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Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Terapia Genica
Trattamento di patologie umane in cui il farmaco è materiale genetico
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Storia clinica della terapia genica
• E’ cominciata nel 1990 con trattamento ex vivo di pazientiaffetti da immunodeficienza combinata (SCID-ADA).
• Ad oggi, più di 300 protocolli clinici sono stati approvati, tutti su cellule somatiche.
• Più di 3000 pazienti sono stati trattati.• Ad oggi manca una chiara evidenza di efficacia terapeutica• Pochi studi sono in fase clinica II o III.
I vettori attuali non sono ancora adatti allo scopo
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Caratteristiche del vettore ideale• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina
terapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o
post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno.• Amministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.
Sebbene il vettore ideale non esista, tutte queste caratteristiche sono presenti, individualmente, nei vari vettori oggi disponibili
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Strategia generale perla costruzione di un vettore virale
• I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis
– sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione
• La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali
– si sfrutta questa segragazione per progettare vettori virali ricombinanti.
• I geni virali e le sequenze che agiscono in cissono separate su diverse molecole
– i prodotti dei geni virali agiscono in trans• i geni virali possono essere forniti in un virus
helper, in un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula “packaging”
– le sequenze “cis “ sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula
• produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione
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Ciclo vitale di un retrovirus• RNA genomico, 2 copie.• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in
DNA a doppio filamento nel citoplasma dellacellula infetta.
• (Il DNA è anche convertito in forma circolare, che però non sembra essere un intermedio della replicazione).
• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato èchiamato provirus.
• L’apparato della cellula ospite trascive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.
• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione
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Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus
• Il genoma tipico contiene 3 “geni”– gene ⇒ regione codificante che dà origine
a più di una proteina• I tre geni sono
– gag (componenti del core nucleoproteico)– pol (replicazione e ricombinazione)– env (componente della membrana esterna)
• Per l’espressione di pol deve essere ignorato un codone di stop
– soppressione da parte di un glutamil-tRNA se la fase di lettura è la stessa di gag
– slittamento del ribosoma se la fase di lettura è diversa da gag
• ��L’efficienza del processo è del 5%– la quantità di gag prodotta è 20 volte
superiore a quella di pol
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Vettori retrovirali
3 Componentiseparate
1U3 R U5 U3 R U5Gene terapeutico
U3 R U5 U3 R U5
Env
1
2 3Gag-Pol
Gag-Pol2
p
p Env3 Titoli di 107 unità
trasducenti (t.u.)/ml
p VSV-G3
oppure
Titoli di 1010 unitàtrasducenti (t.u.)/ml
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Vettori Retrovirali: situazione attuale e prospettive future• Pro
– efficiente trasduzione ex vivo di cellule in attiva replicazione• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche
– notevole esperienza clinica ex vivo• efficace terapia genica di due bambini affetti da imunodeficienza
– integra garantendo espressione prolungata, ma a basso livello
• Contro– integrazione random
• attivazione di oncogeni• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione
– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)
• Sviluppi futuri: vettori lentivirali
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Vettori lentivirali• I lentivirus hanno un genoma più complesso
– oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori.
• Originariamente derivati da HIV-1 per trasdurre linfociti– “pseudotipizzazione” con VSV-G espande il trofismo– vettori “pseudotipizzati” con VSV-G possono essere
somministrati direttamente in vivo• efficiente trasduzione di neuroni e cellule della glia del sistema nervoso
centrale di roditori e primati
• Vettori ibridi derivati da lentivirus non umani (SIV, FIV)– virus originale non infettivo per gli esseri umani
• la reale efficacia in vivo deve essere ancora dimostrata
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Vettori lentivirali• Trasporto attivo del complesso di pre-integrazione
attraverso i pori nucleari– possibilità di trasdurre anche cellule quiescenti
• efficaci nel trasdurre cellule quiescenti ex vivo• trasduzione diretta in vivo potrebbe soffrire di alcune limitazioni
– barriere tissutali nel caso della mucosa resporatoria– condizione intracellulare (necessità di replicazione) nel caso degli epatociti
– devono ancora essere definiti il potenziale reale ed i limiti della trasduzione diretta in vivo mediata da vettori lentivirali
• Limite comune a vettori retro- e lentivirali– la fase a RNA obbligatoria nel ciclo vitale impone determinati
limiti nella cassetta di espressione, tra cui la mancanza di introni e di segnali di poliadenilazione.
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Adenovirus• Capside icosaedrico
– formato da 3 proteine• esone, pentone e fibra
• Sono stati caratterizzati più di50 diversi sierotipi diadenovirus umani.
• Meccanismo di infezione:
– 1) legame del virus alla sua cellula bersaglio• interazione ad alta affinità tra il dominio “knob” della fibra ed il
recettore sulla superficie della cellula
– 2) internalizzazione• interazione tra il pentone di Adeno e le integrine αvβ3 e αvβ5 (per il
sierotipo 5) sulla superficie della cellula.
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10
Struttura genomica edespressione genica degli Adenovirus
20 30 40 50 60 70 80 90 100ITR-ΨΨΨΨ
E1 MLP Geni “Late” (L1-L5)
E4
VA
E210 map units = 3.6 kb
ITR
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E1
10
Struttura genomica dei vettori Adenovirali di prima generazione
20 30 40 50 60 70 80 90 100ITR-ΨΨΨΨ
TransgeneMLP Geni “late” (L1-L5)
E4
VA
E210 map units = 3.6 kb
ITR
E1
Cellule 293
ITR-ΨΨΨΨ
E3
Principalmentesierotipi 2 e 5
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Vettori Adenovirali: vantaggi
• Sono ben conosciuti perchè studiati da molto tempo.• Non ci sono evidenze significative di integrazione. • Sono i vettori più efficienti, specialmente per cellule
quiescenti e per somministrazione diretta in vivo.• I vettori di prima generazione possono essere cresciuti
a titolo elevato in maniera relativamente semplice e riproducibile.
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Caratteristiche negative dei vettori Adenovirali di prima generazione
I gene a valle di E1 vengono espressi a basso livello, causando:• lisi immuno-mediate delle cellule trasdotte
– espressione del transgene terapeutico di breve durata
• tossicità dopo somministrazione sistemica:– imfiammazione e necrosi epatica– danno endoteliale
ITR-ΨΨΨΨ
TransgeneE1 MLP Geni “Late” (L1-L5)
E4
VA
E2
ITRE3
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Caratteristiche negative dei vettori Adenovirali di seconda generazione
ITR-ΨΨΨΨ
TransgeneE1 MLP Late genes (L1-L5)
E4
VA
E2
ITRE3
I gene a valle di E1 vengono espressi a basso livello, causando:• lisi immuno-mediate delle cellule trasdotte
– espressione del transgene terapeutico di breve durata
• tossicità dopo somministrazione sistemica:– imfiammazione e necrosi epatica;– danno endoteliale;– tossicità acuta dose-dipendente (letale per un paziente mancante di OTC)
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293
Helper
ΨΨΨΨ Vettori Adenovirali dipendentida helper (Helper-Dependent: HD)
ITR ITRtransgeneΨΨΨΨ
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loxP
Helper
293 Cre
ΨΨΨΨ Vettori Adenovirali dipendentida helper (Helper-Dependent: HD)
ITR ITRtransgeneΨΨΨΨ
loxP
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Espressione prolungata del transgene dopo somministrazione con vettore dipendente da helper
4045
50
5560
65
7075
8085
Hem
atoc
rit
0 14 28 42 56 70
Days after virus injection
40
4550
5560
6570
75
8085
0 14 28 42 56 70Days after virus injection
3x105
1x106
3x107
1x107
3x106
PBS
1st generation Helper-dependentVettore di
prima generazioneVettore dipendente da
virs helper (HD)
Em
atoc
rito
Giorni dopo l’iniezione Giorni dopo l’iniezione
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Espressione prolungata del transgene dopo somministrazione con vettore dipendente da helper
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
Hem
atoc
rit
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Days after virus injection
3 x 1051 x 106
7 x 107
3 x 107
1 x 107
3 x 106
PBS
225 365 575
Em
atoc
rito
Giorni dopo l’iniezione del vettore
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Vettori Adenoviraliproblemi e prospettive future
• Immunogenicità del vettore– vettori di prima generazione: alta
• facilità di produzione
– vettori HD: bassa (dovuta alle proteine del capside)• produzione tecnicamente complessa e poco riproducibile
• Immunità preesistente– prospettive: sierotipi alternativi
• Trofismo promiscuo– prospettive: modificazione del trofismo naturale
• re-direzionamento verso le cellule desiderate (“targeting”)
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Immunità pre-esistente
Anticorpi neutralizzanti presenti nella popolazione possono diminuire l’efficacia della somministrazione del vettore
L’uso di sierotipi alternativi hapermesso la risomministrazionein modeli animali.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
25136
311847
211223142230
15, 171016291311
23, 27198
24, 25, 289, 20, 26, 32, 35
negative
Sier
otip
o
Percentuale di bambini tra 3 e 6 annicon anticorpi neutralizzanti controi vari sierotipi di Adenovirus
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Virus Adeno Associati (AAV)
• Parvovirus, inizialmente scoperti come contaminanti di preparazioni di Adeno, richiedono la presenza di un virus helper (per esempio, Adenovirus) per l’infezione produttiva– ad oggi sono stati caratterizzati 6 sierotipi
• la maggior parte deli studi si è concentrata su AAV-2
• Ad oggi non sono stati associati a nessuna patologia– caratteristica ideale per derivare un vettore di terapia genica
• Il genoma del virus naturale integra preferenzialmente in un sito specifico del genoma umano (AAVS1 nel cromosoma 19 q13.3-qter)
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Struttura genomica deiVirus Adeno Associati
Cap
ITRITR (145 nt)
Rep
Replicazione del DNAIntegrazione
Rescue
Proteine del capside:VP1, VP2, VP3
IntegrazioneIncapsidazioneRescue
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Ciclo vitale dei Virus Adeno Associati
Integrazionesito-specifica
Fase di latenza
Ad
Rescue
Fase litica
Replicazione
Ad
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Vettori AAV: struttura e produzione
• 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap• 2) Adenovirus helperoppure• 2bis) Plasmide esprimente i geni di Adenovirus
con funzione helper
ITRITR (145 nt)
Promotore-Transgene (max 4.5 kb)
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Vettori AAV:situazione attuale e prospettive future
• Pro– efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva
replicazione– espressione prolungata del transgene
• descritte sia forme episomali che integrate– bassa immunogenicità
• Contro– la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb– con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo
relativamente basso e contaminate da virus
• Sviluppi futuri:– miglioramento dei sistemi di produzione– aumento dell’efficienza di integrazione sito-specifica
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Vettori non virali
• Il vettore è molto semplice: DNA– puro (“naked DNA”) – complessato con molecole che ne aumentano la penetrazione nelle cellule
• tipicamente lipidi cationici
• L’iniezione diretta di DNA nel muscolo induce espressione genica– prima evidenza ottenuta nel 1990
• Sviluppo di risposta immune dopo iniezione di DNA codificante antigeni eterologhi– prima evidenza ottenuta nel 1993
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Vettori non-viralisituazione attuale e prospettive future• Pro
– teoricamente, non ci sono limiti alla taglia del trasgene– facili da produrre– buona efficienza di trasduzione ex vivo– non ci sono evidenze significative di integrazione
• Contro– bassa efficienza di trasduzione in vivo– espressione del trasgene transiente
• Sviluppi futuri– miglioramento dell’efficienza di trasduzione– aumento della durata dell’espressione
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Terapia Genicasituazione attuale e prospettive future
• Sperimentazione clinica iniziata nel 1990– eccessivo ottimismo
• Valutazione generale da parte del NIH nel 1995– LA TERAPIA GENICA NON FUNZIONA
• il potenziale terapeutico con i mezzi allora a disposizione era stato sovrastimato;
• le basi scientifiche nel settore non erano sufficientemente solide;• occorreva lavorare molto sulla costruzione di nuovi vettori, sulla efficienza
della loro somministrazione e sulla regolazione dell’espressione del transgene
• 1995-2002: generazione e ottimizzazione di vettori di TG– prime evidenze (anche se preliminari) di efficacia terapeutica per la
emofilia B (vettori AAV) e per la X-SCID (vettori retrovirali)
• Prospettive future– il continuo miglioramento dei vettori disponibili si tradurrà in un aumento
dei successi in campo clinico