Le Tecnologie diBiologia Molecolare

nella ricerca Biomedica

La possibilità di accedere a tecnologie del DNA ricombinante rappresenta un grande vantaggio per la ricerca biomedica.

Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per:

a) Aiuto nella formulazione di una diagnosi;b) Caratterizzazione funzionale di un fattore genetico;

Tecnologie considerate

PCR DNART-PCR cDNASequenziamento DNA

Southern Blot DNANorthern Blot RNA

Diagnosi di difetto genetico

Paziente con cariotipo XY ma con fenotipo femminile

15-20% di questi pazienti hanno un’alterazione del gene SRY

Analisi del gene SRY

Delezione Mutazione puntiforme

Totale Parziale

Delezione Mutazione puntiforme

Totale Parziale

PCR Sequenziamento

Migrazione elettroforetica del DNA

Il DNA (e l’RNA) possiede carica negativa e pertanto in particolari matrici (gel di agarosio e poliacrilammide) se sottoposto ad un campo elettrico tende a migrare verso il polo positivo.

La velocità con cui un frammento migra verso il polo positivo è proporzionale alla sua dimensione

M1,353 bp

1,078 bp

271 bp

310 bp

603 bp

194 bp

98 bp

852 bp

Necessari metodi di rilevamento per “vedere” il DNA (o RNA) EtBr

P C R

Polymerase Chain Reaction

Reazione a catena di polimerizzazione del DNA

ObiettivoProdurre una notevole quantità di copie di un frammento di DNA di interesse che viene sottoposto ad amplificazione

PCR

1988

P C R

Regione di interesse(non necessaria la conoscenza della sequenza)

5’

5’3’

3’Primer F

Primer R

Reazione enzimatica con: DNA polimerasi

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) A C T G

2 primers (innesco)

Template (stampo)

P C R

Animazione

Applicazioni della P C R

Fornisce una risposta qualitativa (c’è o non c’è?) su una data

sequenza genomica

PCR – analisi mutazionale di geni

Prodotti di PCR

Sequenziamento direttoSSCPDDGE

PCR – Tipizzazione polimorfismi (varianti neutre del DNA)

Prodotto di PCR

Digestione enzimi di restrizioneRFLP

VNTR (VariationNumber TandemRepeat)

SNP (Single NucleotidePolimorphism)

PCR – Genotipizzazione VNTR (Microsatelliti)

GATCAGCTGAGGACTATAGCCAGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACTGACCCAGTTTAACAGAATAGCAAC

p M

RT - P C R

Polymerase Chain Reaction

Reazione a catena di polimerizzazione del DNA

Il materiale di partenza è RNA che viene retrotrascritto in cDNA

Studio dell’espressione dei geni (++)

RT

tessuto

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTT

cDNA

Reverse transcriptase

RT - PCR

cDNA

PCR positiva = gene espresso nel tessuto da cui è stato estratto l’RNA

RT - PCR

Qualitativa: “espresso, non espresso”Quantitativa: “quanto è espresso” (con speciali accorgimenti e/o speciali apparecchiature)

Serve anche a verificare eventuali fenomeni di splicing alternativo in funzione dei primers utilizzati

Rapidità, scarsità di materiale

Isoforma 1

Isoforma 2

RT-PCR

Un vantaggio della tecnologia di RT-PCR è la possibilità di amplificare e sequenziare direttamente un gene che possiede una struttura esoni/introni molto frammentata.

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

RT-PCR

Analisi di mutazioni che non interessano il cds ma che comprendono siti di splicing

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

Splicing normaleSplicing aberrante

ag ag aggt at gt

Sequenziamento

Per sequenziamento si intende la lettura ordinata delle basi che compongono una catena

di DNA

La tecnologia odierna permette di attuare facilmente questo processo solo in presenza di una notevole quantità di copie del frammento da sequenziare

Prodotti di PCR

Cloni plasmidici, BAC, PAC

DNA genomico

Sequenziamento

Senso della lettura

Lettura possibile di 600-800 basi dopo l’oligonucleotide-innesco

Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

Reazione enzimatica con: DNA polimerasi

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) - 90%A C T G

ddNTP (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) – 10%A C T G

1 Primer innesco

Sintesi nuovo DNA

MOLTE COPIE!!!!!

Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

GTCACT

GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACACTGTCATC

GTCACTAGTAT

GTC

GTCACTAGTATCGCTATA

GTCACTAGTATCG

GTCACTAGTATCGCTATAGCT

GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACAC

Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

GGTGTCGTCAGTCACGTCACTGTCACTAGTCACTAGGTCACTAGTGTCACTAGTAGTCACTAGTATGTCACTAGTATCGTCACTAGTATCGGTCACTAGTATCGCGTCACTAGTATCGCTGTCACTAGTATCGCTAGTCACTAGTATCGCTATGTCACTAGTATCGCTATAGTCACTAGTATCGCTATAGGTCACTAGTATCGCTATAGCGTCACTAGTATCGCTATAGCTGTCACTAGTATCGCTATAGCTAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAC

Migrazione elettroforetica+

Lettura fluorocromi

Sequenziamento

-

+ Lettore laser

Animazione

Ibridazione Acidi Nucleici

ATCGTTTGCGTAGTGCAGT

TAGCAAACGCATCACGTCA

TAGCAAACGCATCACGTCA

SONDA (DNA o cDNA)

Ibridazione Acidi Nucleici

In funzione di alcuni parametri operativi della tecnica possiamo ottenere ibridazioni altamente specifiche oppure permettere ibridazioni meno

specifiche.

Southern Blot

Attuata sul DNA

DNA digerito con enzimi di restrizione e sottoposto a elettroforesi

Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa

Tecnica utilizzata per individuare la presenza (o assenza) di un frammento di

acido nucleico in un genoma

Southern Blot

DNA Digestione conEcoRI

M T

-

+

10 Kb

5 Kb

3 Kb

2 Kb

2.5 Kb

MigrazioneGel agarosio

DenaturazioneCon NaOH

Trasferimentosu membrana di nylon

Fissazione

Southern Blot

ATGGCAGTAACG

Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

Southern Blot

3 Kb

EcoRI EcoRI

3 Kb

ATGGCAGTAACG

Applicazioni possibili

Identificazione aberrazioni cromosomiche strutturali

DelezioniDuplicazioniInversioni……

Tutte quelle aberrazioni cha causano un cambiamento della lunghezza del

frammento compreso tra i due siti di taglio dell’enzima utilizzato e contenente la

sequenza specifica della sonda utilizzata.

SB - Delezione

EcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRI

wt/wt wt/- -/-

SB - Delezione

EcoRI EcoRI

WTEcoRI

wt/wt wt/- -/-

EcoRI

-EcoRIEcoRI

SB - Duplicazioni

wt/wt wt/- -/-

EcoRI EcoRI

WTEcoRIEcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRIEcoRI

-EcoRIEcoRI EcoRI

SB - Inversioni

wt/wt wt/- -/-

EcoRI EcoRI

WTEcoRIEcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRI

-EcoRIEcoRI

Southern Blot - Test

Test.

Pazi

en

te 1

Pazi

en

te 2

Pazi

en

te 3

Pazi

en

te 4

Pazi

en

te 5

Pazi

en

te 6

Pazi

en

te 7

Pazi

en

te 8

Pazi

en

te 9

Pazi

en

te 1

0

EcoRI EcoRI EcoRI

delezione

Southern Blot – tra specie diverse

Attuando lavaggi meno stringenti posso evidenziare sequenze simili tra specie diverse, ossia permettere un minor numero di legami tra sonda e sequenza omologa, e quindi evidenziare la presenza o meno di una sequenza simile.

ZOO-BLOT

ZOO - Blot

H.

Sap

ien

s

Dog

Cat

Mou

se

Rat

Pig

Catt

le

Goat

Sh

eep

Tu

rtle

Ch

iken

Northern Blot

Attuata sull’RNA

RNA non digerito

Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa

Tecnica utilizzata per individuare la lunghezza di un mRNA e per studiare l’espressione di un gene

nei diversi tessuti

Northern Blot

AAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

mRNA

M T

-

+

10 Kb

5 Kb

3 Kb

2 Kb

2.5 Kb

MigrazioneGel agarosio

TrsferimentoSu membrana

Fissazione

Northern Blot

ATGGCAGTAACG

Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

Northern Blot

3 Kb

3 Kb

AAAAAAAAAAATGGCAGTAACG

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

AAAAAA

Espres. Ubiquitaria

AAAAAA

Splicing Alternativo

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

AAAAAA

Espres. Specifica

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

Quantitativa

AAAAAA

Northern Blot

AAAAAA 10 d

pc

11 d

pc

12 d

pc

13 d

pc

14 d

pc

10 d

pc

11 d

pc

12 d

pc

13 d

pc

14 d

pc

HeLa

Testis Ovary

Quantitativa

Southern e Northern Blot

Tecniche di ibridazione di acidi nucleici

Tecniche cha forniscono una risposta quantitativa

Tecniche cha forniscono una risposta qualitativa

Southern e Northern Blot

Evidenziare e quantificare la presenza di una regione genomica

Evidenziare e quantificare la presenza di un trascritto di un gene in un dato tessuto

in un dato momento