GAS CROMATOGRAFIA (GC)

Confronto tra colonne impaccate e capillari

Le colonne capillari

Confronto tra colonne capillari

Polarità: un criterio per scegliere la fase stazionaria

Alcune fasi stazionarie di uso comune per GLC capillare

INIETTORI PER GC

INIETTORI PER GC

Iniettore splitt

Microestrazione in fase solida (SPE)

Estrazione purge & trap

RIVELATORI PER GC

Rivelatore a termoconducibilità (TCD)

Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)

Rivelatore a cattura elettronica (ECD)

I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna

Equazione di Clausius-Clapeyron

p = tensione di vapore∆vH = variazione di entalpia di vaporizzazione

TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

….forense: vediamo Catherine mentre prepara campioni per HPLC…. (da CSI, M. Helgenberger)

La Cromatografia Liquida è diventata una tecnica analitica indispensabile in molti settori: farmaceutico, biologico, biomedico, clinico e …..

HPLC

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Durante il processo cromatografico la velocità con la quale ciascun analita procede lungo la colonna dipende dalle interazioni che stabilisce con la fase mobile e stazionaria, quindi la separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione delle singole molecole nelle due fasi.

La definizione HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) in origine riferita alle elevate pressioni di esercizio caratteristiche di questa tecnica, è stata oggi sostituita con High Performance Liquid Chromatography o semplicemente Liquid Chromatography (LC).

IL SISTEMA HPLC

I componenti fondamentali del sistema HPLC sono:

• una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione;

• un sistema di introduzione del campione;

• una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione;

• un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna; il grafico della risposta del rivelatore in funzione del tempo è chiamato cromatogramma.

IL SISTEMA HPLC

Contenitori dei solventi che

costituiscono la fase mobile

miscelatore

pompa

sistema di introduzione

del campione

precolonna e colonna

rivelatore

computer

raccoglitore di frazioni

STRUMENTAZIONE HPLC

Pompa HPLC a pistoni reciprocanti

Iniettore HPLC a loop

LA COLONNA LC

Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi.

Le tipiche colonne cromatografiche analitichesono lunghe 15-25 cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 µm.

Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 µm.

Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 µm.

Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

TIPI DI LC SU COLONNA

I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione:

• cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento.

• cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide.

• cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti.

• cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti.

LC DI SCAMBIO IONICO (IEC)

La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti. Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili. Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti.

+

+

-

-

-

-

+

flu

sso

La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da

materiale di porosità controllata.

Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole. Infatti le molecole

che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna,

rispetto a quelle che entrano nei pori.

La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico

intervallo di dimensioni.

LC DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC)

flu

sso

SEC di proteine intere

1: Tiroglobulina (669 kD)2: Catalasi (669 kD)3: BSA (67 kD)4: Ovalbumina (43 kD)5: Ribonucleasi (13.4 kD)

SEC di proteine intere

Esempi di fasi stazionarie per SEC

LC DI ADSORBIMENTO

La fase stazionaria è un solido. La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento.

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE

La fase stazionaria è un liquido. La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile (solubilità relativa). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute.

flu

sso

flu

sso

LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi:

Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari.

Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari.

Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

FASE NORMALE E IN FASE INVERSA

FASE STAZIONARIA

In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso.

In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto.

La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP).

Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria.

Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa.

LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto.

La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice.

Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata.

FASI STAZIONARIE PER LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTOFASI STAZIONARIE PER LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

SUPERFICIE DI UNA PARTICELLA DI SILICE PER LC SUPERFICIE DI UNA PARTICELLA DI SILICE PER LC

(c)

MORFOLOGIA DI FASI SILICEE MORFOLOGIA DI FASI SILICEE

(a) Struttura porosa a particelle aggregate

(b) Struttura microporosa(c) Struttura monolitica

La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro).

L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile.

FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP)FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP)

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

SUPPORTO SILICEO

FASE STAZIONARIA LIQUIDA

Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagisconosono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18).

Il grado di ricopertura, espresso in µmol/m2, è una misura della densità di fasesulla superficie della particella.

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICEDERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE

I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto.

DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (END-CAPPINGEND-CAPPING))

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

FASI MOBILI IN LC

In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale.

Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

SCELTA DELLA FASE MOBILE IN LC

La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia:

• nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante;

• nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pHe la forza ionica;

• nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

Non tutti i solventi possono essere utilizzati in LC.

Devono infatti possedere queste caratteristiche:

• devono essere miscelabili in diverse proporzioni

• non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi

• non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV)

• devono avere una bassa viscosità

• devono essere poco tossici e poco infiammabili

• devono essere non troppo costosi

La fase mobile più comune in LC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

SOLVENTI PER FASI MOBILI LC

SERIE ELUOTROPICA E CUTOFF UV DI SOLVENTI PER FASI MOBILI

Ottimizzazione della fase mobile in RP HPLC

Metodo del triangolo di SnyderMetodo del triangolo di Snyder

Esempio di applicazione

1. Alcol benzilico2. Fenolo3. 3’-4’dimetossiacetofenone4. m-dinitrobenzene5. p-dinitrobenzene6. o-dinitrobenzene7. Benzoino

Gradiente di fase mobile

1. Alcol benzilico2. Fenolo3. 3’-4’dimetossiacetofenone4. Benzoino5. Benzoato di etile6. Toluene7. 2,6-dimetossitoluene8. o-metossibifenile

Rivelatori per LC

Rivelatore ad indice di rifrazione (RI)

Rivelatore RI: disegno costruttivo

RIVELATORE UV/Vis

E’ un rivelatore che misura la capacità di assorbire una radiazione luminosa nell’UV/Vis (200-700 nm) da parte degli analiti.

I solventi che compongono la fase mobile non devono assorbire alle lunghezze d’onda utilizzate per l’analisi.

I rivelatori UV/Vis si distinguono in:

• rivelatori a lunghezza d’onda singola

• rivelatori a lunghezza d’onda variabile

• rivelatori a matrice di fotodiodi (photodiode array)

SCHEMA DI RIVELATORE UV/Vis

Questa figura riporta un rivelatore UV/Vis a filtro (in rosso), che permette di leggere l’assorbanza ad una sola lunghezza d’onda (quella selezionata dal filtro).

Sostituendo il filtro con un monocromatore, si ottiene un rivelatore a lunghezza d’onda variabile, che permette di rivelare in una sola analisi composti con spettri di assorbimento molto diversi tra loro.

La cella a flusso di lettura qui rappresentata è doppia: in una delle due celle passa l’eluato della colonna, nell’altra passa la fase mobile. Questo permette di migliorare la linea di base per sottrazione del segnale del solvente

RIVELATORE UV/Vis A FILTRO E A MONOCROMATORE

RIVELAZIONE DEL SEGNALE

Fototubo

• Si basa sull’effetto fotoelettrico: un fotone

incide sul catodo rivestito di un materiale

fotosensibile, provocando l’emissione di

un elettrone

• Si ottiene una corrente proporzionale alla

intensità della radiazione incidente

• I fototubi sono soggetti ad un rumore di

fondo (dark current) causato da effetti

termici+

_

catodo

anodo

• Questi rivelatori sono simili al fototubo:

la radiazione colpisce infatti un catodo

iniziale, provocando l’emissione di

elettroni

• Gli elettroni prodotti vengono però

moltiplicati attraverso la collisione con

una serie di catodi intermedi

• La corrente misurata è così amplificata,

rispetto a quella iniziale, di un fattore

molto elevato (106 – 107)

anodo

catodo

catodiintermedi

Fotomoltiplicatori (PM)

RIVELAZIONE DEL SEGNALE/2

Rivelatori a stato solido: fotodiodo

• Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree:

• In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente

regione p regione n

n - ricche di elettroni p - ricche di cariche positive

RIVELAZIONE DEL SEGNALE/3

Rivelatori a stato solido: fotodiodo

• Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione

incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative

all’interno del materiale, permettendo il passaggio della corrente.

• L’intensità di corrente è

proporzionale alla quantità

di luce incidente.

• Un fotodiodo è più sensibile

di un fototubo e costa meno

di un fotomoltiplicatore.

RIVELAZIONE A FOTODIODO

Array di fotodiodi

• E’ costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli

di spazio regolari su di un microchip

• Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo

tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente

radiazioni di diverse lunghezze d’onda

reticolo

RIVELAZIONE A SERIE DI DIODI

Il rivelatore a matrice o serie di fotodiodi (photodiode array) permette di misurare contemporaneamente un intervallo di lunghezze d’onda, per ottenere lo spettro completo degli analiti eluenti.

Percorso della fase mobile all’interno di una cella di misuradel tipo a “Z”

RIVELATORE A SERIE DI DIODI (DAD)

RIVELATORE A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI

reticolo

lampada adeuterio

fenditura

cella porta campione

otturatore

lampada atungsteno

rivelatore a serie di diodi

lente

lente

Serie di diodi

OTTICA INVERTITA

Sorgente continua

Cella a flusso

Monocromatore

λ1 λ4 λ5 λ6 λ7 λ8 λ9 λ11 λ12λ3 λ10λ2

Principio di funzionamento DAD

Istante per istante, lo strumento registra lo SPETTRO dell’analita che in quell’istante attraversa la cella. Il riferimento è lo spettro del fluido di trasporto

cella a flusso

lampada aldeuterio

lampada al tungsteno

combinatore di raggio

lente di focalizzazione

filtro

specchio

reticolo serie di diodi

guida ottica

cella a flussocella a flusso

DAD con cella a fibra ottica e guida ottica

Tecniche LC: criteri di scelta / P.M.< 2000

Tecniche LC: criteri di scelta / 2000<P.M.< 105-6

sezione trasversaledel canale FFF

Pompa

Iniettore

Flusso

CanaleFFF

Fasemobile

0.123

IN

OUT

Collettore frazioni

RivelatoreUV-Vis

Registratore

Acquisizione dati

Campo

Tecniche FFF/ P.M. > 104

spessore w

Campo esternoIngresso del campione

Flusso

Detector

Flusso a profilo parabolico

spes

sore

w

Campione

Il dispositivo FFF

Come funziona la FFF?

Cammino particella

Profilo flusso

B

Campo

Profilo flusso

A

Flusso

Modi di operazione FFF

Versatilità rispetto al peso molecolare dell’analita:Modo normale: macromolecole e nanoanalitiModo sterico/iperstrato: sistemi microdispersi

parete di accumulazione

trasporto indotto dal campo

campo

A BA B

Modo FFF normale

trasporto indottodalla diffusione

Modo FFF sterico/iperstrato

A B

A B

sterico

iperstratocampo

campo

trasporto indottoda lift idrodinamico

Tipi di campo e tecniche FFF

Versatilità rispetto al tipo di campione da analizzare:FlFFF: universale (dalle macromolecole alle microparticelle)GrFFF: nano e microparticelle

flusso dicampionein entrata

flusso di campionein uscita

flussotrasversale

flussotrasversale

flusso trasversalein uscita

profiloparabolico

A B C

FlFFF in modo normale

V 1/Dr ∝

fibra

FlFFF a fibra tubolare (HF FlFFF)

modo_normale

HF FlFFF in modo normale

Frazionamento in ampio intervallo di PM

Alta selettività

HF FlFFF di proteine intere

hiperlayer

HF FlFFF in modo a iperstrato

HF FlFFF di batteri interi

FFF a campo centrifugo (SdFFF)

Uscita del campione

Blocco diPlexiglas

Spacer

Parete in vetro oplastica

Valvola diiniezione

Iniezione

FFF a campo gravitazionale (GrFFF)

CAMPO GRAVITAZIONALE

w

x

Forze di sollevamento

d

Ritenzione in GrFFF

Campione iniettatoCampione iniettato: 1.25 ng HRP e 7.5 : 1.25 ng HRP e 7.5 µµg PS/HRP 6 g PS/HRP 6 µµmm

CCD

FM con substrato al

luminolo

0.75

123

Guardiamo dentro al canale GrFFF….

(b), (c) E.coli non fimbriato

(a) E.coli fimbriato

GrFFF di batteri interi

Il campo di forze che causa il trasporto differenziale e' di tipo elettrico.L'elettroforesi ha avuto il suo ideale campo di applicazione in bioanalitica. La separazione si realizza in base al rapporto carica/raggio della molecola.

ELETTROFORESI CON ELETTROLITA LIBEROProblemi di convezione

ELETTROFORESI CAPILLARE ELETTROFORESI CON SUPPORTO

ELETTROFORESI/103<P.M.<108

Aumento del rapporto superficie/volume Tipi di supporto:

acetato di cellulosacarta

gel di poliacrilammide (PAGE)gel di agarosio

I supporti danno un effetto di setaccio per separare in base alle dimensioni, uno volta che le specie siano state caricate in ambiente tamponato Esempi di applicazioni:

Analisi di proteine (Progetto “Proteoma”)Sequenziatura del DNA (Progetto “Genoma”)

ELETTROFORESI SU SUPPORTO

PAGE

✷Total percentage of acrylamide- acrylamide and bis-acrylamide- determines pore size of gel

✷Discontinuous gels are most common for highest resolution:

Low percentage (3%) and low pH (6.8) are used for stacking gel- all proteins run readily through until hit higher percentage and pH (8.6) of running or separating gel (4-20%), then stack up due to change in pH.

Formazione di un gel di PA

Il setaccio tridimensionale si forma dalla co-polimerizzazione del monomero attivato (acrilammide) e del composto che forma i legami trasversali (metilen-bis-acrilammide)

Come migrano gli analiti…

• Voltage difference, E = voltage applied/distance between electrodes; generally expressed as volts/cm

• Charge on molecule, q• Frictional component, f, determined by size and shape of

molecule, pore size of matrix, viscosity of buffer

Velocity of particle, v= Eq/f

Mobility of particle, µ = v/E = q/f

•Size/shape•Charge•Both size/shape and charge

Separation can be effected by

V = IR Ohm lawVoltage is a function of current and resistance

Resistance decreases during electrophoretic run, therefore current increases if maintaining constant voltage

Why minimize current increase during run?

o As current increases, power increases- much of power is dissipated as heat

o Heat affects electrophoretic separation- diffusion increases; samples can be sensitive to heat; buffer viscosity decreases therefore resistance decreases and uneven heating occurs due to best cooling at gel edges

Cosa causa la corrente elettrica…

L‘elettrolita e' all‘interno di un tubo capillare, la convezione e' soppressa dato l'alto rapporto superficie volume.

Il calore e' dissipato rapidamente: uso di alti voltaggi

ELETTROFORESI CAPILLARE (CZE)

•Major drawbacks of gel electrophoresis: speed of analysis. •Speed could be improved by increasing the electric current of the system.•Large amount of heat would be generated: high convection•CZE uses silica fused capillaries ranging from 0.150 to 0.375 millimeters in outer diameter to dissipate the heat produced. Increasing the electric fields produces very efficient separations and reduces separation times.•Very small amount of sample (0.1 to 10 nL) is required. The sample solution is injected at one end and a electric field of 100 to 700 volts/centimeter is applied across the capillary.

Vantaggi della CZE

Accoppiamento tecniche separative/MS

Caratteristiche di un rivelatore ideale per tecniche separativeCaratteristiche di un rivelatore ideale per tecniche separative

1. Non alterare la risoluzione, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati.

2. Avere la massima sensibilità possibile.3. Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti.4. Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti

eluiti, per permetterne l’identificazione.5. Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in

miscela.6. Dare un segnale proporzionale alla concentrazione.7. Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile.8. Non danneggiare i prodotti.9. Non produrre artefatti.10. Consentire la deconvoluzione dei picchi, ossia la scomposizione dei

picchi non risolti nei solo componenti.11. Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile.

Che cos’è la spettrometria di massa?

Spettroscopia di fotoniSpettroscopia di fotoni

Spettroscopia di ioni gassosiSpettroscopia di ioni gassosi

hν

ν1

νn

Sorgente di fotoni Dispersione

Spettro difrequenza

Campo magnetico

+–

––

++

m/z

Campo elettrico

(m/z)1

(m/z)2

Spettrodi massa

MS: un secolo di storia…