrana.

• L’interazione dipende fortemente dalla lunghezza delle catene e dal numero, in quanto al loro incremento ne consegue un decremento della cooperatività della transizione di fase e l’induzione di un disordine nel doppio strato lipidico.

• Inoltre la coniugazione dei lipoaminoacidi ad LCMV potrebbe far si che il peptide sia più efficientememte trasportato attraverso il sistema liposomiale.

67

Prodrug squalenici dell’Aciclovir

68

L’Aciclovir (ACV), è un analogo nucleosidico purinico di sintesi, derivato dalla deossiguanidina, è un principio attivo con potente attività antivirale contro l’Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1), di tipo 2 (HSV-2), l’Herpes Zoster, il virus di Epstein Barr (EBV) ed il Citomegalovirus

69

O CHO

OH Br

H2Cr2O7

etere dietilico, 0°C

squalene monoaldeide

squalene monobromidrina

squalene monoepossido

squalene

squalene monoacido

COOH

K2CO3

MeOH, T.A.

HIO 4.2H2O

etere dietilico, T.A.

NBS

THF, Ar, 0°C

70

Tecniche impiegate:

Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)Interazione con modelli di biomembrana• Cinetiche di contatto• Cinetiche di trasferimento

2. Langmuir Blodgett (LB)• Isoterme a 10°C• Isoterme a 37°C

71

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

Aciclovir

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

Squalene

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

Squalene COOH

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

endo

2 m

W

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

Aciclovir-Squalene

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14-20

-15

-10

-5

0

5

Frazione Molare

T

/T° m

) x

10

00

AciclovirSqualeneSqualene-COOHAciclovir-Squalene

72

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h

DMPC

Aciclovir

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h

DMPC

Squalene

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h

DMPC

Squalene COOH

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h

DMPC

Aciclovir-Squalene

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h DMPC

X=0,12

Aciclovir

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h DMPC

X=0,12

Aciclovir-Squalene

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h DMPC

X=0,12

Squalene COOH

°C 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

endo

2 m

W

r 22 h 8 h 7 h 6 h 5 h 4 h 3 h 2 h 1 h 0.2 h DMPC

X=0,12

Squalene

Cinetica di contatto Cinetica di trasferimentoRISULTATI

73

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

Area per molecola (Å2)

Pre

ssio

ne s

uper

ficia

le (

mN

/m)

DMPC0,0150,030,0450,060,090,120,250,50,75Aciclovir

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

Area per molecola (Å2)

Pre

ssio

ne s

uper

ficia

le (

mN

/m) DMPC

0,0150,030,0450,060,090,120,250,50,75Squalene

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

Area per molecola Å2)

Pre

ssio

ne s

uper

ficia

le (

mN

/m) DMPC

0,0150,030,0450,060,090,120,250,50,75SqualeneCOOH

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

Area per molecola Å2)

Pre

ssio

ne s

uper

ficia

le (

mN

/m) DMPC

0,0150,030,0450,060,090,120,250,50,75Aciclovir-squalene

Isoterme a 10°C

74

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione Molare (ACV)

Are

a pe

r m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m30 mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione Molare (Squalene)

Are

a pe

r m

olec

ola

(Å2 )

10mN/m20mN/m30mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione Molare (SqualeneCOOH)

Are

a pe

r m

olec

ola

(Å2 )

10mN/m20mN/m30mN/m

0 0,2 0,4 0,6 0,8 10

20

40

60

80

100

Frazione Molare (ACV-SQ)

Are

a pe

r m

olec

ola

(Å2 )

10 mN/m20 mN/m30 mN/m

Misure a 37°C

75

CONCLUSIONIL’Aciclovir e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello; lo SqualeneCOOH determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico. Nel caso dell’Aciclovir-Squalene, si osserva una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico proporzionale alla quantità di prodrug.

L’Aciclovir potrebbe essere capace di attraversare lo strato acquoso, ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; gli altri tre composti si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo.

L’Aciclovir non è capace di trasferirsi dagli MLV pieni a quelli vuoti; lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello SqualeneCOOH che dell’ACV-SQ e il loro successivo assorbimento da parte della biomembrana modello; la cinetica di rilascio dello SqualeneCOOH e dell’Aciclovir-Squalene è graduale e lenta nel tempo.

RILASCIO DI DEET E OTC DA SLN

76

Agli inizi degli anni ’90, con lo sviluppo delle “Nanoparticelle Solide Lipidiche” (SLN), sono stati uniti i vantaggi di liposomi, emulsioni e particelle solide. Le SLN sono state ottenute semplicemente scambiando la fase lipidica liquida (olio) delle emulsioni con un lipide che si trova allo stato solido sia a temperatura ambiente che alla temperatura corporea.In base al tipo di SLN prodotte è possibile ottenere il rilascio modificato del principio attivo.

77

a)

b)

c)

Le SLN agiscono, inoltre, come occlusivi, perciò possono essere usate per aumentare il contenuto in acqua della pelle. Grazie alle loro ridotte dimensioni possiedono proprietà adesive che consentono la formazione di un film sulla superficie della pelle. L’adesività è una caratteristica tipica delle particelle molto fini e consente la formazione di un film costituito da sfere densamente impaccate sulla superficie cutanea

78

SLN

Scattering dei raggi UV

+ FILTRO SOLARE: OMC

+ REPELLENTE: DEET

O CH3

CH3

O

MeO

CH3 N

O

CH3

CH3

octyl methoxy cinnamate

N,N–diethyl–m toluamideSLN/OMC-DEET

ultrasuoni

79

RISULTATI

•Dinamic light scattering: diametro medio 302.6 nm•Elevata incorporazione di principi attivi•DSC:

SLN SLNOMC

SLNDEET

SLNOMCDEET

-8

-6

-4

-2

0

T/T

0 x

10

3

SLN SLNOMC

SLNDEET

SLNOMCDEET

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

H

/H

0 x

103

80

•Studi di assorbimento percutaneo in vitro

SLN O/W0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

DEETOMC

Valori di flusso del DEET e dell’OMC allo steady-state dalle SLN e dall’emulsione o/w.

Sia l’OMC che il DEET incorporati nelle SLN mostrano un flusso allo steady-state significativamente minore rispetto a quello riscontrato nell’emulsione o/w contenente la stessa quantità di principi attivi.

Conclusioni: si può ipotizzare che l’impiego delle SLN come sistemi carrier per la veicolazione dell’OMC e del DEET garantisce una maggiore permanenza dei composti sulla superficie della pelle, ovvero nel sito in cui devono svolgere la loro azione, riducendo, inoltre, la loro permeazione attraverso la pelle e di conseguenza i possibili effetti collaterali o tossici.

81

Erbicidi, derivati della Fenilurea

•Gli erbicidi sono sostanze chimiche che uccidono le piante e sono largamente usati per aumentare la resa e migliorare la qualità della produzione agricola;

•Generalmente essi esibiscono una tossicità nei mammiferi, alcuni di loro sono altamente tossici, mentre altri sono genotossici e alcuni sono cancerogeni in saggi in vivo;

•Gli erbicidi derivati della fenilurea sono principalmente assorbiti attraverso le radici e trasportati al sito d’azione dove essi bloccano il trasporto di elettroni nella fotosintesi;

•La presenza degli erbicidi nel sottosuolo indica che molti di questi composti non sono biodegradabili e possono persistere per un lungo periodo nell’ambiente inquinandolo.

82

Erbicidi, derivati della Fenilurea

CH3

CH 3

N N

O

H

CH 3

CH 3

N N

O

H

Cl

CH 3

CH 3 N N

O

H

Br

OCH 3

CH 3 N N

O

HOCH3

Cl

CH 3 N N

O

HOCH 3

Cl

Br

Fenuron

Clorotoluron

Metobromuron

Monolinuron

Clorbromuron

83

Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC):

•Interazione con modelli di biomembrana

•Cinetiche di contatto

•Cinetiche di trasferimento

Erbicidi, derivati della Fenilurea

84tempo (ore)

0 2 4 6 8 22 r-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

(T

/T° m

) x

103

fenuronchlorotoluronmetobromuronmonolinuronchlorbromuron

0 2 4 6 8 r

0 0,05 0,1 0,15 0,2-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Frazione molare

T/T

° m x

103

fenuronclorotoluronmetobromuronmonolinuronclorbromuron

0 2 4 6 8 22 r-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

tempo(ore)

(T

/T° m

) x

103

fenuronchlorotoluronmetobromuronmonolinuronchlorbromuron

0 2 4 6 8 r-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 2 4 6 8 22 r-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

tempo (ore)

(T

/T° m

) x

103

fenuronchlorotoluronmetobromuronmonolinuronchlorbromuron

0 2 4 6 8 r-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Studi di interazione Cinetiche di contatto MLV

Cinetiche di contatto LUV Cinetiche di trasferimento MLV

85

CONCLUSIONI

Dai dati calorimetrici ottenuti è possibile concludere che:

• Tutti gli erbicidi causano un decremento nella temperatura di transizione ma in maniera diversa. Il maggior effetto è esibito dal clorbromuron, seguito da monolinuron e metobromuron, e poi da clorotoluron e fenuron con il più basso effetto;

• Per quanto riguarda la cinetica di contatto possiamo dire che fenuron e monolimuron riescono a dissolversi nel mezzo acquoso, raggiungere la superficie degli MLV e interagire con il bilayer fosfolipidico, probabilmente grazie alla loro elevata solubilità in acqua;

• Comparando i risultati ottenuti tra LUV ed MLV sembra che gli erbicidi interagiscano meglio con i primi, probabilmente grazie alla maggiore superficie di contatto che questi espongono;

• Dalle cinetiche di trasferimento è emerso che questi composti sono in grado di trasferirsi da MLV pieni a MLV vuoti, che ciò succede piuttosto velocemente e che l’equilibrio di concentrazione è raggiunto in poche ore.

86

• Sono derivati degli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), che contengono due o più anelli aromatici condensati;

• Sono presenti nell’ambiente in miscela con altri composti organici, sia liberi nell’aria che adsorbiti a materiale particolato;

• I nitro-IPA sono prodotti diretti o indiretti di combustioni incomplete;

• Tali composti sono solo parzialmente degradati da microrganismi e possono persistere nell’ambiente.

Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici

87

Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici

NO2NO2O2N

NO2

3-nitrofluoranthene2-nitrofluorene2,7-dinitrofluorene

88

Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici

Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)

•Interazione con modelli di biomembrana•Cinetiche di contatto •Cinetiche di trasferimento

89

2-nitrofluorene

0.18

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

B

2 m

W

endo

3-nitrofluorantene

0.18

0.15

0.12

0.09

0.06

0.045

0.03

0.015

DMPC

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

C

2 m

W

endo

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2-6

-4

-2

0

2

Frazione molare

(T

/T° m

) x

10

3

2-nitrofluorene2,7-dinitrofluorene3-nitrofluoranthene

90

0 1 2 3 4 5 6 7 8 tinf

-4

-3

-2

-1

0

1

Tempo (ore)

(T

/T° m

) x

10

3

2-nitrofluorene2,7-dinitrofluorene3-nitrofluoranthene

0 1 2 3 4 5 6 7 8 r-4

-3

-2

-1

0

1

Tempo (ore)

(T

/T° m

) x

10

3

2-nitrofluorene2,7-dinitrofluorene3-nitrofluoranthene

Cinetica di contatto

Cinetica di trasferimento

CONCLUSIONIÈ stato trovato: (a) il seguente ordine di interazione: 3-nitrofluoranthene>2-nitrofluorene>2,7-dinitrofluorene; (b) uno scarso assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli di biomembrana nel mezzo acquoso (c) mentre un forte assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli biomemrana mediato dal mezzo lipofilo.

91

• Diverse strategie, che sfruttano la coniugazione con i bisfosfonati, per l’ottenimento di trattamenti e sistemi terapeutici per la cura di osteoporosi, osteoartriti, cancro all’osso, ed in generale di Osteotropic Drug Delivery System (ODDS), sono ampiamente descritte in letteratura;

• Lo scopo del lavoro è stato quello di formulare un carrier colloidale osso-affine per l’incapsulazione ed il trasporto di un antitumorale come la doxorubicina per la cura delle metastasi ossee

SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI CARRIERS COLLOIDALI OSTEOTROPICI PER IL

TRASPORTO DI ANTITUMORALI AL TESSUTO OSSEO METASTATICO

92

1° Step: Sintesi e caratterizzazione del coniugato ammidico tra un polimero (PLA/PLGA) ed un bisfosfonato (Alendronato sodico)

P

O

CHO

HOP

OOH

OH

OH

(CH 2)3

C NH R1R2

O

C

O

n

OC

CH 3

C

H

O

OC

H 3C H

C

O

OC

CH 3

C

H

O

OC

H 3C H

NH 2

y*

-[(C6H8O4)x(C4H4O4)y]n- RESOMER 502 H

+

ACIDO ALENDRONICO

CONIUGATO AMMIDICO

x*

93

C

O

n

OC

CH 3

C

H

O

OC

H 3C H

C

O

OC

CH 3

C

H

O

OC

H 3C H

y*

-[(C6H8O4)x(C4H4O4)y]n-

x*

Sintesi 1

Attivazione del carbossile via EDAC

Attivazione del carbossile via N-idrossisuccinimmide

Sintesi 2

2° Step: coniugazione dell’alendronato sodico al polimero attivato

94

3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, 1H-NMR

95

540.7

03

598.9

63

526.6

68

568.8

44

627.0

91

584.9

07

715.5

77

657.2

19

685.4

74

743.6

93

775.8

19

805.9

07

834.0

18

892.2

01

922.2

78

950.3

77

862.1

04

980.4

46

1008.5

35

1052.6

41

1080.7

27

1124.8

11

1152.9

01

1182.9

49

1299.1

38

1341.2

39

1210.9

97

1253.1

07

1399.3

08

1369.2

94

1441.4

00

1515.4

23

1471.3

65

1557.4

78

1603.4

29

1659.4

82

1689.4

72

1629.4

85

1731.4

74

1805.4

65

1759.4

90

1847.4

02

1877.3

73

1935.3

37

1905.3

42

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

5x10

Inte

ns. [a

.u.]

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

1557.4

78

1603.4

29

1571.4

82

1659.4

82

1689.4

72

1661.4

66

1543.4

07

1587.4

48

1629.4

85

1585.5

30

1573.4

14

1731.4

74

1717.5

02

1643.4

91

1545.3

79

1559.4

16

1599.5

07

1645.4

451631.4

47

1615.4

48

1715.5

08

1617.4

07

1703.4

33

1673.5

01

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

1540 1560 1580 1600 1620 1640 1660 1680 1700 1720 1740

m/z

Resomer 502H

847.9

76

789.7

90

906.1

57

1050.5

65

992.4

21

1108.7

03

1022.4

82

703.4

61

761.6

69

819.8

68

862.0

29

1253.0

07

1194.9

02

1152.7

96

1311.0

96

645.1

10

934.2

54

1078.6

43

1283.0

40

1369.1

80

747.6

19

962.3

27

1325.1

26

717.5

24

1427.2

36

1222.9

53

689.4

09

1399.1

95

586.8

67

616.9

85

558.7

33

659.1

75

1499.3

13

1557.3

47

528.6

29 572.7

94

1629.3

73

1455.2

71

1659.3

58

1773.3

581585.3

50

1529.2

91

1831.3

34

1861.2

89

1687.3

60

1801.3

73

1903.2

72

1933.2

21

1715.3

66

1745.3

27

1961.2

20

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

1557.3

47

1571.3

62

1629.3

73

1573.3

31

1659.3

58

1559.3

26

1687.3

74

1631.3

43

1555.3

64

1701.3

78

1613.3

94

1543.3

12

1585.3

50

1671.3

97

1689.3

58

1541.3

38

1615.3

50

1643.3

64

1601.3

27

1627.3

97

1599.3

62

1673.3

51

1715.3

66

1745.3

27

1731.3

20

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

1540 1560 1580 1600 1620 1640 1660 1680 1700 1720 1740

m/z

1557.3

47

1571.3

62

1629.3

73

1573.3

31

1659.3

58

1559.3

26

1687.3

74

1631.3

43

1555.3

64

1701.3

78

1613.3

94

1543.3

12

1585.3

50

1671.3

97

1689.3

58

1541.3

38

1615.3

50

1643.3

64

1601.3

27

1627.3

97

1599.3

62

1673.3

51

1715.3

66

1745.3

27

1731.3

20

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

1540 1560 1580 1600 1620 1640 1660 1680 1700 1720 1740

m/z

PLA/PLGA-Ale

3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, MALDI-TOF

96

3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, DSC

Curve DSC di PLGA (a), PLGA-ALE coniugato (b), PLGA/ALE miscela fisica (c) e alendronato sodico (d).

97

Test di emolisi: il Resomer 502H ed il coniugato polimerico non mostrano avere effetti emolitici;

4° Step: Test di biocompatibilità in vitro

Effetto del coniugato polimerico sulla fase plasmatica della coagulazione: alte concentrazioni di campione (10-4 e 10-5 M) inducono un decremento dell’attività protrombinica (PT) ed un importante estensione del Tempo di Attivazione Parziale della Tromboplastina (APTT). Basse concentrazioni (10-6 - 10-8 M) non hanno effetti sulla fase plasmatica di coagulazione. Il coniugato polimerico non determina importanti variazioni nella concentrazione di fibrinogeno rispetto al DMSO;

Neutral red test su cellule endoteliali: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità delle cellule (Kruskal-Wallis test p=0.6058.

Neutral red test su osteoblasti: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità degli osteoblasti (Kruskal-Wallis test p=0.9781).

100

5°Step: Preparazione e caratterizzazione delle nanoparticelle a partire dal coniugato ammidico

•Nanoparticelle del coniugato PLA/PLGA-Ale sono state preparate in accordo con il metodo della nanoprecipitazione usando la tecnica di evaporazione del solvente.

•Le nanoparticelle così ottenute sono state sterilizzate mediante due tecniche:

filtrazione sterilizzante con filtri da 0,45 msterilizzazione con raggi

•Dinamic Light Scattering

101

0 100 200 300 400 500 6000

2

4

6

8

10

12

Size (nm)

Inte

nsi

ty

Np-PLA/PLGA-Ale DMSO/Acetone (1:1 v:v) Np-PLA/PLGA-Ale KCps ZAve Poly Fit

1 46,5 182,2 0,144 0,0004

2 45,7 179,8 0,174 0,0004

3 45,8 183,0 0140 0,0003

Average 46,0 181,7 0,153

+/- 0,5 1,7 0,019

Np-PLA/PLGA-Ale Kcps Mob Zeta Width

1 891,1 -2,920 -36,5 6,0

2 814,2 -3,164 -39,4 0,1

3 730,6 -3,283 -40,8 0,1

Average 812,0 -3,122 -38,9 6,0

+/- 80,3 0,185 2,2 0,1

102

6°Step: Incapsulazione delle nanoparticelle con Doxorubicina

7°Step: Valutazione del loading di Doxorubicina

Le nanoparticelle fatte dal coniugato PLGA/Ale e Doxorubicina usando il metodo della nanoprecipitazione appaiono essere sferiche e mostrano una distribuzione omogenea e un basso indice di polidispersione.

60x 40X

Efficienza di incapsulazione: 61%

103

8°Step: Saggio per l’affinità all’idrossiapatite (HA) di nanoparticelle di PLGA-ALE

Sembra che l’affinità aumenti con il tempo d’incubazione ed è proporzionale alla concentrazione di idrossiapatite nella sospensione. In particolare mentre alla concentrazione di 1mg/ml di HA, i due tipi di nano particelle non mostrano nessuna evidente differenza in termini di riduzione di assorbanza di Oil red O e quindi di assorbimento all’HA. Ad alte concentrazioni del sale (5 mg/mL) le nano particelle di PLGA-ALE rimangono legate all’HA maggiormente che quelle di solo PLGA mostrando un 43 e un 50% di incremento di affinità rispettivamente dopo 15 e 30 min.

104

In questo lavoro lo scopo è stato quello di realizzare un carrier polimerico per il trasporto di farmaci al tessuto osseo malato, un coniugato tra il PLGA 50:50 e l’amino bisfosfonato ALE, quindi questo è stato sintetizzato e caratterizzato. Da questo coniugato di partenza sono state preparate nano particelle dalle dimensioni comprese tra 200 e 300 nm con il classico metodo di evaporazione del solvente. Il PLGA-ALE non causa emolisi o alterazioni della fase plasmatica di coaugulazione in vitro o effetti citotossici su cellule endoteliali e osteoblasti trabecolari, quindi dimostrandosi un ottimo prodotto di partenza per il caricamento di farmaci come quello descritto.

Conclusioni

105

RINGRAZIO…

Prof.re Francesco Castelli Dott.ssa Maria Grazia Sarpietro Prof.re Rosario Pignatello Prof.re Gaetano Giammona Dott. re Nicola Baldini e la Dott.ssa Cenni Elisabetta

(Istituto Rizzoli, Bologna) Dott.ssa Valentina Pantò & Co. “TUTTO IL MIO LAB.”

…e voi tutti per la cortese attenzione!