CNR-IBBA

Vincenzo LongoIstituto di Biologia e Biotecnologia Agraria

CNR, PisaEmail: v.longo@ibba.cnr.it

PROPRIETA’ NUTRACEUTICHE DI CARNE BOVINA DA AGRICOLTURA SIMBIOTICA

1

2

Uno degli obiettivi dell’Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria

Sede Secondaria di Pisa-CNR è

valorizzare alimenti di qualità ottenuti con tecniche sostenibili ed

innovative focalizzando l’attenzione sulle proprietà nutraceutiche

CNR-IBBA

L’agricoltura eco-simbiotica si basa

sul principio che per migliorare le

tecniche produttive una delle

possibilità più innovative da

esplorare è il ricorso all’utilizzo di

microrganismi come biostimolanti

delle piante.

Sui terreni coltivati viene rispettata

la turnazione e non sono utilizzati

fertilizzanti chimici, pesticidi né

antibiotici ma funghi arbuscolari

micorrizici.

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L’obiettivo del nostro lavoro:

caratterizzare la carne proveniente da animali

di razza bovina piemontese allevati

con agricoltura eco-simbiotica.

Parte I: Caratterizzazione

biochimica e stabilità ossidativa

Parte II: Digestione in vitro e

isolamento dei peptidi bioattivi della carne

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5

Proteine Lipidi Minerali

Ferro Zinco Fosforo Magnesio Calcio Potassio

(g/100g) (mg/kg)

23,6±0,55 1,12±0,12 10,4±1,3 26,0±1,3 0,70±0,03 203 ± 3,4 138 ± 2,1 2611±52,8

Media±DS (n=6) del contenuto totale di proteine e lipidi misurati con metodo di Lowry e di Folch ed espressicome g su 100g di carne e del contenuto di ferro e zinco, magnesio, calcio, potassio e fosforo misuratimediante spettrometria d’assorbimento atomico ed espressi come mg/Kg di carne.

6

g/100g di acidi grassi totali

C14:0 1,93±0,17 C17:1 0,82±0,14

C14:1 0,48±0,06 C18:0 13,23±0,20

C15:0 0,26±0,03 C18:1n-9 37,28±1,65

C16:0 20,85±0,49 C18:1n-7 2,76±0,11

C16:1 3,09±0,23 C18:2n-6 9,71±1,13

C16:2 0,56±0,04 C18:3n-3 0,61±0,06

C17:0 1,10±0,18 CLA 0,42±0,05

C16:3 0,67±0,08 C20:4n-6 2,50±0,55

Media±DS (n=6) degli acidi grassi nel muscolo semimembranoso della fesa mediante gas cromatografia.

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Glutatione Perossidazione

lipidica

Carbonilazione

proteica

Catalasi Glutatione

perossidasi

Superossido

dismutasi

(μg GSH/g) (nmol MDA

eq/g)

(nmol NPH/g) (μmol/g x

min)

(μmol/g x min) (U/g)

109,2±18,1 1,97±0,06 166,13±13,24 153,5±9,1 0,93±0,08 156,9±8,4

Media±DS (n=6) del contenuto di glutatione (saggio di Ellman), la perossidazione lipidica (TBARS) , la carbonilazioneproteica (DNPH) e l’ attività degli enzimi: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi misurati con saggispettrofotometrici.

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➢ Misura la capacità di un campione di inibire l’ossidazione delle LDL.

➢ Questo processo determina la formazione di dieni coniugati che assorbono a 240 nm.

➢ I risultati vengono confrontati con un controllo negativo, le LDL, e uno positivo, la Vitamina C.

Risultati riportati come profilo cinetico dei dieniconiugati (A) e come lag time ossia il temponecessario all’ossidazione delle LDL (B). **=p<0,01vs LDL; ***=p<0,001 vs LDL.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5000 10000 15000 20000

Con

jugate

Die

nes

Time (Sec)

LDL

Vit C (0,5) µg/ml

La granda

A

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

LDL ECO Vit C 0,5 μg/ml

Lag

Tim

e (s

ec)

**

***

La granda

B

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ZEA α-ZOL β-ZOL

(ng/g) (ng/g) (ng/g)

ND 4,6±0,79 ND

Risultati della HPLC-UV detector espressi come media± DS (n=3) di ng/g di carne.

Lo Zearalenone (ZEA) è unamicotossina prodotta principalmentedai funghi delle specie Fusarium che sisviluppano soprattutto nelle colturecerealicole. Lo ZEA e i suoi metabolitiα-Zol, β-Zol, α-Zal e β-Zal, si leganoai recettori per gli estrogeni favorendola sintesi dell’RNA, di proteine e laproliferazione cellulare.

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Glutatione Perossidazione lipidica

Carbonilazione proteica

Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelatasottovuoto e non sottovuoto.***=p<0,001;**=p<0,01; *=p<0,05 vs carne fresca.

0

20

40

60

80

100

120

140

fresca congelata sv congelata non sv

μg

GS

H/g

***

11

Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelatasottovuoto e non sottovuoto. ***=p<0,001;**=p<0,01; *=p<0,05 vs fresca.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

fresca congelata sv congelata non sv

μm

ol/

g x

min *

*

Catalasi

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La carne bovina proveniente dagli allevamenti che utilizzanol’agricoltura eco-simbiotica presenta:

➢buon contenuto di minerali e acidi grassi mono e polinsaturi;

➢azione inibitoria sul processo di ossidazione delle LDL;

➢livelli minimi di contaminazione da α-ZOL e nessuno di ZEA e β-ZOL;

➢elevata stabilità ossidativa sia nel prodotto fresco che congelatosottovuoto in quanto non si osservano variazioni nel contenuto diglutatione, nella carbonilazione proteica e nella attività di due enzimiantiossidanti, la superossido dismutasi e la glutatione perossidasi.

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14

Sequenze di 2-40 amminoacidi, inattivi nelle proteine native, funzionali in seguito a digestione in vivo, idrolisi enzimatica in vitro o fermentazione.

Studi recenti ne hanno dimostrato l’attività antiossidante (Rajapakse et al., 2005), anti-infiammatoria, anti-ipertensiva, anti-diabetica, anti-batterica etc..(Lafarga et al., 2014).

Tali attività dipendono soprattutto dalla sequenza amminoacidica.

Principali fonti: latte, legumi ed estratti proteici muscolari di carne e pesce.

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➢ Omogenizzazione della fesa cruda;

➢ Estrazione delle proteine sarcoplasmatiche e miofibrillari;

➢ Dosaggio delle proteine con metodo di Lowry;

➢ Digestione:

Step orale (α-amilasi,10’, 37°C)

Step gastrico (Pepsina in ambiente acido, 2h, 37°C)

Step duodenale (Pancreatina+ Bile in ambiente basico, 2h, 37°C)

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Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

0,06±0,01 0,23±0,01** 0,36±0,04** 0,11±0,03* 0,29±0,03**

Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

μmoli TE

/mg proteine

μmoli TE/

mg proteine

0,07±0,01 0,22±0,04** 0,40±0,09*** 0,14±0,01** 1,38±0,05***###

Risultati del test ABTS come media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM)espressi come μmoli Trolox Equivalenti/mg di proteine. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001 vs Pre-Dig.#=p<0,005 vs Idrolisato.

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0,00E+00

5,00E+02

1,00E+03

1,50E+03

2,00E+03

2,50E+03

3,00E+03

3,50E+03

4,00E+03

Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30 3 > PS < 30 PS< 3

μm

oli

TE

/mg p

rote

ine

***##

***

0,00E+00

5,00E+02

1,00E+03

1,50E+03

2,00E+03

2,50E+03

3,00E+03

Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30 3 > PM< 30 PM< 3

μm

oli

TE

/mg p

rote

ine

***##***

Risultati del test ORAC. Media±DS (n=6) nelleproteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari(PM) espressi come μmoli TE/mg di proteine.***=p<0,005; ***=p<0,001 vs Pre-Dig PM.##=p<0,01 vs Idrolisato.

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0

20

40

60

80

100

120

% A

CE

-in

ibiz

ion

e

***

0

20

40

60

80

100

120

% A

CE

-in

ibiz

ion

e

#

***

Media±DS della % di inibizione dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM). ***=p<0,001 vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.

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IC50 Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg proteine/ml

ND 0,19±0,02*** 0,19±0,01*** 0,38±0,02*** 0,15±0,01***

IC50 Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg

proteine/ml

mg proteine/ml

ND 0,20±0,01*** 0,14±0,02*** 0,35±0,06*** 0,11±0,01*** #

Media±DS dell’IC50 dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM). ***=p<0,001vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.

20

0

20

40

60

80

100

120

E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus

Cre

scit

a b

att

eric

a (

%)

CNT

Pre-Dig PS

Idrolisato PS

3<PS<30

PS<30

Ps< 3

****

**** **

***###

***###

***###

***###

***###

Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle proteine sarcoplasmatiche. **=p<0,01;***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. ###=p<0,005 vs Idrolisato PS.

21

0

20

40

60

80

100

120

E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus

Cre

scit

a b

att

eric

a (

%)

CNT

Pre-Dig PM

Idrolisato PM

3<PM<30

PM<30

Pm< 3

***###

***###

***###

****

******

**

**

**

Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle miofibrillari. **=p<0,01;***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ###=p<0,005 vs Idrolisato PM.

***###

***###

22

0

20

40

60

80

100

120

EDTA

0,1mg/ml

EDTA

0,2mg/ml

EDTA

0,5mg/lm

EDTA

1mg/ml

Pre-Dig

PS

Idrolisato

PS

PS<30 3 > PS <

30

PS< 3

Att

ivit

à F

e2

+ c

hel

an

te (

%)

***

#*

Media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche. #=p<0,05;

***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. #=p<0,05 vs Idrolisato PS.23

Media±DS (n=6) nelle proteine miofibrillari. #=p<0,05;***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ##=p<0,01 vs Idrolisato PM.

0

20

40

60

80

100

120

EDTA

0,1mg/ml

EDTA

0,2mg/ml

EDTA

0,5mg/lm

EDTA

1mg/ml

Pre-Dig

PM

Idrolisato

PM

PM<30 3 > PM <

30

PM< 3

Att

ivit

à F

e2

+ c

hel

an

te (

%)

***##

*

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Nell’ambito delle ricerche sui peptidi della carne, questo lavororappresenta una novità per la fonte primaria, rappresentata dalleproteine miofibrillari e sarcoplasmatiche della fesa di bovinopiemontese. Inoltre, è stato messo a punto il processo di digestione invitro ed è stato selezionato il grado d’idrolisi ottimale per le attività.

I risultati hanno messo in luce un aumento del potenzialeantiossidante delle frazioni proteiche dopo la digestione rispetto aicampioni non digeriti.

Dopo la digestione in vitro, i campioni proteici hanno mostrato potereanti-ipertensivo, antibatterico e Fe2+-chelante.

I migliori risultati sono stati riscontrati nei peptidi delle proteinemiofibrillari con peso molecolare minore di 3KDa, in accordo con datipresenti in letteratura che mostrano un maggior potenziale biologicodi peptidi con peso molecolare compreso tra 500 e 1000 Da.

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I peptidi bioattivi, composti che stanno acquisendo sempre più consensi e approvazione in ambito sperimentale e terapeutico.

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Siamo all’inizio… necessitano ulteriori studi

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Ringraziamenti

Dr.ssa Della CroceDr.ssa RussoDr.ssa PucciDr.ssa FrassinettiDr. CiardiSig. Caltavuturo

Dr. Valter Lubrano (Fondazione Monasterio)

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