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16.1 INTRODUZIONE
Figura 16.1Campi di applicazione delle colture in vitronel miglioramento genetico delle piante e nell’attività vivaistica.
3
Figura 16.2Panoramica di una camera di crescita (A) e particolare di vasi contenenti espianti vegetali al termine di una subculturadi proliferazione (B).
A
B
16.2 MICROPROPAGAZIONE
4
Figura 16.3Modelli di rigenerazione in vitrosecondo A. Standardi et al. (1999).
16.2 MICROPROPAGAZIONE
5
Figura 16.4Esempi di organogenesi ed embriogenesi diretta e indiretta, rispettivamente in giglio (A-C) e in melo (D-E)(foto: A. Standardi).
A B
D
C
E
16.2 MICROPROPAGAZIONE
6
Figura 16.5Schema di micropropagazionecon espianti di diversa natura(fonte: A. Standardi).
PROPAGAZIONE PER GERMOGLI ASCELLARI
16.2 MICROPROPAGAZIONE
7
Figura 16.6Propagazione in vitro: dal germoglio iniziale alla plantula radicata. Fasi di allestimento (A), proliferazione (B) e radicazione (C) del portinnesto M26 di melo.
A B C
PROPAGAZIONE PER GERMOGLI ASCELLARI
16.2 MICROPROPAGAZIONE
8
Figura 16.7Dosaggi di citochinine e auxine in relazione alle esigenze (emissione di germogli o radici oppure alla produzione di callo) della coltura in vitro.
ORGANOGENESI
16.2 MICROPROPAGAZIONE
9
ORGANOGENESI
Figura 16.8Processi di caulogenesi e rizogenesi a partire, rispettivamente, da callo di ginestrino (organogenesi indiretta) (A) e da tessuti fogliari di melo (organogenesi diretta) (B) (foto: A. Standardi).
A
B
16.2 MICROPROPAGAZIONE
10
Figura 16.9Fasi dell’embriogenesi somatica.
EMBRIOGENESI
16.2 MICROPROPAGAZIONE
11
EMBRIOGENESI
Figura 16.10Formazioni embrioidiche riconducibili agli stadi a sfera, cuore e torpedo.
16.2 MICROPROPAGAZIONE
12
Figura 16.11aFasi dell’embriogenesi somatica in carota.
EMBRIOGENESI
A
B
Figura 16.11bCallo con strutture embrioidiche (A) ed embrione somatico maturo di erba medica (B).
16.2 MICROPROPAGAZIONE
13
Figura 16.12Coltura di calli su piastra Petri (A)e particolari di espianto in fase di formazione del callo (B) e di callo in fase di proliferazione (C).
A
B C
16.3 COLTURE DI CALLIE SOSPENSIONI
CELLULARI
14
Figura 16.13Sospensione cellulare: beuta con sospensione liquida (A), piastra con sospensione concentrata (B) e particolare degli aggregati cellulari del callo (C).
A
B
C
16.3 COLTURE DI CALLIE SOSPENSIONI
CELLULARI
15
Figura 16.14Fasi per l’ottenimento di colture cellulari in sospensione(modificata da: E.F. George, 1993).
16.3 COLTURE DI CALLIE SOSPENSIONI
CELLULARI
16
Figura 16.15Curva di crescitadi una sospensione cellulare.
16.3 COLTURE DI CALLIE SOSPENSIONI
CELLULARI
17
Figura 16.16Strutture di alcaloidi biologicamente attivi e piante che li producono (fonte: T.M. Kutchan, 1995).
METABOLITI SECONDARI
16.3 COLTURE DI CALLIE SOSPENSIONI
CELLULARI
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Tabella 16.1Varianti somaclonali isolatein mais ed erba medica.
16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE
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Figura 16.17Ottenimento di calli chimericie rigenerazione di mutanti.
16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE
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Figura 16.18Livello di variabilità genetica nelle piante rigenerate in relazione al tipo di espianto.
16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE
21
Tabella 16.2Varianti somaclonali riguardanti la resistenza a stress biotici originatisi durante la colturain vitro nelle piante da frutto(modificato da: F.A. Hammershlag, 1992).
16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE
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Figura 16.19(A) Uniformità dei profili RAPD generati con il primer OP-P7 impiegando DNA genomico isolato dalle plantule rigenerate mediante ABP e subcololturate per 12 mesi.(B-G) Variabilità dei profili RAPD generati da diversi primer 10-mer impiegando DNA genomico isolato da alcune delle plantule rigenerate mediante ISE.
A
B C D
E F G
16.4 VARIAZIONE SOMACLONALE
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16.5 EMBRYO RESCUE:RECUPERO IN VITRO DI
EMBRIONI
Figura 16.20Embryo rescue:esempio di recupero in vitro di embrioni di Poa
pratensisindotti in vivo mediante trattamenti auxinici.
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16.5 IBRIDAZIONE SOMATICAMEDIANTE FUSIONE DI
PROTOPLASTI
Figura 16.21Schema di ibridazione somatica: isolamento e fusione dei protoplasti,riconoscimento degli eterocarionti, proliferazione del calloe rigenerazione delle piante anfidiploidi.
25
Figura 16.22Rappresentazione schematica dei prodotti di fusione ottenibili con l’ibridazione somatica.
16.5 IBRIDAZIONE SOMATICAMEDIANTE FUSIONE DI
PROTOPLASTI
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Figura 16.23Ibridazione somatica tra M. sativa eM. arborea usando protoplasti isolati da callo o sospensione cellulare e protoplasti isolati da mesofillo fogliare.(A-D) fusione dei protoplasti;(E) protoplasti da mesofillo;(F) protoplasti da callo;(G) prodotto di fusione con fluorescenzarossa (cloroplasti) e giallo-verde (FITC);(H) microcallo;(I) plantula rigenerata;(L) analisi isoenzimatica delle esterasi nelle linee parentali e nell’ibrido somatico(foto: S. Arcioni).
A B C D
E F G
H
I L
16.5 IBRIDAZIONE SOMATICAMEDIANTE FUSIONE DI
PROTOPLASTI
27
Tabella 16.3Condizioni di reazione per l’isolamento di protoplasti in tabacco e nei cereali.
16.5 IBRIDAZIONE SOMATICAMEDIANTE FUSIONE DI
PROTOPLASTI
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COLTURE IN VITROF. K. SKOOG E T. MURASHIGE
Figura 16.24Folke K. Skoog (1908-
2001).
16.5 IBRIDAZIONE SOMATICAMEDIANTE FUSIONE DI
PROTOPLASTI
29
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESIFigura 16.25Rappresentazione schematica della coltura di antere per l’ottenimento di piante omozigoti.
30
Figura 16.26Modelli di sviluppodella microsporafino alla formazione di un proembrione androgenetico.
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
31
Figura 16.27Tipi di morfogenesi:differenziazione diretta e indiretta di piante aploidi a partire dal proembrione androgenetico.
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
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Figura 16.28Rappresentazione schematicadi una spighetta (A); struttura fioraletipica delle graminacee con in evidenzaantere e pistillo (B).
A
B
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
33
Figura 16.29Sviluppo dei boccioli fiorali (A) in relazione agli eventi della microsporogenesi (B) in peperone: tetrade di microspore, polline immaturo uni, bi e trinucleato maturo.
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
34
Tabella 16.4Costituzione di alcuni substrati di coltura idonei per l’induzione(m-l) androgenetica delle spore, la rigenerazione (m-R) e il mantenimento (m-M) delle plantule androgenetiche.
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
35
Figura 16.30Processo di androgenesiin peperone:(A) microspora uninucleata;(B) microspora binucleata (con nucleo vegetativo e generativo);(C) microspora trinucleata;(D) microspora tetranucleata (con soli nuclei vegetativi);(E) microspora plurinucleata (con un nucleo generativo);(F) proembrione (sono visibili le pareti cellulari);(G-I) antere con calli e plantule in rigenerazione;(L) plantule aploidi;(M) piante diploidizzate;(N) metafase aploide;(O) metafase diploide.
A B C D
E F G H
I L
M N
O
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
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Figura 16.31Processo di androgenesi in loietto:(A) porzione di antera con microspore;(B) microspora matura;(C-D) microspora bi- e tetranucleata(V = nuclei vegetativi);(E) microspora plurinucleata con due nuclei generativi (G);(F) proembrioni entro l’antera;(G) proembrioni con parete cellulare ricostituita (W);(H) antera con calli in formazione;(I) antere con strutture proembrionali;(L) embrione androgenetico;(M) callo in fase di rizogenesi;(N) particolare dell’apice radicale;(O) emissione del germoglio;(P) plantula rigenerata;(Q) plantula albina;(R) metafase aploide (n=x=7).
G
A B C D
E F HG
I L M N
O RP Q
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
37
Figura 16.32(A) Cariotipo di una pianta aploide androgenetica (3200 X);(B) cariotipo di una pianta diaploide androgenetica (3200 X) costituiti, rispettivamente, da 10 cromosomi metacentrici o sub-metacentrici e due cromosomi acrocentrici; uno degli acrocentrici presenta un satellite, mentre uno dei sub-metacentrici è molto più lungo dei restanti del corredo(la freccia indica il satellite).
A
B
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
38
Figura 16.33Pianta diaploide di peperone alla maturazione dei
frutti;(B-C) differenze nella dimensione e nella forma dei
fruttitra genotipi donatori e diaploidi;(D-G) variabilità del numero, della forma e della
dimensionedei semi riscontrata nei frutti delle piante diaploidi.
A B C
D E F G
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
39
Tabella 16.5Schema di costituzione di una varietà di frumento impiegando la coltura di antere(H deriva dal termine inglese haploid).
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
40
Tabella 16.6Principali risultati ottenuti con la colturadi antere nelle specie arboree.
16.6 OTTENIMENTO DI APLOIDI MEDIANTE
ANDROGENESI E GINOGENESI
41
16.7 SEME SINTETICO
Figura 16.34(A) Embrione somatico maturo di erba medica; (B) Embrione incapsulato in alginato di sodio(seme sintetico).
A
B
42
Figura 16.35Confronto tra embriogenesi somatica e
zigotica.
16.7 SEME SINTETICO
43
Figura 16.36Protocollo di incapsulamento di materiale di propagazione rappresentato da microtalee ed embrioni somatici(fonte: M. Micheli).
16.7 SEME SINTETICO
44
Figura 16.37Propaguli bipolari e unipolari ottenuti in vitro per la produzione di seme sintetico: (A) embrione somatico di finocchio (Foeniculum vulgare); (B) bulbillo di giglio (Lilium longiflorum Thumb.); (C) microtalea ascellare del portainnesto M26 di melo (foto: M. Micheli).
16.7 SEME SINTETICO
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Tabella 16.7Elenco delle specie dove sono stati impiegati propaguli vegetatividerivati in vitro di natura non embrioidica per l’ottenimento di semi sintetici.
16.7 SEME SINTETICO
