Lettura Magistrale Lettura Magistrale ““ Marcello Marcello QuintilianiQuintiliani ””

Radiobiologia e Ricerca TraslazionaleRadiobiologia e Ricerca Traslazionale

Donatella Tirindelli DanesiDonatella Tirindelli DanesiDipartimento Biotecnologie Dipartimento Biotecnologie Sez. Scienze BiomedicheSez. Scienze Biomediche

ENEA ENEA -- RomaRoma

XIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIETXIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIET ÀÀ ITALIANAITALIANAPER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI (PER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI ( S.I.R.R.S.I.R.R.) )

TRIESTE, 24TRIESTE, 24--27 GIUGNO 200827 GIUGNO 2008

Primo Presidente Eletto e Presidente Onorario della

Società Italiana per le Ricerche sulle Radiazioni

Dose-effect curve for K+ retentivity and survival of E.coli B/r cells irradiated with X-rays in the presence of iodi ne

containing compounds

20 40 60 80

100

80

60

40

20

108

6

control

NaIIPAIAM

IAA

PE

RC

EN

T O

F K

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ET

EN

TIV

ITY

10 30 50 70

1

0.1

0.01

0.001

0.0001

0.00001

0.000001

SU

RV

IVA

L

DOSE (Krad)

Translational research

Ricerca traslazionale

• Strategie con le quali i risultati di laboratorio possono essere convertiti in ricadute pratiche per la salute umana

• Il successo della ricerca traslazionale richiede nuovi esperti, infrastrutture e incentivi

• Esperti in medicina, biologia, farmacologia, tossicologia, proprietà intellettuale, trasferimento tecnologico, sviluppo industriale, disegno di trials clinici

Two-way process

• Esperimenti su tessuti umani e trials clinici possono ispirare nuovi interrogativi da testare in laboratorio che potranno migliorare il disegno del trial clinico in una sua nuova formulazione

Translational Research: Getting the message across

Ricerca traslazionale in radioterapia

• Importanza crescente attribuita dalla comunità radioterapica alla ricerca biologica

• Radioterapia non più solo disciplina tecnologica

Ricerca traslazionale in radioterapia

• Radiobiologia molecolare

• Tecniche di irradiazione più sofisticate(3D conformal therapy, IMRT, IORT,Protontherapy,..)

Copyright ©2003 American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Technologies and resources available in functional genomics

Radiobiologia molecolare

• Riparo del DNA• Ipossia• Microambiente tumorale• Predittività della risposta del tumore

e dei tessuti normali• Targeting molecolare

DNA repair defects lead to increased cancer susceptibility and increased sensitivity to DNA-damaging agents

Novel targeted therapeutic approach

Normal cells have multiple DNA repairpathways but some are lost in cancer cells

DNA damage frequently occurs in all cells

Inhibiting DNA repair in cancer cells that have impaired repair pathways leads to selective cell killing and an increased therapeutic ratio

Why is DNA repair a good

target?

Targeting DNA Repair in Oncology: Rationale

Base excision

repair

Type of damage:

Bulky adducts

Insertionsand deletions

O6-alkylguanine

Repairpathway:

Nucleotide-excision

repair

Mismatch repair

Directreversal

Repairenzymes:

Double-strandbreaks

Single-strand breaks

PARP

Recombinationalrepair

ATM DNA-PK

HR NHEJ

XP, poly-

merasesMSH2,MLH1

AGT

Types of DNA Damage and Repair

PARP recruitmentPARP

DNA damage

PARP activation and assembly of repair factors

NAD+

poly(ADP-ribose)PARP

PAR degradation via PARG

PARGPARP

End processing,gap filling, and ligation

PNK 1pol β

XRCC1 LigIII

pol β

XRCC1 LigIII

PNK 1

PARP and Base Excision Repair

Targeted Killing of Cancer Cells With Defective DNA-Repair Mechanisms

Survival

Normal cell

Repair by HR pathway

Exploits inherent weakness of cancer cells that hav e defective DNA repair

Double-stranded break

BRCA deficient ordeficiency of other

HR proteins

No repair(No HR pathway)

Cell death

Cancer cell with defective repair

DNA Repair Inhibitors in Cancer Cells: 2 Modes of Action

• Potentiation– Inhibition of DNA repair following DNA-damaging agents– Original hypothesis

• Synthetic lethality– Selected cancer cells lose DNA repair pathways, whereas

normal cells remain unaffected– Targeting these defective cells may cause selective cell kill with

an increased therapeutic ratio– May allow for a novel targeted approach to cancer treatment

DNA DAMAGE RESPONSE PATHWAY

Meccanismi di riparo delle DSBs

Ku DNA-binding activity in nuclear extracts of

RT112 and SW48 cell lines

Negroni, et al, 2008

Inhibition of Ku80 expression in RT112 by microRNA

Negroni, et al, 2008

Ku 80 interference causes a decrease of proliferation an d viability of RT112 after X-ray exposure

Negroni, et al, 2008

EGFR-PI3K-AKT pathwayH. PETER RODEMANN, 2007

Radiation-induced nuclear translocation of EGFR

Inclusione di bioterapie molecolari in radioterapia

EGFRoverespressione associata a diminuito

controllo tumorale dopo RT

target in radioterapia

Trasduzione del segnale mediata da EGFR

M. Baumann 2004

Inibizione di EGFR e RTSCC umano in topo nudo

M. Baumann 2004

Inibizione ripopolamento e riossigenazione

• C225 MoAb anti-EGFR• Miglioramento del controllo locale durante

un irraggiamento frazionato di tumori FaDu (human hypopharyngeal squamouscell carcinoma line)

Volume tumorale mediano

M. Krause 2005

Espressione di EGFR in regioni ipossiche

M. Krause 2005

RT e CETUXIMAB SCC testa-collo

• RT sola 213 paz• RT + cetuximab 211 paz

F.U. mediano 54 mesi

LRC (mesi) OS (mesi)• RT 14.9 29.3

• RT + cetuximab 24.4 49.0

p =.005 p = .03

Bonner JA, NEJM 2006

RT+ cetuximab vs RT+ chemotherapy

• LRC, DMFS and DSS differenze non statisticamente significative

• 29 paz vs 103• Studio retrospettivo

• Necessità di identificare marker predittivi di radioresistenza o radiosensibilità alle terapie a target molecolare

Caudell JJ, 2008

Insorgenza di resistenza a EGFR inibitori

• I tumori diventano resistenti per la maggior parte entro un anno dall’inizio del trattamento

• Acquisizione di mutazioni secondarie che rendono inefficace il farmaco:� seconda mutazione in EGFR�amplificazione di MET

E’ necessario sequenziare geni da tumori multipli perevidenziare le loro idiosincrasie genetiche

Directly Targeting the Cancer Cell: Disadvantages

1. Sjoblom T, et al. Science. 2006;314:268-274.

� Major heterogeneity across and between histologies[1]

� Biologically/genetically unstable target

� Acquired genetic instability

– Increases with progression/stage/pretreatment

– Limits efficacy of treatment

� Homeostatic response/selection of resistant clones (acquired and de novo resistance)

Targeting theMicroenvironment

� Genetically stable substrate

– Less amenable to mutation/acquired resistance

� Common final pathways possible

– Less heterogeneity of target

– Relatively predictable response of tissues to cancer

– Addresses poorly understood and most lethal hallmark of malignancy: metastasis

� Plethora of potential novel targets

Interazioni Stroma-Epitelio nellecellule tumorali

Possiamo effettivamente manipolarequeste interazioni a fini terapeutici?

Terapie antiangiogeniche

Terapie con anticorpi anti-CTLA4

Strategie Microenvironment-Targeted

• Vantaggi teorici e pratici rispetto al targeting diretto delle cellule tumorali

• Multiple nuove opportunità di inibire la formazione di metastasi

La rivoluzione genomica e la radioterapia

• Mutazioni del DNA in un gene o in pochi geni non sono responsabili della differente radiosensibilità degli individui

• La radiosensibilità è oggi considerata come un fenotipo ereditario e un tratto genetico complesso dipendente dall’interazione di molti geni o loro prodotti

Espressione genica dopo RT

10 ca cervice radioresistenti vs9 ca cervice radiosensibili

Microarray analisi di 23040 cDNA20 geni up-regolati nei radioresistenti (XRCC5,Ku80)

120 geni up-regolati nei radiosensibili (MAP3K2)62 geni in grado di predire la classe appropriata

Bassi livelli di Ku80 correlati con radiosensibilit à in 89ca cervice

Kitahara, 2002; Harima, 2003

cDNA array technology

Mutanti radiosensibili o varianti di linee cellulari

isolamento dei geni coinvolti nella risposta alle radiazioni

espressione genica differenziale:può riflettere differenze in

radiosensibilità

Carcinoma della vescicacDNA array technology

MGH-U1 radioresistente SF2 0.87S40b clone radiosensibile SF2 0.64

Kassem, Int J Cancer, 2002

Carcinoma della vescicacDNA array technology

Espressione di geni correlati allo stress e al riparo del DNA

differenza: 20/234 (12%) geniHSP27 e NNMT down in S40b

CDKN1A down after 2 Gy

Kassem, Int J Cancer, 2002

Radiosensibilità tessuti normali

• 80-90% differenze genetiche individuali

• 10-20% eventi stocastici (uccisione cellulare random, variazioni randomnella dosimetria e somministrazione della dose)

Test predittivi

• Skin fibroblast SF2 assays• Lymphocyte assays• Chromosomal aberrations and micronuclei

Molecular approaches:� gene expression profiling� cytokine responses� DNA end-binding complexes

Polimorfismi a singolonucleotide (SNPs)

……..G G T A A C T T G …... ……..G G C A A C T T G …...

”un gene è polimorfico se ha varianti alleliche stabi liall’interno di una popolazione con una frequenza > 1% e una o più di queste varianti presentanodifferenze nell’attività della proteina rispetto alla suarelativa forma wild-type”

Varianti ogni 200-300 basi lungo i 3 bilioni di basi del genoma umano

Geni candidati di radiosensibilità

• Riconoscimento e riparo del danno al DNA (es. TP53, XRCC1, XRCC3, LIG4, APEX)

• Controllo checkpoint ciclo cellulare(es. CDKN1A)

• Risposta allo stress ossidativo (es. SOD2)• Induzione di apoptosi (es. BCL2)• Risposta delle citochine (es.TGFβ1)

Studi internazionali di genotipizzazione

GENE-PARE Genetic Predictors of Adverse Radiotherapy EffectsUSA, Israele, Francia, Svizzera 2000 RT paz (mammella, prostata, testa-collo)

GENEPI GENEtic pathways for the Prediction of the effects of i rradiationEuropa - ESTRO3000-4000 RT paz (mammella, prostata, testa-collo, r etto)

RAPPER Radiogenomics Assessment of Polymorphisms for Predictin gthe Effects of RT - UK2200 RT paz (mammella, prostata, t.ginecologici)RACE ( RT complications and epidemiology)

RadGenomics JapaneseRadGenomic study1071 RT paz (mammella, cervice, prostata, testa-coll o)

ATM in GENE-PARE

�46 paz ca mammella• 3/3 G 3-4 reazione sottocutanea avevano

varianti ATM missense vs 3/43 G 1-2• 5557G-A variante in ATM:

ED50 52Gy vs 61 Gy�Paz ca prostata• 10/16 con risposta avversa avevano

varianti ATM missense vs 3/21senza variazioni nella sequenza ATM

RadGenomics

In 284 pazienti con ca mammario sono stati identificati 25 SNPs marker per reazione cutanea acuta e 22 per effetti a 3-6 mesi

Polimorfismi e risposta tumorale

• 210 paz con ca esofageo

• Varianti XRCC1 nel DNA estratto dal tessuto tumorale associate a risposta patologica incompleta

Wu X et al, 2006

Genetica di popolazioni HapMap

• Una mappa di aplotipi del genoma umano descrive i pattern comuni delle variazioni di sequenza del DNA umano in 269 campioni di 4 popolazioni

• HapMap potrebbe essere una risorsa chiave per identificare geni correlati a malattie e risposta alle terapie

Nature, 2005

High-throughput whole genomeSNP arrays

E’ stato stimato che sono necessari più di 30.000 pazienti per ottenere il potere statistico necessario a identificare correlazioni significative con la radiosensibilità clinica

SINERGIA FRA RADIAZIONI IONIZZANTI E FARMACI

Tipo di farmaco

Farmaco e dosi di RT e modalità di somministrazione

Sequenza dei trattamenti

Meccanismi di interazione:

- a livello molecolare(nuove lesioni o inibizione del riparo)

- a livello cellulare(cooperazione citocinetica,

sincronizzazione nella fase G2/M)- a livello tessutale

(riossigenazione, incremento uptakefarmaco, inibizione di ripopolamento o angiogenesi, ridistribuzione nel ciclo,..)

Oltre 20 agenti attivi impiegati con la RT

5-Fluorouracile (5-FU)Platinum (cDDP, 1-OHP)

Antracicline (ADR, EpiDX)Tassani (Paclitaxel, Docetaxel)

Gemcitabina (GEM)Camptotecina (CPT-11, RFS-2000)

Facilitazione del danno iniziale da radiazioni

- incorporazione del farmaco nel DNA(5-FU)

- formazione di intra e interstrandcross-links(cisplatino)

5-FLUOROURACILE

- deve essere presente dopo ogni esposizione ai raggi X

- la durata dell’esposizione deve essere lunga almeno quanto un

intero ciclo cellulare

5-FLUOROURACILE

A causa della breve emivita del 5-FU nell’uomo (10-15 min), questi prerequisiti possono essere

soddisfatti solo con l’infusione continua del farmaco concomitante

alle radiazioni

Cisplatino

Radiofacilitazione chimica:

formazione intracellulare di radicali liberi reattivi o alterazione dell’attività di legame dei

complessi delplatino al DNA durante l’irraggiamento radiation (sia nelle cellule

ipossiche che ossigenate)

alte dosi prima delle radiazioni

Cisplatino

Radiofacilitazione biochimica :

più importante meccanismo nel trattamento di pazienti neoplastici

aumentata tossicità indotta dalle radiazioni per l’inibizione dei meccanismi cellulari coinvolti

nella riparazione del danno

concomitante alla RT

Schema di trattamentoSchema di trattamento

Radioterapia Radioterapia iperfrazionataiperfrazionata ::100 cGy X 3/day

or 150 cGy X 2/day

PVI:PVI:CDDP: 5 mg/m 2/day

+5-FU: 200 mg/m 2/day

DOSE / TARGET:DOSE / TARGET:50-51 Gy pelvi

+19.5-20 Gy vescica

Risposta al trattamentoRisposta al trattamento

MCV + :MCV + :CR: 84.2%CR: 84.2%PR: 15.8%PR: 15.8%

MCV MCV -- ::CR: 96.4%CR: 96.4%PR: 3.6%PR: 3.6%

TotalTotalCR: 89.4%CR: 89.4%PR: 10.6%PR: 10.6%

Months706050403020100

Cum

ulat

ive

prop

orti

onsu

rviv

ing

1.0

.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

.1

0.0

FIVE-YEAR CYSTECTOMY FREE SURVIVAL

Tirindelli Danesi, et al, 2004

Months

706050403020100

1.0

.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

.1

0.0

Cum

ulat

ive

prop

orti

onsu

rviv

ing

FIVE-YEAR DISEASE FREE SURVIVAL

Tirindelli Danesi, et al, 2004

Months

120100806040200

1.0

.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

.10.0

75.0

58.5

46.6

73.1

54.9

38.6

Cum

ulat

ive

prop

orti

onsu

rviv

ing

Disease specific survivalOverall survivalBladder intact survival

DISEASE SPECIFIC, OVERALL AND BLADDER INTACT SURVIVAL

Tirindelli Danesi, et al, 2004

GEMCITABINA

inibisce la sintesi del DNA induce arresto in fase S

abbassa la soglia per l’apoptosi indotta da radiazioni

riduce il riparo del DNA

DER in vitro 1.1 – 3.0

Citotossicità tessuto-dipendente in vivo

GEM

I tessuti normali recuperano più rapidamente di quelli tumorali

Milas, Cancer Res 1999

Citotossicità in funzione della dose di farmaco, frazionamento e

timing

Basse dosi per frazione concomitanti alla RT sono più

efficaciPiù elevato DER con regimi settimanali o bisettimanali

24 h prima della RT

Giorni di trattamento

Protocolli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 G G G G

2 RX RX RX RX RX RX RX RX RX RX

3 RX RX RX RX

4 G RX RX G + RX RX RX G + RX RX RX G + RX RX

5 G RX G RX G RX G RX

G = Gemcitabina

RX = raggi X

1501005000

10

20

30

Gem + RX (2 Gy x 10)Gem

Dosi Gemcitabina (mg/kg/frazione)

TG

T4

(gio

rni)

504030201000

10

20

30

40

50

RX 10 frazioni RX 4 frazioniGem + RX 10 frazioniGem + RX 4 frazioni

Dose raggi X (Gy)

TG

T4

(gi

orni

)

Gli studi su modelli animali possono fornire informazioni significative sulle modalità di

trattamenti combinati, in particolare per definire la tossicità

sui tessuti normali e la dose iniziale di farmaco nei protocolli

clinici di fase I

Ricerca traslazionale

• Colpire più vie di segnale• Cooperazione biologica• Cooperazione cinetica• Protezione tessuti normali• Nuova impostazione trial clinici fase I

(end-points aggiuntivi associati con il meccanismo molecolare dell’interazione)