Modellazione matematica e codici

di simulazione per la

proliferazione, crescita e

differenziazione in vitro di cellule

Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina

massimo@crs4.it

• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale

• Coltivazioni cellulari e bioreattori

• Modellazione matematica e simulazione

• Risultati ottenuti: alcuni esempi

• Potenziali applicazioni

Indice degli argomenti

«L’Ingegneria Tissutale è un campo interdisciplinare della bioingegneria che applica

diversi principi dell’ingegneria e delle scienze biologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o

migliorare funzioni di tessuti o organi»

Ingegneria Tissutale: Definizione

R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)

• L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici

• Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico

Causa patologie e terapie correnti

Paradigma dell’Ingegneria Tissutale

cellule

scaffold

coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzato

Esempio di ingegneria tissutale

P. Bianco, Nature, 2001

Stato dell’arte

J. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010

Stato dell’arte-2

Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010

Cellule: classificazione

Cellule per

impianto

Autologhe

Allogeniche

Xenogeniche

Singeniche

Tipi di cellule

Cellule

Specializzate

Condrociti

Osteoblasti

Endoteliali

Epatociti

……..

Non specializzate (Staminali)

• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule.

• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.

• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.

• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.

Cellule staminali

Nei tessuti connettivi

• Glicoproteine

• Proteoglicani

• Acido ialuronico

• Minerali Proteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),

Minerali (idrossiapatite)

L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge la funzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di divisione tra i diversi tessuti

Matrice extracellulare (ECM)

È un supporto (impalcatura) di tipo organico o inorganico, naturale o artificiale, polimerico o non.

Funzioni principali dello scaffold

• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto

• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM

• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.

Scaffold

Scaffold: caratteristiche ideali

Proprietà

Bio-compatibilità

Bio-degradabilità

in vivo controllata

Garantire adesione cellulare

Porosità

Scaffold: morfologia

Fibroso Spugnoso Gelatinoso

Fasi

• Prelievo (biopsia)

• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)

• Seeding su scaffold

• Espansione/crescita/differenziazione

Analisi e caratterizzazione

• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)

• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)

• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter

• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso

Coltivazione in vitro

• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask)

• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi)

I bioreattori consentono il raggiungimento di alte densità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemi statici (106/cm3)

Sistemi di coltivazione in vitro

Un bioreattore consente di:

• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura

• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari

• Monitorare e regolare i parametri fisico-chimici in tempo reale

• Produzione su larga scala di cellule e tessuti

Vantaggi di un bioreattore

Stirred Flask Bioreactor

Rotating wall Bioreactor

Direct Perfusion Bioreactor

Modellazione matematica

La modellazione matematica e la simulazione computazionale hanno lo scopo di:

• Riduzione dei costi della sperimentazione

• Progettazione di apparecchiature

• Ottimizzazione delle condizioni operative

Modellazione matematica-2

I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dal Programma di Bioingegneria del CRS4 sono basati principalmente su:

• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)

• Bilancio di popolazione (sulle cellule)

- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte

in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro).

- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)

Modellazione matematica-3

• Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN

• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL)

• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore.

• Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.

Sistemi investigati

• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;

• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);

• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo);

• Espansione di MSC (cellule ovine);

• Espansione di condrociti ovini;

• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC

Esempi di applicazione: I

Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate

Coltivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASA commissionato per il MIT) , utilizzo di condrociti articolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti a base di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

Cartilagini ingegnerizzate

a

c

b

x

0

r

y

z

r

q

d/2

d/2

h/2

h/2

Culture

medium bulk

Culture

medium

Sterile gas

incubator

Culture

medium

d

d

Scaffolds

z

0

Cartilagini ingegnerizzate-2

Modello matematico

Cartilagini ingegnerizzate-3

Modello matematico-2

Cartilagini ingegnerizzate-4

PO2=80 mm hg

t=10 days

Cartilagini ingegnerizzate-5

PO2=40 mm hg

t=5 weeks

Cartilagini ingegnerizzate-6

Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg

Cartilagini ingegnerizzate-7

Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA

Cartilagini ingegnerizzate-8

Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA

Esempi di applicazione: II

Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo)

Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule mesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM, uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1

Espansione e differenziazione di MSC

Espansione e differenziazione di MSC-2

Modello matematico

Espansione e differenziazione di MSC-3

Modello matematico-2

Espansione e differenziazione di MSC-4

Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily

Espansione e differenziazione di MSC-5

Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1

t=21 days

Espansione e differenziazione di MSC-6

Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura

Esempi di applicazione: III

Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo)

Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine, aggiunta di LIF, Activin-A

Espansione e differenziazione di CNSSC

Espansione e differenziazione di CNSSC-2

Modello matematico

Espansione e differenziazione di CNSSC-4

Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF

Espansione e differenziazione di CNSSC-5

Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A

Espansione e differenziazione di CNSSC-6

Coltivazione con aggiunta di Activin A

t=3 days

Esempi di applicazione: IV

Espansione di MSC (cellule ovine)

Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine, soluzione di nutrienti a base di MEM (Minimum Essential Medium Eagle)

Espansione di MSC (cellule ovine)

Modello matematico

Espansione di MSC (cellule ovine)-2

Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)

Esempi di applicazione: V

Espansione di condrociti ovini

Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di DMEM

Espansione di condrociti ovini

Modello matematico

Espansione di condrociti ovini-2

Sistema statico, petri dishes, medium DMEM

Espansione di condrociti ovini-3

Esempi di applicazione: VI

Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC

Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) + EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC

Modello matematico

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2

Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell

Growth Medium (EGM-2)

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3

Possibili campi di applicazione

L’approccio modellistico presentato può essere utilizzato in diversi campi della biomedicina:

• Ingegneria Tissutale;

• Medicina rigenerativa;

• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;

• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.

Riferimenti bibliografici

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Riferimenti bibliografici-2

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Riferimenti bibliografici-3

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• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, E. Desogus, F. Piras, G. Piga, G. La Nasa e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro mesenchymal stem cells proliferation. Cell Proliferation, 42,602-616 (2009).

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Riferimenti bibliografici-4

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• L. Mancuso, M. Scanu, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro HUVECs proliferation in the presence of various types of drugs. Cell Proliferation, 43, 617-628 (2010).

• J. Vacanti. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art, Journal of Pediatric Surgery, 45, 291–294, (2010).

• R. Tozzi. Nuovi Idrogeli per l'Ingegneria Tissutale ed il Drug Delivery, Dipartimento farmaceutico, Università di Parma. PhD Thesis, http://hdl.handle.net/1889/1437 (2010).