Post on 17-Aug-2020
VALIDAZIONE DI UN METODO EFFICACE PER LO
STUDIO FARMACOCINETICO DELLA NICOTINA
Università degli studi di Catania
Scuola di Medicina e Chirurgia
Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico
Tesi di Laurea
Sonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia Saitta
RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante
CORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri Conti
La sigaretta rappresenta attualmente un vero e proprio fenomeno socio
economico e di costume a livello globale.
Glamour women
Lo studio della farmacocineticafarmacocineticadella nicotina è considerato uno
strumento conoscitivo fondamentale
per la delucidazione dei meccanismi
di assorbimento e di efficacia
correlati all’uso dei nuovi dispositivi
antifumo se comparati all’assunzione
di nicotina mediante il fumo di
sigaretta tradizionale.
CYP2A6 è il più importante P450 per la C-ossidazione della nicotina
La nicotina assunta ha un'emivita di circa 2h
metaboliti: nicotina-N-ossido, nornicotina e
cotininacotinina
Circa il 70-80% della dose viene
C-ossidata dal citocromo P-450 nel fegato
E’ stato avviato un progetto pilota per la valutazione della farmacocinetica della nicotina
assunta tramite e-cig rispetto all’assunzione tramite fumo tradizionale in volontari
arruolati presso il Centro per la Prevenzione e Cura del Tabagismo (Dip. Di Biomedicina
Clinica e Molecolare - Prof. Polosa research group).
Il progetto (PRE-ELECT) è quindi integrato in uno studio volto a definire i protocolli perIl progetto (PRE-ELECT) è quindi integrato in uno studio volto a definire i protocolli per
lo studio multicentrico nazionale (ELECT).
• RP-HPLC-UV;
• LC/MS/ESI TQD o LC/MS/APCI -TQD;
• GC-NPD;
Metodi di determinazione Metodi di determinazione
citati in letteratura citati in letteratura
• GC-NPD;
• tecniche immunoenzimatiche.
VANTAGGI• Qualità fase preparativa.
• Utilizzo standard interno
(acetalinide).
• Bassi valori di LOD e LOQ (alta
sensibilità).
• Validato per urine e sangue.
SVANTAGGI• Non validato per la caffeina.
• Non tiene conto della
coeluizione della caffeina
con la cotinina.
La caffeina è una sostanza idrofilica simile alla cotinina e ciò può comportare una
coeluizione con conseguente interferenza nel segnale.
Metodo di Massadeh modificato
Abbiamo sviluppato e validato un metodo
RP-HPLC-UV efficace ed efficiente votato
alla determinazione di concentrazioni di
nicotina, cotinina e caffeina in multiresiduo innicotina, cotinina e caffeina in multiresiduo in
campioni ematici.
È stata esclusa la spettrometria di
massa
• costi dispendiosi
• notevole background richiesto
all’operatore
PROBLEMATICA SOLUZIONE
Sovrapposizione standard
interno (dati non confrontabili
con quelli di Massadeh)
Correzione con standard
esterno e prove di recupero
Stabilità del campione
preparato di ~8h
Iniezione di 7-8 campioni per
volta
La nicotina permane in traccia
all’interno della colonna
Separazione analitica con
eluizione isocratica in
tampone + pulizia accessoria
in ACN.
L’HPLC è una tecnica di cromatografia liquida che consente di separare i
composti di una miscela, sfruttando la loro differente affinità nei confronti di una
fase stazionaria, contenuta all’interno di una colonna cromatografica, attraverso
cui fluisce la fase mobile.
Eluizione isocratica: tampone costituito da una miscela di 0,544 g di KH2PO4;
0,368 g di sodio n-eptano-solfonato (donatore di coppia ionica); 1640 ml di
acqua MilliQ e 360 ml di metanolo.
pH della fase mobile ≈ 3,2
flusso: 1,0 mL/min
ʎ: stata programmata a 254 nm da 0 a 18 min e a 260 nm da 18 a 30 minʎ: stata programmata a 254 nm da 0 a 18 min e a 260 nm da 18 a 30 min
Colonna Knauer C18 con precolonna
I recuperi su campioni di plasma fortificato sono stati del 110% per la nicotina, del 110%
per la caffeina e del 91% per la cotinina e le linearità (R2) calcolate sono stata
rispettivamente di 0,9976 per la nicotina, di 0,9991 per la caffeina e di 0,9996 per la
cotinina.
LOD e LOQ sono stati calcolati
sulla scorta del rapporto
segnale/rumore rispettivamente
pari a 3:1 e 6:1.pari a 3:1 e 6:1.
ng/ml LOD LOQ
cotinina 10,9 35
caffeina 7 22,50
nicotina 13,7 43,7
Nello studio pilota (PRE-ELECT) 98 campioni di sangue sono stati raccolti da 14
volontari (selezionati accuratamente tra pazienti del Centro Antifumo del Policlinico di
Catania) che si sono astenuti per 12h dal consumo di caffè e prodotti del tabacco con/e
senza combustione prima dell’esposizione controllata a fumo di sigaretta (volontari della
serie C) e di e-cig (volontari della serie O).
Per testare la capacità di rilevazione del metodo messo a punto abbiamo analizzato 14
campioni ematici di cui 7 da un volontario che aveva fumato e-cig (01-Tx-O) e 7 da uno
cha aveva fumato la sigaretta tradizionale (04-Tx-C).
• 4mL di sangue di ciascun volontario sono stati raccolti in provette con EDTA;
• centrifugati immediatamente a 2800 rpm per 5 min;
• il plasma surnatante è stato raccolto poi in provette eppendorf e qui
congelati a -80°C fino al momento dell'analisi.
Protocollo di estrazione del campione
Raccolta e conservazione
• 0,5 mL di plasma è stato posto in una provetta di vetro 100µL di acetanilide in metanolo al 50% (standard
interno);
• ogni campione è stato alcalinizzato con 100mL di NaOH (2,5M) e vortexato per 30 s.
• l’estrazione è stata eseguita mediante aggiunta di 3mL di una soluzione 1:1 di diclorometthane/diethyletere,
agitazione per 2 min;
• la fase organica separata è stata prelevata accuratamente e trasferita in un nuova provetta di vetro
contenente 20µL di HCl (0,25M);
Protocollo di estrazione del campione
• La fase organica è stata evaporata in corrente di
azoto a temperatura ambiente fino a secchezza
completa;
• La fase organica è ricostituita quindi con 250µL di
fase mobile in vials di vetro da 2mL fornita di
riduttore;
• (100µL) Iniettati nel sistema cromatografico HPLC.• (100µL) Iniettati nel sistema cromatografico HPLC.
Volontario svapatore
Volontario fumatore di sigaretta tradizionale
E-cig
Sigaretta
La lettura dei 14 campioni ha testimoniato la capacità e l’affidabilità del metodo per una
sua applicazione in studi di farmacocinetica della nicotina
La valutazione della caffeina non è una scelta opzionale.
Ad oggi tutti i dati di letteratura (astensione del volontario dal consumo di caffè)
risultano non veritieri dato che l’esposizione inalatoria della caffeina attraverso
il fumo è sempre stata sottostimata o non giustamente considerata.
La disponibilità di dati corretti e più rispondenti alla realtà oggettiva permetterà la
conoscenza della:
• reale concentrazione della nicotina assorbita e della cotinina prodotta;
• reale farmacocinetica della nicotina.
Entrambi questi fattori sono di fondamentale importanza in termini di guadagno in
salute pubblica per le loro implicazioni nella valutazione e gestione dei rischi
derivanti dall’esposizione attiva e passiva a fumo tradizionale e elettronico.