Nuovi approcci per la propagazione e il miglioramento

genetico di Vitis vinifera L.

Rino Cella Dipartimento di Biologia e Biotecnologie

Nuovi approcci per la conservazione del

germoplasma di vite

Il patrimonio genetico e la sua evoluzione.

Agricoltura e modificazioni genetiche

Le piante GM: cosa e come sono, e come

diventeranno.

Viti GM

Coltura in vitro di vegetali

Improving somatic embryogenesis

Esempio di utilizzo dell’embriogenesi somatica per la conservazione di specie a rischio di estinzione

Embriogenesi somatica in Vitis vinifera: scelta del mezzo di coltura

ottimale

Application Nro. CL3521-2008. (Tapia et al. (2009), J. Biotech. DOI 10.1016/j.jbiotec.2008.09.009

Rigenerazione clonale di piante di vite

Anche se nel caso dell’embriogenesi somatica la probabilità è molto

bassa, si possono ottenere varianti somaclonali. Tuttavia queste ultime

possono fornire nuove varietà.

In Thompson Seedless:

In Red Globe:

Activation using liquid media

Piante in

propagazione

Piante in

propagazione

DISIDRATAZIONE

Silica-gel

(14 ore)

DISIDRATAZIONE

Silica-gel

(14 ore)

Pretrattamento

0,75M Saccarosio

(24ore)

Congelamento

rapido

Congelamento

rapido

1mm

Terreno di

moltiplicazione

(24 ore)apice

1mm

Terreno di

moltiplicazione

(24 ore)apice

INCAPSULAZIONE

+

OSMOTOLLERANZA

Riscaldamento

RICRESCITA

Riscaldamento

RICRESCITA

Alginato di sodio

3% (30 min)

Alginato di sodio

3% (30 min)

100 mM

CaCl2(30 min)

100 mM

CaCl2(30 min)

CRIOCONSERVAZIONE

Paris et al 2005

Panis et al. 2005

Il patrimonio genetico è dinamico

Il patrimonio genetico di un organismo è soggetto a

mutazioni indotte da cause interne ed esterne (da 1000 a

10.000 lesioni/cellula/giorno).

La stragrande maggioranza di queste lesioni al DNA sono

riparate dalla cellula ma alcune sfuggono ai processi di riparo

dando luogo a mutazioni permanenti.

Esistono inoltre alcune sequenze note come elementi

trasponibili che si spostano da un punto all’altro del genoma.

E’ stato recentemente osservato che lo spostamento di questi

elementi favorisce la formazione di nuovi prodotti genici.

“πάντα ῥεῖ ὡς ποταμός” “tutto scorre come un fiume” Eraclito (535-475 BC)

La trasmissione del DNA

L’informazione genetica è normalmente trasmessa dai genitori

alla prole grazie alla riproduzione sessuale con una modalità

definita verticale.

Tuttavia, l’informazione genetica può essere trasmessa tra

specie diverse in modo orizzontale o laterale: le cellule

animali e vegetali così come le conosciamo sono il risultato di

un processo di inglobamento di batteri da parte di una cellula

ancestrale che ha dato origine a mitocondri e plastidi.

Il trasferimento orizzontale o laterale è molto più diffuso di quanto si possa pensare (origine di mitocondri e cloroplasti, Drosophila ananassae /Wolbackia; cellule della mucosa intestinale), afidi fotosintetici.

Con l’agricoltura, la selezione naturale fu sostituita

dalla selezione artificiale operata dall’uomo.

Rispetto alle piante progenitrici, le varietà attualmente

coltivate sono geneticamente modificate anche se

inizialmente le modificazioni sono state ottenute

inconsciamente selezionando mutazioni spontanee.

L’agricoltura ha modificato la forma delle piante coltivate

Esempio di selezione di mutanti spontanei

Alcuni caratteri genetici modificati dopo l’introduzione dell’agricoltura

Carattere Esempi

Perdita di meccanismi di dispersione Frumento, riso* Perdita della dormienza Frumento, avena, riso

Passaggio da perenne ad annua Riso, segale, manioca

Perdita di produzione di frutti lgname, patata dolce

Perdita di produzione di semi Banana, agrumi

Aumento del volume di

Semi Fagioli

Frutti Zucchini

Organi di riserva Manioca, carota

Fonte: Adattato da J. Salick e L. Merrick.

Alcuni ricercatori hanno recentemente isolato il gene di riso chiamato Shattering1

(SHA1), che è responsabile della dispersione dei semi. La mutazione che controlla la

perdita della dispersione riguarda il cambiamento di un singolo nucleotide (Lin et al,

2007 Planta Published online Jan 10th).

Riduzione dei fattori

antinutrizionali

Uno degli scopi del miglioramento genetico è stato ed è anche quello di ridurre o eliminare il contenuto di fattori antinutrizionali presenti nelle piante in qualità di sostanze di difesa contro predatori e patogeni ma ovviamente tossici anche per l’uomo.

Mutagenesi e miglioramento genetico

La produzione di piante GM/GE è stata resa possibile dall’integrazione di due discipline:

la coltura in vitro di cellule vegetali

la tecnologia del DNA ricombinante

…e grazie all’aiuto del batterio Agrobacterium tumefaciens, un ingegnere genetico naturale

Avvenuto il trasferimento genico, per selezionare le cellule trasformate occorre un gene di selezione o marcatore (ad esempio che conferisce la resistenza ad un antibiotico).

Metodi per ottenere piante

transgeniche

Definizione di OGM o OGE

“A genetically modified organism (GMO) or genetically engineered organism (GEO) is an organism whose genetic characteristics have been altered by the insertion of a modified gene or a gene from another organism using the techniques of genetic engineering.”

(The American Heritage Medical Dictionary, Houghton Mifflin Company, 2007).

Il miglioramento genetico ottenuto per via tradizionale e quello mediante ingegneria genetica sono analoghi

La commissione “Splicing life”, istituita dal Presidente degli USA nel

1982 su pressione di gruppi religiosi, e quella del National Research

Council del 1989 hanno raggiunto la seguente conclusione:

“no conceptual distinctions exist between genetic modification of

plants and microorganisms by classical methods or by molecular

techniques that modify DNA and transfer genes”.

I diversi gruppi religiosi esprimono giudizi contrastanti sulla tecnologia

del DNA ricombinante.

Il Vaticano non si è mai schierato contro gli OGM e, in alcune

occasioni, ha espresso un giudizio di cauta apertura a patto che siano

rispettati l’ambiente e il valore della solidarietà tra Paesi ricchi e poveri.

Confronto tra incrocio sessuale e

trasformazione

Il miglioramento mediante incrocio è un processo lento e limitato alle

specie sessualmente compatibili. Inoltre, esso causa il trasferimento

incontrollato di sequenze di DNA per lo più sconosciute.

La tecnologia del DNA ricombinate e i metodi di trasformazione

permettono di accelerare il processo di selezione di nuove varietà; con

questa tecnologia si superano le barriere di compatibilità sessuale tra le

specie (e tra i regni degli organismi) e si inseriscono esclusivamente i

geni desiderati.

Il gene di resistenza agli antibiotici può essere sostituito da un gene marcatore alternativo

Mannose

Mannose-6-phosphate

Fructose-6-phosphate

PMI

Anche se quello del gene marcatore è un falso problema, sono stati

messi a punto metodi altri tipi di selezione. Una consiste nell’uso del

gene codificante la mannosio fosfato isomerasi (PMI). Le piante non

sono in grado di utilizzare il mannosio quale sola sorgente di carbonio in

quanto in mancanza di PMI accumulano “mannose-6-phosphate”

Piante di pomodoro resistenti all’erbicida Basta perché detossificano l’erbicida

Piante GM con la tossina Bt

La produzione della tossina Bt da parte del mais transgenico impedisce

il ciclo biologico del lepidottero predatore.

Nel caso del cotone Bt, il numero di trattamenti annui con pesticidi si

riduce da 5-15 a 1-3. Se tutto il cotone coltivato nel mondo fosse Bt, si

risparmierebbero 5300 tonnellate di pesticidi.

Piante GM resistenti a virus

L’uso di queste piante GM permetterebbe di aumentare la produttività

del 10-20% riducendo il consumo di insetticidi in quanto gli insetti sono

i principali vettori di virus.

Piante transgeniche di pomodoro adatte alla crescita in terreni salini

Bassa

salinità

Alta

salinità

Controllo Trasformato

Trasformato Controllo

Frutti di pomodoro dopo 21 giorni dall’inizio della

maturazione. Usando la tecnica RNA antisenso per

ACC ossidasi, le piante transgeniche producono il

5% dell’etilene prodotto da quelle non trasformate.

Fiori di garofano ingegnerizzato per una ridotta

produzione di etilene.

Frutti e fiori a lunga conservazione

Golden Rice e Golden tuber

‘‘Golden Rice 2’’: 31 mcg/g dry

weight β -carotene).

‘‘Golden Tuber’’: 47 mcg/g dry

weight β-carotene dry).

Nature Biotechnology 2008, 26: 1301-08

Obiettivi della introduzione degli OGM/OGE

Oltre agli usi biologici e medici, l’ingegneria genetica ha

riguardato principalmente l’agricoltura (il primo OGM/OGE

fu commercializzato nel 1996).

Il ruolo maggiore è svolto dalla Monsanto che nel 2007 fornì

semi GM/GE per coltivare 125 milioni d Ha con una crescita

del 13% rispetto al 2006.

Due esempi di piante GM/GE sono: il “Triple-stack corn”,

che fornisce la resistenza a due erbicidi, piralide e nematodi,

e il cotone Bt.

Dibattito relativo all’uso di OGM/OGE

La possibilità di produrre e coltivare piante GM/GE ha innescato dubbi

e paure (principio di precauzione) relative a paventati effetti dannosi

sulla salute umana e sull’ambiente. Ciò ha riguardato:

- aumentata presenza di allergeni nel cibo

- trasferimento di geni di resistenza agli antibiotici

- trasferimento dei transgeni ad altri organismi mediante

impollinazione incrociata (delle specie sessualmente compatibili)

- perdita della biodiversità

- considerazione etiche relative alla modifica del patrimonio genetico

Uso di organismi OGM/OGE in viticoltura e nella vinificazione

Possibili benefici derivanti dall’us0 di viti GM/GE

Viti GM/GE sono state ottenute in Cile, Francia, Germania, Sud Africa

e Stati Uniti (Vigne et al 2004 Transgenic Research 13: 165-179).

Recentemente anche in Italia.

In particolare l’attenzione è rivolta alla produzione di cultivar

caratterizzate da una maggior resistenza a varie patologie con il

risultato di ridurre il rilascio ambientale di insetticidi e fungicidi e

limitare i costi di produzione di uva. I geni utilizzati ed ingegnerizzati

sono stati quelli codificanti PGIP di vite, chitinasi e glucanasi di

lievito, peptidi antifungini, allo scopo di aumentare le difese

antifungine. Inoltre, sono in corso ricerche per trovare nuovi geni di

resistenza.

Alle ricerche finalizzate all’ottenimento di viti resistenti a

funghi, virus, batteri quali, ad esempio, quelle contro

oidio, Agrobacterium, Botrytis, Clostridium, Xylella,

nepovirus e closterovirus sono seguite sperimentazioni in

campo: 6 in Europa dal 1994 al 2004 (Francia 4, Italia 1,

Germania 1) e 53 negli USA dal 1995 al 2004. Alcune

varietà sono in via di commercializzazione.

Sperimentazioni in campo sono in corso anche in Canada,

Sud Africa e Australia.

Sperimentazioni in campo

Schema del programma di miglioramento di viti e portainnesti di WINETECH*

* Wine Industry Network of Expertise and Technology in Sud Africa

da Berrie, 2011

Dibattito sulla sicurezza alimentare dei vini GM/GE

La possibilità di utilizzare sia viti GM/GE sia lieviti nella

produzione del vino ha stimolato l’analisi scientifica del

problema della possibile tossicità del vino ottenuto.

Alcuni autori hanno mostrato che dopo il processo di

vinificazione il DNA è persiste nel vino per oltre un anno.

Tuttavia, altri autori hanno sottolineato il fatto che il DNA

introdotto per via alimentare è parzialmente degradato nel

processo di digestione perdendo così la sua integrità genetica.

Altri ricercatori hanno analizzato l’effetto sulla salute umana

e sull’ambiente di sei vini prodotti con diverse pratiche

viticole e di vinificazione

- biologica/organica

- integrata

- biodinamica

- convenzionale

- vite GM/GE

- lievito GM/GE.

I risultati ottenuti non hanno evidenziato alcuna differenza

significativa tra le varie modalità. Gli autori non hanno

inoltre riscontrato differenze di allergenicità tra le proteine

ricombinanti e quelle native. Plahuta and Raspor (2007) Food Control 18: 492-502