Software usati in proteomica

Biotecnologie 2011-2012

Pier Luigi Orvietani

Università degli Studi di PerugiaCorso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie

Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei SistemiProteomica e Metabolomica

Strumentazione per la cattura delle immagini

VERSADOC

Tools del Versadoc tramite software

Identificazione Comparazione

Il confronto e l’analisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante l’uso di opportuni Hardware e Software

Bioinformatica

PDQuest Workflow

Spot cutting and mass spectrometry analysis

Publish results

Acquire the image

Size and orient the image

Spot identification

Spot comparison and matching

Data analysis

Digital Data and Signal Intensity

PDQuest converte i segnali dal campone biologico in dati digitali

Ogni oggetto visualizzato dal monitor è composto da tanti piccoli pixel.Ogni pixel ha una coordinata X eY a cui corrisponde una posizione orizzontale e verticale

Vi è anche un valore Z che corrisponde all’intensità del segnale del pixel

L’oggetto per essere visibile e quantificabile deve avere l’intensità del suo cluster di pixel maggiore di quella del background

L’intensità totale di un oggetto è la somma dell’intensità di tutti i pixel che formano lo stesso oggetto

L'intensità media di un oggetto è l'intensità totale diviso per il numero di pixel dell'oggetto.

L‘unità dell’intensità del segnale è espressa in Densità Ottica D.O.

Caratterizzazione dell’intensità del segnale

IMMAGINI CREATE DURANTE LO SPOT DETECTION

2-D Scan Filtered Image Gaussian Image

PDQuest usa modelli Gaussiani per creare spot che possano essere precisamente identificati e quantizzati

PDQuest crea spot Gaussiani rapportati tridimensionalmente per meglio evidenziare le differenze fra di loro

SPOT QUANTITYSpot Quantity è la totale intensità di un spot ben definito in un immagine del gel

Spot Quantity viene calcolato mediante l’immagine Gaussiana con la seguente formula

Altezza dello spot * π *σx * σy

Altezza dello Spot è il picco dello spot ed è misurato in OD/ unità di immagine (IU) 1 IU: 0,1 mm

σx σy è la deviazione standard della distribuzione Gaussiana dello spot secondo gli assi X e Y . Anche queste sono misurate in IU

Spot Quantity viene espresso in OD*IU2

L’IMMAGINE VIENE IMPORTATA E VISUALIZZATA

L’Immagine viene regolata nelle sue caratteristiche di luminosità, contrasto, gamma etc.

Una volta elaborata viene tagliata e dimensionata

via software vengono individuati gli spots, dai più deboli ai più intensi

Il software confronta i vari gels, evidenziando gli spots (proteine)

presenti o assenti nell’uno o nell’altro.

Normalizzazione dei dati

Formula di Normalizzazione

Raw spot quantity * Scaling factor * pipette error compensation factor __________________________________________________ Normalization factor

Raw spot quantity è l’intensità dello spot

Scaling factor è il valore con cui noi vogliamo esprimere l’intensità normalizzata (PPM ;%)

Normalizzazione dei dati

Vari tipi di analisi possono essere effettuate

Vari tipi di analisi possono essere effettuate

Gli spot possono essere elaborati anche con analisi statistica

… mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi per es. l’analisi quantitativa con l’analisi statistica

Ottenere alla fine un quadro riassuntivo degli spot di interesse

Gli spots vengono ricontrollati ed ottimizzati

Anche con l’aiuto dell’immagine 3D degli spot interessati

E’ possibile esaminare i gels relativi a diversi esperimenti …

… e confrontarne i risultati

Ogni proteina (spot)è caratterizzata

da Mr - pI

Ricerca nei Data Base

Se non è possibile ritrovare gli spot in data base allora si prosegue con l’analisi degli spot dal gel

SPOT CUTTER

ALCUNE DELLE APPLICAZIONI DELLA PROTEOMICA

CAMPO FARMACEUTICO:

STUDIO DEGLI EFFETTI DI NUOVI FARMACI E LORO TOSSICITA IDENTIFICANDO LE VARIE MODIFICAZIONI POLIPEPTIDICHE

CAMPO AGRO-ALIMENTARE:

STUDIO DI PROTEINE TOSSICHE O PROTETTIVE CHE SONO COINVOLTE IN MOLTI MECCANISMI DI RESISTENZA AD AGENTI PATOGENI E PARASSITARI SVILUPPATISI CON L’INTRODUZIONE DI TECNOLOGIE TRANSGENICHE

NELLA CLINICA MEDICA:

ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI

RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI:

DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

NELLA CLINICA MEDICA:

ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI SIA PER I TUMORI CHE PER LE MALATTIE INFETTIVE

RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI:

DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

Caratterizzazione della Proteina Tumorale TD52

proteina

anticorpo

S1

S3

S2

4 5 6 7

25 _

37 _

50 _75 _

4 5 6 7

S1

S3

S2

M(kDa)

25 _

37 _

50 _75 _

mappa 2D

La 2-DE si può applicare anche con l’uso di isotopi radioattivi

incubazione con S35 del campione

solubilizzazione

separazione in 2DE

seccaggio del gel

esposizione su lastra