Post on 01-May-2015
Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti
Attività elettrica dei neuroni
Nel potenziale d’azione si distinguono due fasi:
-fase di DEPOLARIZZAZIONE
-fase di RIPOLARIZZAZIONE
tempo
Basi ioniche del potenziale d’azione
• conduttanze e correnti di Na voltaggio-dipendenti• conduttanze e correnti di K voltaggio-dipendenti
Qual è il ruolo dei canali del Na+ nella genesi del potenziale d’azione?
1. Osservazione di Hodgkin e Huxley (1939):– al picco di un potenziale d’azione il potenziale di membrana diventa transitoriamente positivo all’interno – overshoot.
2. Ipotesi: è coinvolto il Na – l’entrata di Na attraverso la membrana continuerà fino al raggiungimento del potenziale di equilibrio del Na (ENa).ENa = 58 log ([Na]o / [Na]i) = 58 log (460/50) = 59 mV50% [Na]o -> ENa = 38 mV33% [Na]o -> ENa = 28 nV
3. Esperimento di Hodgkin e Katz (1949):riducendo [Na]o riduzione dell’overshoot
PK : PNa : PClAl potenziale di riposo 1.0: 0.04: 0.45Al picco del PA 1.0 : 20 : 0.45
Conclusione:Il potenziale d’azione è il risultato di un grande e transitorio aumento nella permeabilità al Na della membrana.
Che dire della fase di caduta del potenziale d’azione?
- I canali del Na semplicemente si chiudono (inattivazione)
Ma se la causa fosse solo questa, la ripolarizzazione sarebbe più lenta di quanto osservato sperimentalmente
Il potenziale di membrana ritorna verso EK
Il potenziale di membrana iperpolarizza (diventa più negativo del potenziale di riposo) per un certo tempo
- Si verifica un successivo grosso aumento della permeabilità della membrana al K dovuto all’apertura di canali del K voltaggio-dipendenti.
Ipotesi: Le conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti- La probabilità che i canali si aprano aumenta con la depolarizzazione.
L’effetto della conduttanza al Na- rigenerativo.
Il processo-si autoalimenta-feedback positivo
La depolarizzazione aumenta laconduttanza al K con un certo ritardo.
-autolimitante-feedback negativo
Per spiegare l’ampiezza e l’andamento temporale del potenziale d’azione
Aumentodi gNa
Depolarizz. Corrente di Na entrante
Aumentodi gK
Depolarizz.
Corrente di K uscente
Ripolarizz.
Ipotesi di Hodgkin e Katz:La depolarizzazione della cellula al di sopra del valore di soglia causa un breve aumento della permeabilità della membrana agli ioni Na.
In che maniera la permeabilità di membrana (conduttanza) agli ioni Na varia con il potenziale di membrana?
Esperimento: Occorrerebbe misurare l’ampiezza della corrente di Na+ (INa) che fluisce attraverso la membrana a diversi livelli del potenziale di membrana (Vm)
gNa = INa / (Vm – ENa)
C’è un problema: La corrente fluisce attraverso la membrana il potenziale di membrana cambia la conduttanza della membrana si modifica sia al variare del potenziale di membrana che nel tempo
Cioè, esiste forte interdipendenza del PM e del gating dei canali del Na (e del K) sia il PM che la conduttanza dei canali cambiano costantemente.
Per risolvere questo problema,K. Cole sviluppò la tecnica del voltage-clamp.
depolarizzazione
Canali NaapronoINa entra.
Sempre aperti
extracell.
Voltaggio-dipendenti: rispondono a
variazioni di Vm
intracell.
Alcuni tipi di canali Ionici sono sempre aperti, altri no!
Il loro comportamento è ohmico: la relazione I/V è lineare g=costante
Il loro comportamento non è ohmico: la relazione I/V non è lineare perché g non è costante [g=f(Vm)]
Il modello di H&H della gate assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
C
O
Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:
(1-Po)
Po
Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:
ooo
PPdt
dP )1(
Modello del gating secondo H&H
Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando la condizione al contorno , si ottiene:)0(0 tPP oo
t)(oooo e)PP(P)t(P 100
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:
quindi,
0)1( ooo
PPdt
dP
oP
Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: po
channo tPtP )()(
Po(t)
Pro
b.
Di A
ttiv
az.
Tempo
[Po(t)]p
0 2 4 6 8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1/()= rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating.
0 10 20 30 40-70
20
(m
V)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-60
-40
-20
0
20
40
60C
orre
nte
ioni
ca (
nA)
Tempo (ms)
La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche
transmembranarie generate a tale potenziale di membrana
Potenziale di riposo (Vr)
Potenziale di membrana finale (Vm) costante (potenziale di comando)
Corrente transmembranaria generata dal passaggio di Vm da –70 mV a +20 mV
Vantaggi del voltage-clamp:
In genere, nel caso di canali voltaggio-dipendenti, gm = f(V,t) ma,
1. Vm è bloccato ad un valore costante gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento della corrente ionica Ii
2. E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente
0 10 20 30 40-70
20
Vol
tagg
io (
mV
)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-60
-40
-20
0
20
40
60
Cor
rent
e io
nica
(nA
)
Tempo (ms)
INa+IK
+ TTX (IK)
+ TEA (INa)
Separazione farmacologica delle correnti IK e INa
Cor
ren
te K
+ (
nA
)
0 10 20 30 40-20
0
20
40
60
80
100
120
140
Tempo (ms)
0 10 20 30 40
-70
Vol
tagg
io (
mV
)
Tempo (ms)
-30-20-10
0102030405060
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60-20
0
20
40
60
80
100
120
140
I(K+ )
ma
x (n
A)
Voltaggio (mV)
Con
dutta
nza
(μS
)
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Voltaggio (mV)
IK=gK• (V-EK)
gK = IK/(V-EK)
EK=-80 mV
Voltaggio-dipendenza dei canali Kv
Canali voltaggio-indipendenti
Il potenziale di riposo di una cellula è determinato dalla presenza di due canali permeabili rispettivamente ai cationi A+ e B+ attraverso i quali passano le correnti ioniche IA e IB indicate in tabella.Dopo aver disegnato i rispettivi grafici I/V, determinare:1) le conduttanze gA e gB;2) se i due canali sono voltaggio-dipendenti o -indipendenti;3) il potenziale di equilibrio dei due ioni A e B;4) il potenziale di riposo Vr della cellula.
V(mV) IA (nA) V(mV) IB (nA)
-120 -1650 -20 -1320-110 -1100 -10 -1100-100 -550 0 -880-90 0 10 -660-80 550 20 -440-70 1100 30 -220-60 1650 40 0-50 2200 50 220-40 2750 60 440-30 3300 70 660
V(mV) IA=gA(V-EA) (nA) V(mV) IB=gB(V-EB) (nA)
-120 -1650 -20 -1320-110 -1100 -10 -1100-100 -550 0 -880-90 0 10 -660-80 550 20 -440-70 1100 30 -220-60 1650 40 0-50 2200 50 220-40 2750 60 440-30 3300 70 660
g1A=-1650/[-120-(-90)]= 55 S
g1B=-1320/[-20-(+40)]= 22 S
Vr =(EAgA +EBgB )/(gA +gB )= -52.9 mV
EA=-90mV
EB=+40mV
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
-150 -100 -50 0 50 100
EA EB
Quesito del giorno
Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-clamp ha ricavato che la corrente di K+ (IK) dipende dal potenziale
di membrana (V) secondo la seguente relazione:
(pA)
1) Calcolare i valori di IK nell’intervallo di potenziali tra –80 e
+80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in funzione di V;
2) Dai valori di IK ricavati, e sapendo che EK= -85 mV, calcolare i
valori corrispondenti di gK e metterli in grafico in funzione di V;
3) A quale valore di V sara’ aperta la meta’ dei canali?
9/)10(1
11)85(6.4
VK
eVI
IK = 4.6·[1-1/(1+EXP((V+10/9))]·(V+85) (pA)
Vm IK Vm-EK gK
-80 0.0 5 0.002-70 0.1 15 0.006-60 0.4 25 0.018-50 1.9 35 0.053-40 7.1 45 0.158-30 24.7 55 0.450-20 74.1 65 1.139-10 172.5 75 2.3000 294.2 85 3.46110 394.3 95 4.15020 466.4 105 4.44230 522.9 115 4.54740 572.8 125 4.58250 620.2 135 4.59460 666.7 145 4.59870 712.9 155 4.59980 759.0 165 4.600
0
200
400
600
800
-100 -50 0 50 100
mV
pA
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
-100 -50 0 50 100
mV
nS
EK = -85 mV
0 1 2 3 4
-70
Vol
tagg
io (
mV
)
Tempo (ms)
-50-40-30-20-10
010203040
60
0 1 2 3 4-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
I(N
a) (
nA)
Tempo (ms)
-5
-4
-3
-2
-1
0
I(N
a) (
nA)
0 1 2 3 4Tempo (ms)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
I(N
a)
pic
co (
nA
)
Voltaggio (mV)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 400.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Voltaggio (mV)
Con
du
ttan
za (
μS
)
INa=gNa• (V-ENa)
gNa = INa/(V-ENa)
ENa=+50 mV
Voltaggio-dipendenza dei canali Na
Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dall’inattivazione
La pronasi rimuove l’inattivazione
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0
Co
rre
nt e
(nA
)
0 10 20 30 40
tempo (ms)
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Vo
lt ag
gio
(m
V)
0 10 20 30 40
tempo (ms)
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Con
dutt
anza
(S
)
Voltaggio (mV)
0
0.5
1
Pro
b. c
anal
e ap
erto
-80 -60 -40 -20 0 20 40
-800
-600
-400
-200
0
Cor
ren
t e d
i N
a (
nA)
Voltaggio (mV)
La corrente attraverso il canale dipende da
1. Permeabilità del canale: conduttanzale conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti
2. Driving force – dovuta al potenziale elettrico attraverso la membrana e al gradiente di concentrazione degli ioni.
L’ampiezza della corrente di K aumenta con la depolarizzazione.L’ampiezza della corrente di Na aumenta e poi diminuisce con la depolarizzazione.
Perchè?
Depolarizzazione: Depolarizzazione:
IK= gK (Vm–EK) INa= gNa (Vm–ENa)
Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta
Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario
Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo l’inattivazione
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Co
nd
utt
an
za (
S)
Voltaggio (mV)
0
0.5
1
Pro
b.
ca
na
le a
pe
rto
maxo G
gP
oP)V(g
Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.
Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:
Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)
Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:
xo nP
xoPn
Gmax
Quesito del giorno
Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-clamp e utilizzando la tossina di scorpione per bloccare l’inattivazione, ha ricavato che la conduttanza del canale del Na+ (gNa) dipende dal potenziale di membrana (V) secondo la
seguente relazione:
(nS)
1) Calcolare i valori di gNa nell’intervallo di potenziali tra –
80 e +80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in funzione di V; a quale valore di gNa sarà aperta la metà dei canali?
2) Dai valori di gNa ricavati, e sapendo che ENa= +55 mV,
calcolare i valori corrispondenti di INa e metterli in grafico in
funzione di V.
6/)30(1
116.5
VNa
eg
gNa=5.6(1-1/[1+EXP((V+30)/6)]) (nS)
ENa=+55 mV
Vm gNa (nS) Vm-ENa INa (pA)
-80 0.00 -135 -0.2-70 0.01 -125 -0.9-60 0.04 -115 -4.3-50 0.19 -105 -20.3-40 0.89 -95 -84.5-30 2.80 -85 -238.0-20 4.71 -75 -353.3-10 5.41 -65 -351.50 5.56 -55 -305.910 5.59 -45 -251.720 5.60 -35 -196.030 5.60 -25 -140.040 5.60 -15 -84.050 5.60 -5 -28.060 5.60 5 28.070 5.60 15 84.080 5.60 25 140.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-100 -50 0 50 100
mV
nS
-400
-300
-200
-100
0
100
200
-100 -50 0 50 100
mV
pA
0 1 2 3 4 5 6 7-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
Vm
(mV
)
Tempo (ms)
Studio dell’inattivazione allo stato stazionario
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
I Na (
nA)
Tempo (ms)
0 1 2 3 4 5 6 7
0 mV
Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da un’unica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario
-120 -100 -80 -60 -40 -20 0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Cor
rent
e di
Na
( nA
)
Potenziale di condiz. (mV)
Pro
babi
li tà
gate
h a
per ta
0
1
0.5
-60 -40 -20 0 20 40 60
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Con
dutta
nza
g
Vm (mV)
Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa
EA=+55mV EB=-80mV
Vm g (nS) Vm-EA IA (pA) Vm-EB IB (pA)
-80 0.00 -135 -0.2 5 0.0-60 0.04 -115 -4.3 25 0.9-40 0.89 -95 -84.5 45 40.0-20 4.71 -75 -353.3 65 306.20 5.56 -55 -305.9 85 472.820 5.60 -35 -196.0 105 587.940 5.60 -15 -84.0 125 700.060 5.60 5 28.0 145 812.080 5.60 25 140.0 165 924.0
Nota:A parità di conduttanza, è la driving force che determina
l'andamento della relazione I/V
-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100-400
-200
0
200
400
600
800
1000
Cor
rent
e (p
A)
Voltaggio (mV)
EA=+55mV EB=-80mV
HHsim: Graphical Hodgkin-Huxley Simulator
http://www.cs.cmu.edu/~dst/HHsim/
Esercizio
Usando il programma di simulazione H&H, progettare un esperimento di voltage-clamp per determinare:
(a) Il potenziale di inversione della corrente del Na
(b) Il potenziale di inversione della corrente del potassio
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (ms)
Vo
lta
gg
io (
mV
)
-3000
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (ms)
IK (
nA
)
-500-400-300-200-100
0100200300400500
24 25 26 27 28 29 30
Tempo (ms)
IK (
nA
)
+348 nA (-60 mV)
+60 nA (-70 mV)
-216 nA (-80 mV)
Relazione IK ist. - Voltaggio
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
-85 -80 -75 -70 -65 -60 -55
Voltaggio (mV)
IK is
tan
tan
ea
(n
A) EK
Calcolo del potenziale di inversione (equilibrio) della corrente di K+
C O
Vtail (mV) IK ist. (nA) V-EK
-60 348 -60-EK >0
-70 60 -70-EK >0
-80 -216 -80-EK <0
EK < -60 EK < -70 EK > -80