Produzione di agenti terapeutici

AGENTI TERAPEUTICI RICOMBINANTI

Vantaggi

Produzione in grande quantit a costi ridotti

Sicurezza (es: GH e fattori della coagulazione)

Possibilit di ingegnerizzazione

Geni di proteine (potenziali agenti terapeutici) clonati:

>500

Agenti terapeutici di origine biotecnologicaautorizzati da FDA:

50

NB: Dati del 2001

Recombinant Biopharmaceutical Products in the U.S. MarketRecent FDA Approvals

2006: Insulin, rDNA, inhaled/Pfizer [Exubera Insulin, recombinant powder for inhalation]; Treatment of adults with type 1 and type 2 diabetes.

2005: CTLA4-Ig, rDNA [Orencia; Abatacept; cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen 4--Immunoglobulin G1 fragment fusion protein, recombinant] Bristol-Myers Squibb Co. Treatment of rheumatoidarthritis in moderate to severe adult patients.

Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica [Insulin-like Growth Factor-1, recombinant IGF-1] Treatment of growth failure in children with severe primary IGF-1 deficiency (Primary IGFD) or with growth hormone (GH) gene deletion who have developed neutralizing antibodies to GH.

Hyaluronidase, rDNA [Hylenex; Chemophase; rHuPH20; PH-20 hyaluronidase, recombinant human]. To enhance the delivery of local anesthesia, contrast agents, and for subcutaneous fluidreplacement (hypodermoclysis).

PDGF, rDNA/Bone matrix [Platelet-derived growth factor (PDGF)-BB, recombinant with inorganicbone matrix] Treatment of periodontal bone defects and associated gingival recession.

Calcitonin, rDNA [Calcitonin (salmon) - Fortical; calcitonin, recombinant] Treatment of postmenopausal osteoporosis

Insulin detemir, rDNA - [Insulin detemir, recombinant - Levemir] Treatment of diabetes mellitus(type 1 and type 2; [a long-acting recombinant insulin analog]

MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI

Isolamento dei cDNA negli anni 80

IFN, IFN: sintetizzati da vari tipi di cellule in risposta a uninfezione virale

IFN: secreto principalmente da cellule T CD8+. Induce lespressione delle proteine MHC di classe I e II, e favorisce la presentazione dellantigene.

sintetizzato in risposta ad agenti che stimolano la crescita cellulare (inibitore della proliferazione)

IFN 23 varianti

19-26 kDa

Estremit N-terminale variabile

Parte centrale o C-terminale pi conservata

I vari sottotipi hanno tutti attivit antivirale e antiproliferativa sebbene con specificit diverse

60 92 150

MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI

Induzione della sintesi di (2-5) oligonucleotide sintetasi

Oligonucleotidi 2-5

Attivazione di una ribonucleasi cellulare latente che taglia mRNA virale

Attivit di alcuni IFN ibridi:

Attivit antiproliferativa maggiore in vari tumori

1

2

MANIPOLAZIONE DELLORMONE DELLA CRESCITA

hGH nativo pu legarsi al proprio recettore o al recettore della prolattina

=> Modificazione del sito di legame con il recettore della prolattina tramite MUTAGENESI SITO-SPECIFICAallo scopo di evitare effetti collaterali nel corso della terapia

(His18, His21, Glu174)

Ulteriori studi necessari per approvazione FDA

Ottimizzazione dellespressione

Selezione del sistema di espressione ottimale allo scopo di ottenere:

- Un prodotto autentico

- Una quantit sufficiente per clinical trials e

commercializzazione

Livelli di sintesi di interleuchina 3 in diversi ospiti

Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica

Malattia ereditaria ad esito fatale tra le picomuni

Individui affetti suscettibili di contrarre infezioni polmonari batteriche

I batteri causano accumulo di muco nei polmoni

Il muco formato da DNA e polisaccaridi

Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica

- DNasi I

- ALGINATO LIASI

Dnasi I

Pulmozyme (Genentech)

- Dnasi I umana ricombinante

- Clonaggio, espressione, purificazione

- Somministrazione tramite aerosol

- Riduce la viscosit del muco

Approvazione FDA

- 123 milioni di $ di vendite nel 2001

Alginato

-polisaccaride costituito da -D-mannuronato e -L-guluronato, che da luogo a legami trasversali fissando ioni Ca++

-secreto dai ceppi mucoidi di Pseudomonasaeruginosa

Alginato liasi

Isolamento del gene alginato liasi

- da una specie di Flavobacterium

- screening di una genoteca in E. coli

in che modo?

1. Piastratura dei cloni su terreno solido contenente alginato

2. Aggiunta di Ca++: il terreno diventa opaco.

3. Rimane un alone trasparente attorno alle colonie esprimenti alginato liasi che hanno idrolizzato lalginato

4. Analisi del DNA clonato, espressione e caratterizzazione della proteina

63 kDa

23 kDa40 kDa

Alginato liasi di Flavobacterium

Amplificazione tramite PCR del tratto codificante per lenzima di 40 kDa

Clonaggio in Bacillus subtilis:

=> Alginato liasi secreta nel mezzo di coltura e funzionante su alginato prodotto da P.aeruginosa

Ulteriori studi necessari per approvazione FDA

AGENTI TERAPEUTICI BASATI SU ANTICORPI MONOCLONALI

IgG umanizzateIgG murine IgG chimeriche uomo-topo

Trattamento con papainaAttiva la cascata del complementoSi lega ai recettori per lFc di cellule:-ADCC-fagocitiche

Struttura degli anticorpiCDR=regioni determinanti la complementariet

Bindingantigene

Anticorpi monoclonali come immunosoppressori: OKT3

T cell

CD3

OKT3

T cell

CD3

Farmaco potente ma con effetti collaterali importanti

Blocco della funzione delle cellule T

in via di sviluppo: HuM291 (mAb umanizzato)

Anticorpi monoclonali coniugati

PA

Esempio di utilizzo di MAb coniugati

Esempio di utilizzo di MAb coniugati

Radioimmunoterapia pre-targeted

Esempio di utilizzo di MAb coniugati

Problemi riscontrati nellutilizzo di anticorpimonoclonali:

1.Accoppiamento chimico difficoltoso e poco riproducibile

2.Limpiego di MAb di origine NON umana presenta problemi di reazioni crociate e sensibilizzazione

Bisogno di MAb UMANI

Estrema difficolt nel produrre MAbs UMANI con la tecnica dellibridoma

a) Cromosomi instabili in ibridomi linfociti

umani/mieloma murino

b) Non sono disponibili idonee linee cellulari di

mielomi umani

c) Ragioni etiche

Possibili soluzioni:

1.Introduzione (trapianto) di PBLs (peripheralblood lymphocytes) umani in un topo scid

2.Creazione di topi transgenici capaci di produrre unimmunoglobulina umana e selezione dei cloni con la normale tecnica dellibridoma

3.Utilizzare la tecnologia del DNA ricombinante

Produzione di anticorpi chimerici uomo-topo

Produzione di anticorpi umanizzati

Produzione di anticorpi umanizzati (I)

1) Ibridoma di topo isolamento del cDNA delle catene L e H

2) Amplificazione tramite PCR delle regioni variabili (VH e VL), clonaggio e sequenziamento

3) Analisi della sequenza e identificazione delle CDR

Coda di 12 nucleotidicomplementari alle regioni FR del DNA umano

4) Sintesi di 6 coppie di primers (3 CDRL + 3 CDRH)

5)

Produzione di anticorpi umanizzati (II)

6) 6 cicli di mutagenesi per sostituire atrettantiframmenti CDR

7) Clonaggio dei geni ricombinanti codificanti catene H e L in vettori di espressione

8) Introduzione in cellule ospiti idonee (E. coli o di mammifero) e produzione degli anticorpi

Produzione di anticorpi umanizzati (III)

>100 anticorpi monoclonali umanizzaticon questa tecnica

20 in sperimentazione clinica

SVANTAGGI:Tecnica laboriosa e costosa

PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI

PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI

Espressione di un frammento Fv anticorpale assemblato

PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI

M13 COME ALTERNATIVA AL BATTERIOFAGO 3

PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI

Single chain Fv antibody

Per consentire un giusto orientamento dei peptidi

Disulfide-stabilized Fv antibody

Anticorpi monoclonali umanizzati contro il diabete di tipo 1

- malattia multifattoriale: cause genetiche e ambientali- Linfociti T si attivano e distruggono le cellule beta del pancreas che

producono insulina

Keymeulen et al. New England J. of medicine 2005 Jun 23;352(25):2598-608[Trial Clinico fase II]

-Anticorpi monoclonali anti CD3 umanizzati -80 malati (40 anticorpo -40 placebo)

Miglioramento per 12 pazienti il cui livello di produzione di insulina era gia alto.

Per gli altri pazienti (28) il bisogno di insulina rimasto stabile. Effetti collaterali non gravi e passeggeri

Nome generico Origine Isotipo Target Indicazioni Anno approvaz.

mAbs non coniugatiTrastuzumab(Herceptin)

Umanizzato IgG1 umane HER2/neu Cancro al seno 1998

Rituximab(Rituxan)

chimerico IgG1 umane CD20 Linfoma 1997

Cetuximab(Erbitux)

chimerico IgG1 umane Recettori EGF

Cancro al colon-retto

2004

Bevacizumab(Avastin)

chimerico IgG1 umane VEGF Cancro al colon-retto, polmone

2004

Alemtuzumab (Campath- 1H)

Umanizzato IgG1 umane CD52 Leucemia linfocitica cronica

2001

ImmunoconiugatiIbritumomab tiuxetan(Zevalin) insieme a rituximab

Murino IgG1 murine radiomarcato 90Y

CD20 Linfoma 2002

Tositumomab e 131I tositumomab (Bexxar)

Murino IgG2a murine radiomarcato 131I

CD20 Linfoma 2003

Gemtuzumab (Myelotarg)

Umano (farmaco derivato da streptomyces)

IgG4 umana coniugato con calicheamicina

CD33 Leucemia mieloide acuta

2000

mAb utilizzati come agenti terapeutici nella terapia contro il cancro

FARMACI CONTRO HIV

Anticorpi anti-CD4

Proteina CD4 libera

Proteina di fusione CD4-Fc1. Legame alla gp120

2. Legame alle cellule recettrici

di anticorpi (risposta ADCC)

Uccisione selettiva delle cellule infettate da HIV

When a HIV particle binds to a cell, the interaction of gp120 withCD4 changes gp120's shape. This in turn changes the shape of gp41, in such a way that the gp41 helps to initiate the process of membrane fusion betweenvirus and cell.

T-20 is a peptide (a 36 amino acid chain) with amino acid sequences that are identical to a segment of the heptadrepeat (HR-1 and HR-2) regions of the gp41 molecule on the HIV envelope.

The drug binds to the HR-1 region and disrupts interactionsbetween HR-1 and HR-2 that normally draw HIV into contact with the target cell. By blocking this step, T-20 blocks cellfusion, and consequently, HIV's entry into the cell.

FUZEON (T20)http://www.fuzeon.com

To identify natural HIV-1 inhibitors we screened a comprehensive peptide librarygenerated from human hemofiltrate. The most potent fraction contained a 20-residue peptide, designated VIRUS-INHIBITORY PEPTIDE (VIRIP), corresponding to the C-proximal region of 1-antitrypsin, the most abundantcirculating serine protease inhibitor.

We found that VIRIP inhibits a wide variety of HIV-1 strains including thoseresistant to current antiretroviral drugs. Further analysis demonstrated that VIRIP blocks HIV-1 entry by interacting withthe gp41 fusion peptide and showed that a few amino acid changes increase itsantiretroviral potency by two orders of magnitude.

Thus, as a highly specific natural inhibitor of the HIV-1 gp41 fusion peptide, VIRIP may lead to the development of another class of antiretroviral drugs.

Mnch et al.Discovery and Optimization of a Natural HIV-1 Entry InhibitorTargeting the gp41 Fusion PeptideCell 129, 263-275, 20 April 2007

Animali transgenici come bioreattori

Produzione di agenti terapeutici