Post on 15-Oct-2021
Funzionamento
processi di “bio-reconoscimento” che produce risultati trasferiti ad
un trasduttore
Proprietà
I biosensori sono caratterizzati da:
•alta selettività, basata sul riconoscimento bio-specifico;
•alta sensibilità, fino alle parti per miliardo (ppb);
•ridotte dimensioni: possibilità di analisi in situ.
La componente biologicaPuò essere costituita da:
Enzima
• Anticorpo
• DNA
• Recettore
• Cellule intatte
• Tessuti
E’ importante l’intimo contatto tra il bioelemento ed il trasduttore per:
•Diminuire il tempo di risposta
•Ridurre l’effetto degli interferenti
•Minimizzare la quantità del biocomponente
Chimici:
• Trasformazione chimica
• Trasformazione fisica
• Processo elettrochimico
• Spettroscopia
• Altro
Biologici:
• Trasformazione biochimica
• Trasformazione fisica
• Effetto su organismo di test
• Spettroscopia
• Altro
Fisici:
• Termoelettrico
• Fotoelettrico
• Fotomagnetico
• Elettromagnetico
• Termoelastico
• Elettroelastico
• Termomagnetico
• Termoottico
• Fotoelastico
• Altro
Principio di trasduzione/effetto fisico-chimico
Variabile misurata
Acustici
• Ampiezza e fase di un’onda
• Spettro
• Velocità dell’onda
Biologici
• Biomassa (tipo, concentrazione)
Chimici
• Componenti, concentrazione
Magnetici
• Ampiezza e fase campo magn.
• Conducibilità
• Permittività
Ottici
• Ampiezza e fase di un’onda
• Velocità dell’onda
• Indice di rifrazione
• Emissività, riflettività
Meccanici
• Posizione (lineare, angolare)
• Accelerazione
• Forza
• Sforzo/tensione (Stress), pressione
• Deformazione (Strain)
• Massa, densità
• Momento, torsione
• Velocità di flusso, rate di massa
• Forma, ruvidezza
• Rigidità, cedevolezza
• Viscosità
• Cristallinità, struttura
Radiazione
• Tipo
• Energia
• Intensità
Termici
• Temperatura
• Flusso
• Calore specifico
• Conducibilità termica
Segnale
secondario
Segnale
Primario
Meccanico Termico Elettrico Magnetico Radiazione Chimico
Meccanico(Fluidi) Effetti
meccanici e acustici:
Diaframma, sonde
eco
Attrito (Calorimetro
da attrito)
Raffreddamento
(thermal mass flow
meter)
Piezoelettricità
Piezoresistività
Resistenza, capacità ed
effetti induttivi
Effetti
magnetomeccanici:
Es.
piezomagnetismo
Sistemi fotoelastici
(Stress-induced
birefringence)
Interferometri, effetti
Segnac e Doppler
TermicoEspansione termica
(strisce bimetalliche,
termometri con liquidi
e gas)
Effetto radiometrico
Effetto Seebeck
Termoresistenze
Piroelettricità
Rumore termico
Effetti termoottici
(Es. in cristalli
liquidi), emissione di
radiazione
Attivazione di
reazioni: Es.
Dissociazione
termica
ElettricoEffetti elettrocinetici
ed elettromeccanici:
Piezoelettricità,
elettrometri, legge di
Ampere
Effetto Joule
Effetto Peltier
Collettori di cariche,
Langmuir Probe
Legge di Biot-Savart Effetti elettroottici:
Effetto Kerr
Effetto Pockels
Elettroluminescenza
Elettrolisi
Elettromigrazione
MagneticoEffetti
magnetomeccanici:
Magnetocontrazione
magnetometria
Effetti termomagnetici
effetto Righi-Leduc
Effetti termomagnetici
Effetto Ettinghausen
Effetto Ettinghausen-
Nerst
Eff.Galvanomagnetici
Effetto Hall,
magnetoresistenze
Effetti magnetoottici:
Effetto Faraday
Effetto Cotton-
Mouton
Radiazione Pressione da
radiazione
Bolometri, termopile Effetti fotoelettrici:
Effetti fotovoltaici e
fotoconducibilità
Effetti di
fotorifrangenza:
bistabilità ottica
Fotosintesi,
dissociazione
ChimicoIgrometri, cella di
elettrodeposizione,
effetto fotoacustico
Calorimetro,
conducibilità termica,
Celle
Potenziometria,
conduttimetria,
amperometria, ionizzazione
a fiammma, effetto Volta,
Effetto di campo (rivelazione
di gas)
Risonanza
magnetica nucleare
(Emisssione ed
assorbimento)
Spettroscopia
Chemiluminescenza
Principi fisici e chimici di trasduzione
Altre classificazioni
Materiale
• Inorganico / organico
• Conduttore / isolante
• Semiconduttore
• Liquido, gas o plasma
• Sostanze biologiche
Dimensioni
• Microsensori
• Nanosensori
Campo di applicazione
• Agricoltura
• Ingegneria civile
• Distribuzione, commercio
• Energia
• Medicina, salute
• Settore manifatturiero
• Militare
• Ricerca
• Trasporti
• Automotive
• Applicazioni domestiche
• Ambiente, meteorologia
• Informatica, telecomunicazioni
• Marina
• Tempo libero
• Spazio
Alcuni dati di mercato
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Mil
iard
i d
i d
oll
ari
Senso
ri di fl
usso
Senso
ri di p
ress
ione
Senso
ri di v
eloc
ità
Senso
ri chim
ici
Senso
ri binar
i
Senso
ri di li
vello
Senso
ri di te
mpe
ratura
Senso
ri di p
osizi
one
Senso
ri gas
di s
caric
o
Senso
ri ottic
i
Mercato mondiale per i sensori più diffusi
1988
1995
Oggi si stima un mercato complessivo dell’ordine dei 20 miliardi di dollari
2005
Problemi
•Perdita delle funzionalità nel tempo;
•Il tessuto biologico è fortemente influenzato dalla temperatura e dal pH (forza
ionica, parti acide/basiche);
•La forza ionica modifica il sito recettore;
•Il tempo di vita del sensore è breve
•Il tempo di risposta è determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione
(lento).
Due classi di processi bio-ricognitivi:
•Riconoscimento bioaffine:
il trasduttore percepisce il legame fra recettore e ligando come variazione
di dimensione / forma: es.: reazioni anticorpo-antigene;
•Riconoscimento biometabolico:
il trasduttore percepisce le alterazioni chimiche dovute alla reazione,
come cambi della concentrazione dei prodotti e dei reagenti, o come
calore specifico di reazione: es.: reazioni enzima-substrato.
Esempio: reazione antigene-anticorpo
Cinetica delle reazioni di bioaffinità:
La reazione che regola il legame anticorpo, Ab, (specie reagente) al suo antigene,
Ag, (specie attiva) è descritta dalla seguente reazione:
RICONOSCIMENTO BIO-AFFINE
Esempio: reazione enzima-ricettore
Cinetica delle reazioni di riconoscimento bio-metabolico:
Il substrato, S, presente in soluzione, entra in contatto con l’enzima, E, sulla
membrana per creare un complesso intermedio S·E che darà origine al prodotto
della reazione, P.
RICONOSCIMETO BIO-METABOLICO
Cinetica non lineare: non usata direttamente per rilevare la concentrazione del
prodotto di reazione
Cinetica descritta da eq. Michaelis-Menten:
La componente elettronica
È costituita da:
•Sistema di condizionamento del segnale
•Display
•Data processor
•Sistema di memorizzazione
Biosensori basati su enzimi
• Buona sensibilità
• Buona stabilità
• Elevata attività e selettività
• Risposta lineare
• E’ necessario purificare l’enzima
Metodi amperometrici
I metodi amperometrici consistono nella misura, attraverso una cella elettrochimica,
della corrente, che è proporzionale alla concentrazione della specie attiva.
3 generazioni di biosensori amperometrici:
1.Elettrodo in Pt, adatto solo per 02, H2, H2O2;
2. Mediatori, ovvero altre sostanze (enzimatiche) che vengono ossidate o
ridotte e reagendo con la specie chimica attiva danno un segnale (es:
ferrocene, quinones, etc..);
3. Elettrodi modificati, dotati di sostanze organiche, o sali, che interagiscono
direttamente con la specie attiva.
1.Trasduttori amperometrici
➢Risposta lineare
➢Facilità di costruzione
➢Strumentazione a basso
costo
➢Sensibilità ridotta
➢Soggetti ad interferenze
➢Consumo di reagenti
La concentrazione di glucosio può essere stimata attraversouna misura
➢dell’ossigeno consumato (inversamente prop.)
➢l’acqua ossigenata prodotta (direttamente prop.)
Clark Oxygen Electrode
-+
Platinum cathode
Polyethylene membrane
Silver anode
Electrode body
KCl soln.
a +650mV vs riferimento Ag/AgCl
in corrispondenza della superfice
metallica H2O2, è ossidata:
H2O2 →2H + +O2 +2e−
Sensore ad ossigeno
Accoppiamento con un gran numero di enzimi ossidasi.
La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi:
Glucosio + H2O ----GOD----> Acido gluconico + H2O2
La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore:
Si misura la corrente dovuta alla riduzione di O2 o ossidazione H2O2 varia linearmente
con concentrazione del glucosio in soluzione.
Biosensore commerciale per misurare glucosio nel sangue
➢Strips usa e getta
➢Costo limitato
➢Numero molto elevato di determinazioni
➢Risposta del biosensore in presenza di glucosio
Elettrodi a NADH
Il NADH è una molecola coinvolta in circa 250 reazioni che utilizzano enzimi
deidrogenasi.
Questo cofattore enzimatico in presenza dell'enzima e del substrato passa
dalla forma ossidata NAD+ alla forma ridotta NADH.
Questa forma ridotta viene riossidata per via elettrochimica utilizzando un
sensore amperometrico a grafite.
2. Biosensori amperometrici di seconda
generazione
➢Prevedono la presenza di
un mediatore di trasferimento
elettronico che accetta gli
elettroni dall’enzima e li
trasferisce all’elettrodo ad un
potenziale vicino allo zero
➢Sono meno soggetti alle
interferenze
➢ Richiedono una minore
quantità di bioelemento
Reazioni nel sensore:
Fc Fc+ + e- (measurato)
GOR + 2 Fc + --> GOox + 2 Fc
ferrocene
3. Elettrodi modificati, dotati di sostanze organiche, o sali, che interagiscono
direttamente con la specie attiva non soltanto fornendo elettroni, ma anche liberando
ioni
Limite di rilevazione: da 10-9a 10-8 Molare
Limite di linearità: da 10-7a 10-3 Molare
E : enzima S : substrato da analizzare P: prodotto di reazione CR: co-reattante Med: mediatore
Sono utilizzati per seguire reazioni enzimatiche che producono:ioni idrogeno,
ammoniaca,
anidride carbonica,
cianuro,
Ioduro.
Proprietà➢Piccole dimensioni
➢Costo esiguo
➢Risposta non lineare
➢Selettività limitata
La relazione tra potenziale misurato e la concentrazione della specie in esame non
è di tipo logaritmico:
➢espande considerevolmente il "range" di misura (range ristretto a 1-2 decadi di
concentrazione nella misura amperometrica)
➢diminuisce la sensibilità della misura non consentendo un certo numero di
applicazioni
Biosensore per la determinazione della formaldeide
• La formaldeide in aria viene trasferita in fase acquosa
• La sua determinazione avviene in seguito alla produzione di acido formico da parte
della formaldeide deidrogenasi
Biosensore per la determinazione dell’urea
➢•L’ureasi catalizza la reazione di idrolisi dell’urea
➢La produzione di NH4+ e HCO3- è rilevata per via conduttimetrica
Esempi
Urea + H2O + H+ ureasi
2NH4+
+ HCO3-
Creatinina + H2O creatinasi
N-metildantoina + NH4+
Penicillinapenicillinasi
Acido Penicillonico
In contatto con electrodo pH.
Determinazione dell'urea
Come il glucosio, l'urea è un metabolita importante per il quale si utilizza un
biosensore.
L'enzima usato per la determinazione dell'urea è l'ureasi :
Urea + H2O -------> 2 NH3 + CO2
Poiché CO2 è endogeno nel sangue, si misura ammoniaca utilizzando o un
sensore ad ammonio o un sensore ad ammoniaca (gas).
Sensore ad NH3 accoppiato con l'enzima ureasi immobilizzato su di un
supporto poroso a base di allumina.
l'enzima immobilizzato catalizza la trasformazione di urea in ione ammonio
(optimo pH e temperatura) convertito poi in ammoniaca (sulla superficie del
sensore dà un segnale proporzionale alla concentrazione di urea).
La determinazione della azotemia e glicemia è una delle analisi più
frequenti nel laboratorio medico.
Sensori per misurare entrambi i metaboliti contemporaneamente:
cella per la misura dell'ossigeno e della CO2 nel sangue all'interno
della quale sono stati inseriti un sensore a glucosio ed uno ad urea
Sensore conduttometrico basato su tirosinasi
Il substrato è ridotto elettrochimicamente a catecolo e si misura la corrente prodotta
detection limits ≈1 ppb
dynamic range 2.3–2330 ppb
Tyr
Tyr
Biosensori elettrochimici per gli inibitori della acetilcolinesterasi ( AchE)
Tecniche di analisi per la determinazione dei pesticidi
Determinazione dell'attività dell'inibizione dell'acetilcolinesterasi da parte di
insetticidi carbammati organofosfati e tiofosfati:
•limiti di rilevabilità (DL) inferiori ai limiti imposti dalla comunità europea,
•minime procedure di estrazione del campione
•apparecchiature portatili accoppiate ad elettrodi miniaturizzati (screen printed
electrodes).
The first practical blood glucose meter was invented in 1968 by Tom Clemens and eventually produced by Bayer Corporation
[10]. Since then the glucose meter has been developing rapidly. Over the past 40 years, it has undergone five phases (Fig. 1).
The 1st generation meter was what we call the washed blood glucose meter. It was developed by Bayer in 1970. It was
used in the same way as pH test paper, relying on colorimetric cards for color contrast. As it required the operator to wipe
the blood off, it was not very user-friendly. Also, when the color fell in between colors on the cards, the reading was potentially
inaccurate and could easily result in errors.
To solve this problem, Bayer developed the 2nd generation meter in 1980, the so called wiped blood glucose meter, which
was small and easy to use, but still required the wiping process. To completely solve the problem, the Johnson & Johnson
Group introduced One Touch in 1987, a colorimetry glucose meter which did not need the wiping process [11]. The
aforementioned three generations of blood glucose meters were photoelectric-type meters in principle.
In contrast, electrode-type glucose meters were smaller in size, quicker in reaction, and easier to use.
Therefore, Abbott introduced the 4th generation meter, an electrochemical blood glucose meter, in 1986, which soon
became the mainstream blood glucose meter in the 1990s [12].
Then, in order to solve the problem of blood collection volume and realize micro and multiple site blood collection,th Sense
developed the 5th generation blood glucose meter which enabled micro and multiple site blood collection, and thus
advanced the technical quality of blood glucose meters to a new height [13].
Currently, the most common portable blood glucose meter is the electrode-type glucose meter, which is a current mode
enzyme sensor. Its working mechanism is described as follows.
First, with disposable enzyme-modified screen-printed electrodes as the sensor, glucose interacts with an enzyme.
The electrons produced are transferred by the conducting mediums to electrodes. The electrodes then produce a current
under constant voltage. There is generally a linear relationship between the magnitude of current and concentration of
glucose, so glucose concentration in the blood can be obtained indirectly [14–16].
The most common enzymes are GOx and glucose dehydrogenase (GDH). The two enzymes are different in reduction
potentials, stability, turnover rate, and affinity and selectivity for glucose [17]. Recently two enzymes in the GDH family, NAD-
GDH and flavin adenine (FAD)-GDH, which are not only highly specific to glucose but also insusceptible to oxygen, were
developed and are promising in terms of future potential applications [18, 19].
The current instruments have been able to meet the detection requirements of sugar content in diabetic patients.
ISO15197 also has strict standards for the accuracy of blood glucose meters. This can help patients master their own
conditions at any time, receive treatments immediately, and ultimately improve the living conditions of patients with diabetes,
nephropathy, and other diseases.
Evoluzione nel tempo dei misuratori del glucosio nel sangue
Possono essere utilizzati per un rapido
screening del rischio ecologico per
sostanze affini agli acidi nucleici (e
perciò potenzialmente pericolose)
sfruttando il riconoscimento molecolare
di filamenti di DNA immobilizzati su un
trasduttore elettrochimico)
Biosensori basati sul DNA
➢Sfruttano le proprietà di ibridazione specifica dei singoli filamenti di DNA
➢Sono stati messi a punto sensori per la rivelazione di DNA ed RNA di batteri e
virus
Analisi di addotti con DNA
Xenobiotici Metabolitaprimario
Fase I
OssidazioniRiduzioniIdrolisi
Fase II
ConiugazioniMetabolitasecondario
Bioattivazione:
formazione di addotti con DNA e proteine
Molte sostanze esogene (IPA) diventano dannose solo dopo il loro
metabolismo.
,
E’ dimostrato che il primo passaggio del processo che porta a mutagenesimutagenesi e
cancerogenesicancerogenesi di xenobioti è la formazione di addotti con DNA.
Studio degli addotti al DNA per individuare sostanze tossiche
Formazione di metaboliti elettrofili e nucleofili nell’ossidazione di idrocarburi saturi e insaturi.
Biosensore a DNA per applicazioni ambientali
elettrodo
e-
elettrodo
Analita
Sistema di riconoscimento
molecolare: DNA a doppia
elicaL’analita produce una modificazione
chimico fisica del DNA immobilizzato,
che causa una diversa ossidabilità
della base guanina.
0.8 1.0 1.2 1.4
0
2
4
6
8i / A
E / V
DNA alone Sb
DNA + analyte Ss
Convenzione:
S > 85% no tossico
50 % < S < 85 % moderatamente tossico
S < 50 % molto tossico
Indice Tossicità
Segnale % = (Ss/Sb) 100
Sb: picco guanina dopo
l’interazione con il bianco
Ss: picco guanina dopo
l’interazione con il campione
Biosensori basati su cellule e tessuti
➢ Basso costo
➢ Grande varietà di enzimi
➢ Possibilità di usare cellule modificate
➢ Lungo tempo di risposta
➢ Contaminazioni
➢ Bassa attività e selettività
•Le cellule presentano un
potenziale di membrana dato
dalla differenza di
concentrazione delle specie
ioniche attraverso la membrana
cellulare : ΔV di circa 40 mV.
•Questo potenziale, detto
potenziale di azione, cambia
in funzione della composizione
dell’ambiente circostante la
cellula
•Il potenziale di azione può
essere registrato attraverso
opportuni elettrodi.
Biosensori basati su cellule
Potenziale di azione di una cellula cardiaca
dove sono evidenziati i 4 canali ionici.
Potenziale di azione
Strutture biomimetiche
Le strutture biomimetiche sono strutture artificiali costruite per mimare i processi
che avvengono nelle membrane cellulari: uno dei più sofisticati sistemi
biosensore/attuatore.
Modello classico di membrana cellulare: soluzione all’esterno (mezzo
extra-cellulare) separata dalle diverse specie presenti all’interno (citoplasma)
grazie alla forte polarità delle molecole fosfolipidiche che compongono la
membrana cellulare.
La membrana deve essere resistente ma non rigida, e consentire la diffusione delle
specie interessate attraverso se stessa.
Le membrane artificiali (BLM, Bilayer Lipid Membrane), risultano essere sempre
molto fragili.
Vi sono 2 tecniche principali per realizzarle
•depositandole da soluzione;
•mediante la tecnica di Langmuir-Blodgett(LBM–Langmuir-Blodgett Membrane)
Biosensore per Triazina ed erbicidi Fenilurea
➢Cianobacterio termofilico isolato da Synechococcus elongatus immobilizzato su sensore
elettrodo di lavoro di graffite ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl depositati su supporto
polimerico.
➢Gli erbicidi inibiscono la fotosintesi bloccando l’attività del sistema proteico Fotosistema II
➢Una misura amperometrica registra la variazione dell’attività di trasporto di elettroni del
Fotosistema II che risulta dipendente dalla concentrazione di erbicida.
LOD≈10-9M
Misura dell’estensione del potenziale ad un elettrodo dopo l’aggiunta in soluzione di
tetrodotossina, tossina del pesce palla (100nM)
La tossina agisce sui canali ionici delle cellule nervose inibendone il funzionamento.
Misura dell’attività di un agente tossico
Biosensori basati su recettori
➢Elevata sensibilità e selettività
➢Tempo di risposta breve
➢Ampio intervallo dinamico
➢Piccole dimensioni
➢Fragilità
➢Breve tempo di vita
Recettori Biomimetici
Recettori sintetici selettivi basati sul mimicking dei siti di legame dei
recettori biologici.
• oligopeptidi sintetici mimando i siti attivi dei recettori biologici per analiti di
evidente tossicità come insetticidi, tossine o diossine e diossine-simili.
•trappole biomimetiche inserite in sensori di affinità per xenobiotici
Interazione tra il peptide Asn-Phe-Gln-Gly-Ile (peptide selezionato con approccio computazionale) e la diossina 2,3,7,8-TCDD attraverso due legami idrogeno.
Sensori a fibre ottiche
Questi sensori sfruttano le fibre ottiche per portare il segnale di eccitazione anche
in zone limitate. Le sorgenti ottiche utilizzate sono: LED, diodi laser (Ga-Al-As).
I sistemi di rilevazione si basano su fotodiodi, fototransistor, photo multiple tubes.
I fenomeni grazie ai quali si ha il segnale sono fenomeni di chemiluminescenza o di
bioluminescenza.
I limiti di rilevazione sono di ordine picomolecolare
Applicazioni di Biosensori
Per verificare la presenza di tossine o agenti patogeni su alimenti.
Dispositivi costituiti da anticorpi specifici fissati al trasduttore in grado di
generare onde elettromagnetiche.
Quando avviene la reazione tra anticorpo e antigene bersaglio (virus,
batteri, molecole), si verifica una modificazione dell’onda che si trasforma
in un segnale elettrico facilmente rilevabile.
In campo medico nel dosaggio di molecole usate nella diagnostica.
Si possono realizzare diagnosi e misurazioni in tempo reale, con ingombri
minimi e facilmente interpretabili.
Sono quasi sempre monouso, in alcuni casi riutilizzabili per un certo
periodo di tempo e assicurano la riproducibilità delle misurazioni.
Alcuni sono già in uso e commercializzati (kit di diagnosi immunologica,
biosensori per monitorare la qualità delle acque) altri ancora in fase di
sviluppo.
Applicazioni in campo medico
Pressione sanguigna, temperatura, potenziali
elettrici, respirazione, movimento
Variabili chimiche: glucosio, elettroliti, PO2, PCO2
Variabili emodinamiche (pressione, flusso)
Radiazioni, ultrasuoni
Determinazione da effettuare in vivo:
➢Acido glutammico
➢Glucosio
➢Acido lattico
➢Acido ascorbico
➢Acetilcolina
➢D-Lactic Acid
➢L-Lactic Acid
➢L-Malic Acid
➢Glucose
➢Ethanol
➢Glucose +Fructose