lezione tecniche 2006

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Le Tecnologie di Biologia Molecolare nella ricerca Biomedica

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genetica molecolare lezione 16/11/2007universita di pavia

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Le Tecnologie diBiologia Molecolare

nella ricerca Biomedica

Page 2: lezione tecniche 2006

La possibilità di accedere a tecnologie del DNA ricombinante rappresenta un grande vantaggio per la ricerca biomedica.

Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per:

a) Aiuto nella formulazione di una diagnosi;b) Caratterizzazione funzionale di un fattore genetico;

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Tecnologie considerate

PCR DNART-PCR cDNASequenziamento DNA

Southern Blot DNANorthern Blot RNA

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Diagnosi di difetto genetico

Paziente con cariotipo XY ma con fenotipo femminile

15-20% di questi pazienti hanno un’alterazione del gene SRY

Analisi del gene SRY

Delezione Mutazione puntiforme

Totale Parziale

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Delezione Mutazione puntiforme

Totale Parziale

PCR Sequenziamento

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Migrazione elettroforetica del DNA

Il DNA (e l’RNA) possiede carica negativa e pertanto in particolari matrici (gel di agarosio e poliacrilammide) se sottoposto ad un campo elettrico tende a migrare verso il polo positivo.

La velocità con cui un frammento migra verso il polo positivo è proporzionale alla sua dimensione

M1,353 bp

1,078 bp

271 bp

310 bp

603 bp

194 bp

98 bp

852 bp

Necessari metodi di rilevamento per “vedere” il DNA (o RNA) EtBr

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P C R

Polymerase Chain Reaction

Reazione a catena di polimerizzazione del DNA

ObiettivoProdurre una notevole quantità di copie di un frammento di DNA di interesse che viene sottoposto ad amplificazione

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PCR

1988

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P C R

Regione di interesse(non necessaria la conoscenza della sequenza)

5’

5’3’

3’Primer F

Primer R

Reazione enzimatica con: DNA polimerasi

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) A C T G

2 primers (innesco)

Template (stampo)

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P C R

Animazione

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Applicazioni della P C R

Fornisce una risposta qualitativa (c’è o non c’è?) su una data

sequenza genomica

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PCR – analisi mutazionale di geni

Prodotti di PCR

Sequenziamento direttoSSCPDDGE

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PCR – Tipizzazione polimorfismi (varianti neutre del DNA)

Prodotto di PCR

Digestione enzimi di restrizioneRFLP

VNTR (VariationNumber TandemRepeat)

SNP (Single NucleotidePolimorphism)

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PCR – Genotipizzazione VNTR (Microsatelliti)

GATCAGCTGAGGACTATAGCCAGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACTGACCCAGTTTAACAGAATAGCAAC

p M

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RT - P C R

Polymerase Chain Reaction

Reazione a catena di polimerizzazione del DNA

Il materiale di partenza è RNA che viene retrotrascritto in cDNA

Studio dell’espressione dei geni (++)

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RT

tessuto

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTT

cDNA

Reverse transcriptase

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RT - PCR

cDNA

PCR positiva = gene espresso nel tessuto da cui è stato estratto l’RNA

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RT - PCR

Qualitativa: “espresso, non espresso”Quantitativa: “quanto è espresso” (con speciali accorgimenti e/o speciali apparecchiature)

Serve anche a verificare eventuali fenomeni di splicing alternativo in funzione dei primers utilizzati

Rapidità, scarsità di materiale

Isoforma 1

Isoforma 2

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RT-PCR

Un vantaggio della tecnologia di RT-PCR è la possibilità di amplificare e sequenziare direttamente un gene che possiede una struttura esoni/introni molto frammentata.

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

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RT-PCR

Analisi di mutazioni che non interessano il cds ma che comprendono siti di splicing

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

Splicing normaleSplicing aberrante

ag ag aggt at gt

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Sequenziamento

Per sequenziamento si intende la lettura ordinata delle basi che compongono una catena

di DNA

La tecnologia odierna permette di attuare facilmente questo processo solo in presenza di una notevole quantità di copie del frammento da sequenziare

Prodotti di PCR

Cloni plasmidici, BAC, PAC

DNA genomico

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Sequenziamento

Senso della lettura

Lettura possibile di 600-800 basi dopo l’oligonucleotide-innesco

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Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

Reazione enzimatica con: DNA polimerasi

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) - 90%A C T G

ddNTP (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) – 10%A C T G

1 Primer innesco

Sintesi nuovo DNA

MOLTE COPIE!!!!!

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Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

GTCACT

GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACACTGTCATC

GTCACTAGTAT

GTC

GTCACTAGTATCGCTATA

GTCACTAGTATCG

GTCACTAGTATCGCTATAGCT

GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACAC

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Sequenziamento

AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT

GGTGTCGTCAGTCACGTCACTGTCACTAGTCACTAGGTCACTAGTGTCACTAGTAGTCACTAGTATGTCACTAGTATCGTCACTAGTATCGGTCACTAGTATCGCGTCACTAGTATCGCTGTCACTAGTATCGCTAGTCACTAGTATCGCTATGTCACTAGTATCGCTATAGTCACTAGTATCGCTATAGGTCACTAGTATCGCTATAGCGTCACTAGTATCGCTATAGCTGTCACTAGTATCGCTATAGCTAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAC

Migrazione elettroforetica+

Lettura fluorocromi

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Sequenziamento

-

+ Lettore laser

Animazione

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Ibridazione Acidi Nucleici

ATCGTTTGCGTAGTGCAGT

TAGCAAACGCATCACGTCA

TAGCAAACGCATCACGTCA

SONDA (DNA o cDNA)

Page 28: lezione tecniche 2006

Ibridazione Acidi Nucleici

In funzione di alcuni parametri operativi della tecnica possiamo ottenere ibridazioni altamente specifiche oppure permettere ibridazioni meno

specifiche.

Page 29: lezione tecniche 2006

Southern Blot

Attuata sul DNA

DNA digerito con enzimi di restrizione e sottoposto a elettroforesi

Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa

Tecnica utilizzata per individuare la presenza (o assenza) di un frammento di

acido nucleico in un genoma

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Southern Blot

DNA Digestione conEcoRI

M T

-

+

10 Kb

5 Kb

3 Kb

2 Kb

2.5 Kb

MigrazioneGel agarosio

DenaturazioneCon NaOH

Trasferimentosu membrana di nylon

Fissazione

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Southern Blot

ATGGCAGTAACG

Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

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Southern Blot

3 Kb

EcoRI EcoRI

3 Kb

ATGGCAGTAACG

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Applicazioni possibili

Identificazione aberrazioni cromosomiche strutturali

DelezioniDuplicazioniInversioni……

Tutte quelle aberrazioni cha causano un cambiamento della lunghezza del

frammento compreso tra i due siti di taglio dell’enzima utilizzato e contenente la

sequenza specifica della sonda utilizzata.

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SB - Delezione

EcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRI

wt/wt wt/- -/-

Page 35: lezione tecniche 2006

SB - Delezione

EcoRI EcoRI

WTEcoRI

wt/wt wt/- -/-

EcoRI

-EcoRIEcoRI

Page 36: lezione tecniche 2006

SB - Duplicazioni

wt/wt wt/- -/-

EcoRI EcoRI

WTEcoRIEcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRIEcoRI

-EcoRIEcoRI EcoRI

Page 37: lezione tecniche 2006

SB - Inversioni

wt/wt wt/- -/-

EcoRI EcoRI

WTEcoRIEcoRI EcoRI

WTEcoRI EcoRI

-EcoRI

-EcoRIEcoRI

Page 38: lezione tecniche 2006

Southern Blot - Test

Test.

Pazi

en

te 1

Pazi

en

te 2

Pazi

en

te 3

Pazi

en

te 4

Pazi

en

te 5

Pazi

en

te 6

Pazi

en

te 7

Pazi

en

te 8

Pazi

en

te 9

Pazi

en

te 1

0

EcoRI EcoRI EcoRI

delezione

Page 39: lezione tecniche 2006

Southern Blot – tra specie diverse

Attuando lavaggi meno stringenti posso evidenziare sequenze simili tra specie diverse, ossia permettere un minor numero di legami tra sonda e sequenza omologa, e quindi evidenziare la presenza o meno di una sequenza simile.

ZOO-BLOT

Page 40: lezione tecniche 2006

ZOO - Blot

H.

Sap

ien

s

Dog

Cat

Mou

se

Rat

Pig

Catt

le

Goat

Sh

eep

Tu

rtle

Ch

iken

Page 41: lezione tecniche 2006

Northern Blot

Attuata sull’RNA

RNA non digerito

Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa

Tecnica utilizzata per individuare la lunghezza di un mRNA e per studiare l’espressione di un gene

nei diversi tessuti

Page 42: lezione tecniche 2006

Northern Blot

AAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

mRNA

M T

-

+

10 Kb

5 Kb

3 Kb

2 Kb

2.5 Kb

MigrazioneGel agarosio

TrsferimentoSu membrana

Fissazione

Page 43: lezione tecniche 2006

Northern Blot

ATGGCAGTAACG

Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

Page 44: lezione tecniche 2006

Northern Blot

3 Kb

3 Kb

AAAAAAAAAAATGGCAGTAACG

Page 45: lezione tecniche 2006

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

AAAAAA

Espres. Ubiquitaria

AAAAAA

Splicing Alternativo

Page 46: lezione tecniche 2006

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

AAAAAA

Espres. Specifica

Page 47: lezione tecniche 2006

Northern Blot

Testi

colo

Ovaio

Feg

ato

Milza

Pelle

Inte

sti

no

Cerv

ello

Su

rren

e

HeLa

Pla

cen

ta

Ren

e

Quantitativa

AAAAAA

Page 48: lezione tecniche 2006

Northern Blot

AAAAAA 10 d

pc

11 d

pc

12 d

pc

13 d

pc

14 d

pc

10 d

pc

11 d

pc

12 d

pc

13 d

pc

14 d

pc

HeLa

Testis Ovary

Quantitativa

Page 49: lezione tecniche 2006

Southern e Northern Blot

Tecniche di ibridazione di acidi nucleici

Tecniche cha forniscono una risposta quantitativa

Tecniche cha forniscono una risposta qualitativa

Page 50: lezione tecniche 2006

Southern e Northern Blot

Evidenziare e quantificare la presenza di una regione genomica

Evidenziare e quantificare la presenza di un trascritto di un gene in un dato tessuto

in un dato momento