TOTIPOTENZA

Caratteristica fondamentale delle cellule vegetali

È possibile rigenerare un’intera pianta da singole cellule

differenziate

Tranne quelle che hanno perso il nucleo (tracheidi, elementi del cribro)

Le cellule vegetali possono essere coltivate in vitro,cioè un ambiente asettico in cui le condizioni chimico-fisiche sono sotto controllo

� LUCE (composizione spettrale, fotoperiodo)

� TEMPERATURA

� COMPOSIZIONE CHIMICA DEL MEZZO (nutrienti minerali, carboidrati, vitamine, regolatori di crescita)

� DENSITA’ DELLA POPOLAZIONE CELLULARE(numero di cellule per unità di volume)

Cellule in coltura private della parete PROTOPLASTI possono propagarsi indefinitamente

protoplasti di cellule del protoplasti di cellule del mesofillo mantenute in coltura in presenza di mannitolo per evitare la lisi

Le colture cellulari possono essere impiegate:

• nella RICERCA DI BASE (studio della biologia cellulare)

• per SCOPI APPLICATIVI (produzione di metaboliti secondari)

In natura le condizioni ambientali variano nello spazio e nel tempo in modo non controllabile

RICERCA DI BASE

In vitro è possibile variare uno specifico fattore ambientale (mantenendo invariati gli altri) per studiare la sua influenza su particolari aspetti della biologia cellulare

studio del ruolo di un componente del terreno di coltura su una specifica via biosintetica

le colture cellulari possono essere utilizzate per lo studio di specifiche vie biosintetiche

RICERCA DI BASE

precursore 1

precursore 2

prodotto

il prodotto deriva dal precursore 1 o

dal 2?

precursore 1 marcato

prodotto non

marcato

ESPERIMENTO 1

precursore 2 marcato

prodotto marcato

ESPERIMENTO 2

IL PRODOTTO DERIVA DAL PRECURSORE 2

INTERESSE APPLICATIVO

le cellule in coltura possono essere utilizzate per produrre sostanze utili sostanze utili per l’industria farmaceutica, agroalimentare, cosmetica, ecc.

l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta generalmente la distruzione della pianta stessa

problema se:

� RARA (difficile da reperire, protetta)

� DI DIFFICILE COLTIVAZIONE� A CRESCITA LENTA (piante legnose)

Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono:

cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate (ghiandole, latticiferi, ecc.)

tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento)

organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo (radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)

In coltura possono essere mantenute anche strutture organizzate

meristemigermogli germogli radici

embrioninodi

antere

germoglio

radici

antere

Terreni di coltura per cellule e tessuti vegetali

• sali minerali

• fonte di carbonio

• vitamine

• regolatori di crescita• regolatori di crescita

• altri composti organici

Optimum di pH 5.0 – 6.0

MACROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione > 0.5 mM

Macroelementi essenziali: N, K, P, Ca, S, Mg, Cl

COMPOSIZIONE - SALI MINERALI

MICROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione< 0.5 mM

Microelementi essenziali: Fe, Mn, B, Cu, Zn, I, Mo, Co

composizione in sali minerali di alcuni terreni

Funzione dei sali minerali nella crescita in vitro

Elemento Funzione

N

K

Ca

Mg

P

Componente di proteine, acidi nucleici, alcuni coenzimi –richiesto in elevate quantità

Regola il potenziale osmotico – principale catione inorganico

Parete cellulare, funzione della membrana, signalling

Cofattore enzimatico, componente clorofilla

Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonioP

S

Cl

Fe

Mn

Co

Cu

Zn

Mo

Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonio

Componente di alcuni amminoacidi e di alcuni cofattori

Richiesto nella fotosintesi, movimenti stomatici

Componente dei citocromi (trasferimento energia)

Cofattore enzimatico

Componente di alcune vitamine

Reazioni di trasferimento elettronico, cofattore enzimatico

Biosintesi clorofilla, cofattore enzimatico

Componente della nitrato-reduttasi (metabolismo dell’azoto)

SORGENTE DI CARBONIO E VITAMINE

� Saccarosio o glucosio, concentrazione 2-5%

� indispensabile vitamina B1 (tiamina)

� crescita aumentata da acido nicotinico e vitamina B6 (piridossina)vitamina B6 (piridossina)

� alcuni terreni contengono: acido pantotenico, biotina, acido folico, acido p-amminobenzoico, colina, riboflavina e acido ascorbico

Dai tessuti in coltura è possibile rigenerare l’intera pianta

germogli caulogenesigermogli caulogenesi

radici rizogenesi

embrioni embriogenesi somatica

embrioidi o embrioni somatici

avventizi

caulogenesi

rizogenesi

embriogenesi somatica

MORFOGENESI DIRETTAda cellule differenziate di tessuto senza proliferazione di tessuto indifferenziato

MORFOGENESI INDIRETTA da cellule de-differenziate di callo (proliferazione di tessuto indifferenziato)

TessutoTessuto vegetalevegetalecheche sisi forma forma intornointorno ad ad unauna

feritaferitaintornointorno ad ad unauna

feritaferita

massa di tessuto amorfo formato da cellule che si moltiplicano in maniera disorganizzata

si può ottenere da espianti di tessuto

sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni o presenti nel mezzo, le cellule di un espianto di tessuto vanno incontro a de-differenziamento e formano un nuovo tessuto di cellule non specializzate

embriogenesi somatica diretta

sviluppo di embrioni somatici su espianto di

tessuto

embriogenesi somatica indiretta

sviluppo di embrioni somatici su callo

sviluppo di germogli su callo

morfogenesi indiretta

callo nodulare(embriogenico)

callo friabile

(non-morfogenico)

la capacità di formare un callo è diversa da specie a specie e da tessuto a tessuto (particolarmente nelle monocotiledoni)

canna da zucchero

la morfogenesi è stata osservata in numerosespecie, ma non può essere indotta universalmente,anche all’interno di una stessa specie alcunevarietà sono recalcitranti

cellule che hanno la capacità di dar luogo a morfogenesi sono dette COMPETENTI

la competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo:una cellula competente per lo sviluppo dell’embrione somatico non lo è anche per lo sviluppo del germoglio

Le cellule possono essere indotte a diventare competenti aggiungendo nel mezzo di coltura opportuni regolatori di crescita

pianta

Espianti fogliari

• Prelievo degli espianti

• Sterilizzazione

• Inoculo in mezzo callogenico

Espianti caulinari

Dal callo è possibile Dal callo è possibile ottenere cellule in ottenere cellule in sospensionesospensione

callo

callogenesi callogenesi

Inoculo in mezzo liquido

SOSPENSIONE CELLULARE

BIOREATTORE

COME SI RIGENERA UNA PIANTA?

ruolo fondamentale nel processo morfogenetico è svolto da ormoni vegetaliormoni vegetali

Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco

auxina e citochinine intervengono nella regolazione della divisione cellulare

WT transgeniche

ritardo nello sviluppo del germogliodovuto alla riduzione della velocità diproliferazione cellulare nel meristemaapicale

Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco

aumento della velocità di crescita della radice aumento della proliferazione nel meristema radicale

la carenza di auxina provoca l’arresto in fase G1la carenza di citochinine provoca l’arresto in fase G2

auxina e citochinine partecipano alla regolazione del ciclo cellulare controllando l’attività delle CHINASI CICLINA-DIPENDENTI

Cdc2inattiva

Cdc2attiva

Cdc25

auxina

citochinine Cdc25 tirosin-fosfatasi

Recentemente è stato dimostrato che le citochinine incrementano l’espressione del gene CYCD3 (negli animali le cicline di tipo D regolano il passaggio in fase G1)

In Arabidopsis CYCD3 è espresso in tessuti proliferativi come i meristemi dei germogli

Skoog e Miller(1957): alti livellidi citochinine ebassi libelli diauxina inducevanola formazione digermogli in callidi tabacco incoltura

concentrazione di IAA (mg/L)

0 0,005 0,03 0,18 1,08 3,0

0

0,2

coltura

concentrazione di chinetina (mg/L) 1,0

auxina auxina + citochinina

+ citochinine

Callo

Sviluppo del germoglio dal callo

questo processo è abbastanza semplice per le dicotiledoni sviluppo del germoglio

AUXINA CITOCHININA

alta bassa

formazione di radici su espianti

induzione callo nelle monocotiledoni

I stadio embriogenesi

formazione radici avventizie su callo

altabassa

su callo

induzione callo nelle dicotiledoni

formazione germogli avventizi

proliferazione di gemme ascellari in colture di germogli

IBA (acido 3-indolbutirrico)

IAAAUXINE

NAA (acido 1-naftalenacetico)

2,4 D (acido 2,4-diclorofenossiacetico)

CITOCHININE

Come si propagano le piante

Riproduzione Riproduzione Riproduzione sessuale

Riproduzione asessuale

PROPAGAZIONE VEGETATIVA

riproduzione asessuale

cactusopuntia bigelovii

kalanchoela progenie è costituitada “cloni” geneticamenteidentici alla piantamadre

stoloni

fragola

patate

Specie propagate vegetativamente

bananaalberi da frutto (mele, pere, agrumi)maniocapatatamaniocapatatafragolecacaocanna da zucchero

INNESTO

portainnesto

il portainnesto determina l’altezza dell’albero da frutto

selezionati per la resistenza a malattie

propagazione mediante TALEA

auxina per indurre la formazione delle radici

PROPAGAZIONE IN VITRO (MICROPROPAGAZIONE)

Permette di ottenere un elevato numero diPermette di ottenere un elevato numero dipiantine identiche sia genotipicamente chefenotipicamente alla pianta madre

Materiale di partenza per la

micropropagazionefoglia

gemma apicale

gemma

internodo

gemma ascellare

radici

moltiplicazione di germogli da gemme ascellari

formazione di germogli avventizi

formazione di embrioni somatici avventizi

micropropagazione

formazione di embrioni somatici avventizi

direttamente su espianti della pianta madre

indirettamenteda colture in sospensione o calli

la crescita e la proliferazione di gemme ascellari è indotta in seguito alla diminuzione di

dominanza apicale

rimozione dell’apice

aggiunta di citochinina nel terreno di coltura

impatiens

ciclamino

orchidea

pino

VANTAGGI della micropropagazione

spazi ristretti

condizioni asettiche: assenza di batteri, funghi e altri microorganismimetodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee)

specie che non si possono propagare altrimenti

metodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee)

produzione indipendentemente dalla stagione vegetativa

maggiore possibilità di variare i fattori che influenzano la crescita

acquisizione di nuove caratteristiche (es. stoloni fragole)

le piantine hanno bisogno di un periodo di adattamento per diventare autotrofe

cresciute in alta umidità sono più suscettibili alla perdita di acqua

SVANTAGGI della micropropagazione

suscettibili alla perdita di acqua

variazione somaclonale

epigenetica

ereditabile

transiente non si eredita

perdita della richiesta di ormoni e vitamine

Aberrazioni cromosomali

- alterazioni nel numero e nella struttura dei cromosomi

VARIAZIONE SOMACLONALE

- riarrangiamenti cromosomici

- differenze nel numero di copie di sequenze di DNA (amplificazione o diminuzione di sequenze ripetute)

- metilazione del DNA

camera climatica

Spesso la limitazione maggiore alla trasformazione delle piante non è la piante non è la metodica di trasferimento del DNA, quanto la rigenerazione della pianta

Quando si effettua una trasformazione, sia conAgrobacterium che con il sistema biolistico, vista labassa efficienza della rigenerazione, sarà necessarioutilizzare un numero elevato di espianti per esserecerti di ottenere piantine trasformate

I cloni trasformati ottenuti vengono poi MICROPROPAGATI

E’ possibile evitare la coltura dei tessuti e la rigenerazione della pianta?

Trasformazione “in planta”

non richiede coltura di tessuti e rigenerazione della pianta

Esclusivamente per Arabidopsis thaliana

- trasformazione di semi

- inoculazione DNA in pianta Agrobacterium- inoculazione DNA in pianta

- infiltrazione nel fiore(floral dip)

Agrobacterium

co-coltivazione dei semi con Agrobacterium

rimozione del germoglio apicale e infiltrazione con Agrobacterium del tessuto meristematico ferito5% dei nuovi germogli sono trasformati

immersione dei fiori nella sospensione batterica o infiltrazione sotto vuoto nel periodo della fecondazione

Floral dip

immersione delle infiorescenze nella sospensione batterica

Si produrranno semi transgenici da cui si otterranno le piante trasformate senza dover passare per la fase di rigenerazione e coltura in vitro dei tessuti

Le piante possono essere poi propagate da seme

Floral dip

seme

sistema per recuperare i semi daArabidopsis

i semi si raccolgono nel cono