Lettura Magistrale “Marcello Quintiliani ” Radiobiologia e …sirr.casaccia.enea.it/Congressi...
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Lettura Magistrale Lettura Magistrale ““ Marcello Marcello QuintilianiQuintiliani ””
Radiobiologia e Ricerca TraslazionaleRadiobiologia e Ricerca Traslazionale
Donatella Tirindelli DanesiDonatella Tirindelli DanesiDipartimento Biotecnologie Dipartimento Biotecnologie Sez. Scienze BiomedicheSez. Scienze Biomediche
ENEA ENEA -- RomaRoma
XIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIETXIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIET ÀÀ ITALIANAITALIANAPER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI (PER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI ( S.I.R.R.S.I.R.R.) )
TRIESTE, 24TRIESTE, 24--27 GIUGNO 200827 GIUGNO 2008
Primo Presidente Eletto e Presidente Onorario della
Società Italiana per le Ricerche sulle Radiazioni
Dose-effect curve for K+ retentivity and survival of E.coli B/r cells irradiated with X-rays in the presence of iodi ne
containing compounds
20 40 60 80
100
80
60
40
20
108
6
control
NaIIPAIAM
IAA
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10 30 50 70
1
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0.00001
0.000001
SU
RV
IVA
L
DOSE (Krad)
Translational research
Ricerca traslazionale
• Strategie con le quali i risultati di laboratorio possono essere convertiti in ricadute pratiche per la salute umana
• Il successo della ricerca traslazionale richiede nuovi esperti, infrastrutture e incentivi
• Esperti in medicina, biologia, farmacologia, tossicologia, proprietà intellettuale, trasferimento tecnologico, sviluppo industriale, disegno di trials clinici
Two-way process
• Esperimenti su tessuti umani e trials clinici possono ispirare nuovi interrogativi da testare in laboratorio che potranno migliorare il disegno del trial clinico in una sua nuova formulazione
Translational Research: Getting the message across
Ricerca traslazionale in radioterapia
• Importanza crescente attribuita dalla comunità radioterapica alla ricerca biologica
• Radioterapia non più solo disciplina tecnologica
Ricerca traslazionale in radioterapia
• Radiobiologia molecolare
• Tecniche di irradiazione più sofisticate(3D conformal therapy, IMRT, IORT,Protontherapy,..)
Copyright ©2003 American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Technologies and resources available in functional genomics
Radiobiologia molecolare
• Riparo del DNA• Ipossia• Microambiente tumorale• Predittività della risposta del tumore
e dei tessuti normali• Targeting molecolare
DNA repair defects lead to increased cancer susceptibility and increased sensitivity to DNA-damaging agents
Novel targeted therapeutic approach
Normal cells have multiple DNA repairpathways but some are lost in cancer cells
DNA damage frequently occurs in all cells
Inhibiting DNA repair in cancer cells that have impaired repair pathways leads to selective cell killing and an increased therapeutic ratio
Why is DNA repair a good
target?
Targeting DNA Repair in Oncology: Rationale
Base excision
repair
Type of damage:
Bulky adducts
Insertionsand deletions
O6-alkylguanine
Repairpathway:
Nucleotide-excision
repair
Mismatch repair
Directreversal
Repairenzymes:
Double-strandbreaks
Single-strand breaks
PARP
Recombinationalrepair
ATM DNA-PK
HR NHEJ
XP, poly-
merasesMSH2,MLH1
AGT
Types of DNA Damage and Repair
PARP recruitmentPARP
DNA damage
PARP activation and assembly of repair factors
NAD+
poly(ADP-ribose)PARP
PAR degradation via PARG
PARGPARP
End processing,gap filling, and ligation
PNK 1pol β
XRCC1 LigIII
pol β
XRCC1 LigIII
PNK 1
PARP and Base Excision Repair
Targeted Killing of Cancer Cells With Defective DNA-Repair Mechanisms
Survival
Normal cell
Repair by HR pathway
Exploits inherent weakness of cancer cells that hav e defective DNA repair
Double-stranded break
BRCA deficient ordeficiency of other
HR proteins
No repair(No HR pathway)
Cell death
Cancer cell with defective repair
DNA Repair Inhibitors in Cancer Cells: 2 Modes of Action
• Potentiation– Inhibition of DNA repair following DNA-damaging agents– Original hypothesis
• Synthetic lethality– Selected cancer cells lose DNA repair pathways, whereas
normal cells remain unaffected– Targeting these defective cells may cause selective cell kill with
an increased therapeutic ratio– May allow for a novel targeted approach to cancer treatment
DNA DAMAGE RESPONSE PATHWAY
Meccanismi di riparo delle DSBs
Ku DNA-binding activity in nuclear extracts of
RT112 and SW48 cell lines
Negroni, et al, 2008
Inhibition of Ku80 expression in RT112 by microRNA
Negroni, et al, 2008
Ku 80 interference causes a decrease of proliferation an d viability of RT112 after X-ray exposure
Negroni, et al, 2008
EGFR-PI3K-AKT pathwayH. PETER RODEMANN, 2007
Radiation-induced nuclear translocation of EGFR
Inclusione di bioterapie molecolari in radioterapia
EGFRoverespressione associata a diminuito
controllo tumorale dopo RT
target in radioterapia
Trasduzione del segnale mediata da EGFR
M. Baumann 2004
Inibizione di EGFR e RTSCC umano in topo nudo
M. Baumann 2004
Inibizione ripopolamento e riossigenazione
• C225 MoAb anti-EGFR• Miglioramento del controllo locale durante
un irraggiamento frazionato di tumori FaDu (human hypopharyngeal squamouscell carcinoma line)
Volume tumorale mediano
M. Krause 2005
Espressione di EGFR in regioni ipossiche
M. Krause 2005
RT e CETUXIMAB SCC testa-collo
• RT sola 213 paz• RT + cetuximab 211 paz
F.U. mediano 54 mesi
LRC (mesi) OS (mesi)• RT 14.9 29.3
• RT + cetuximab 24.4 49.0
p =.005 p = .03
Bonner JA, NEJM 2006
RT+ cetuximab vs RT+ chemotherapy
• LRC, DMFS and DSS differenze non statisticamente significative
• 29 paz vs 103• Studio retrospettivo
• Necessità di identificare marker predittivi di radioresistenza o radiosensibilità alle terapie a target molecolare
Caudell JJ, 2008
Insorgenza di resistenza a EGFR inibitori
• I tumori diventano resistenti per la maggior parte entro un anno dall’inizio del trattamento
• Acquisizione di mutazioni secondarie che rendono inefficace il farmaco:� seconda mutazione in EGFR�amplificazione di MET
E’ necessario sequenziare geni da tumori multipli perevidenziare le loro idiosincrasie genetiche
Directly Targeting the Cancer Cell: Disadvantages
1. Sjoblom T, et al. Science. 2006;314:268-274.
� Major heterogeneity across and between histologies[1]
� Biologically/genetically unstable target
� Acquired genetic instability
– Increases with progression/stage/pretreatment
– Limits efficacy of treatment
� Homeostatic response/selection of resistant clones (acquired and de novo resistance)
Targeting theMicroenvironment
� Genetically stable substrate
– Less amenable to mutation/acquired resistance
� Common final pathways possible
– Less heterogeneity of target
– Relatively predictable response of tissues to cancer
– Addresses poorly understood and most lethal hallmark of malignancy: metastasis
� Plethora of potential novel targets
Interazioni Stroma-Epitelio nellecellule tumorali
Possiamo effettivamente manipolarequeste interazioni a fini terapeutici?
Terapie antiangiogeniche
Terapie con anticorpi anti-CTLA4
Strategie Microenvironment-Targeted
• Vantaggi teorici e pratici rispetto al targeting diretto delle cellule tumorali
• Multiple nuove opportunità di inibire la formazione di metastasi
La rivoluzione genomica e la radioterapia
• Mutazioni del DNA in un gene o in pochi geni non sono responsabili della differente radiosensibilità degli individui
• La radiosensibilità è oggi considerata come un fenotipo ereditario e un tratto genetico complesso dipendente dall’interazione di molti geni o loro prodotti
Espressione genica dopo RT
10 ca cervice radioresistenti vs9 ca cervice radiosensibili
Microarray analisi di 23040 cDNA20 geni up-regolati nei radioresistenti (XRCC5,Ku80)
120 geni up-regolati nei radiosensibili (MAP3K2)62 geni in grado di predire la classe appropriata
Bassi livelli di Ku80 correlati con radiosensibilit à in 89ca cervice
Kitahara, 2002; Harima, 2003
cDNA array technology
Mutanti radiosensibili o varianti di linee cellulari
isolamento dei geni coinvolti nella risposta alle radiazioni
espressione genica differenziale:può riflettere differenze in
radiosensibilità
Carcinoma della vescicacDNA array technology
MGH-U1 radioresistente SF2 0.87S40b clone radiosensibile SF2 0.64
Kassem, Int J Cancer, 2002
Carcinoma della vescicacDNA array technology
Espressione di geni correlati allo stress e al riparo del DNA
differenza: 20/234 (12%) geniHSP27 e NNMT down in S40b
CDKN1A down after 2 Gy
Kassem, Int J Cancer, 2002
Radiosensibilità tessuti normali
• 80-90% differenze genetiche individuali
• 10-20% eventi stocastici (uccisione cellulare random, variazioni randomnella dosimetria e somministrazione della dose)
Test predittivi
• Skin fibroblast SF2 assays• Lymphocyte assays• Chromosomal aberrations and micronuclei
Molecular approaches:� gene expression profiling� cytokine responses� DNA end-binding complexes
Polimorfismi a singolonucleotide (SNPs)
……..G G T A A C T T G …... ……..G G C A A C T T G …...
”un gene è polimorfico se ha varianti alleliche stabi liall’interno di una popolazione con una frequenza > 1% e una o più di queste varianti presentanodifferenze nell’attività della proteina rispetto alla suarelativa forma wild-type”
Varianti ogni 200-300 basi lungo i 3 bilioni di basi del genoma umano
Geni candidati di radiosensibilità
• Riconoscimento e riparo del danno al DNA (es. TP53, XRCC1, XRCC3, LIG4, APEX)
• Controllo checkpoint ciclo cellulare(es. CDKN1A)
• Risposta allo stress ossidativo (es. SOD2)• Induzione di apoptosi (es. BCL2)• Risposta delle citochine (es.TGFβ1)
Studi internazionali di genotipizzazione
GENE-PARE Genetic Predictors of Adverse Radiotherapy EffectsUSA, Israele, Francia, Svizzera 2000 RT paz (mammella, prostata, testa-collo)
GENEPI GENEtic pathways for the Prediction of the effects of i rradiationEuropa - ESTRO3000-4000 RT paz (mammella, prostata, testa-collo, r etto)
RAPPER Radiogenomics Assessment of Polymorphisms for Predictin gthe Effects of RT - UK2200 RT paz (mammella, prostata, t.ginecologici)RACE ( RT complications and epidemiology)
RadGenomics JapaneseRadGenomic study1071 RT paz (mammella, cervice, prostata, testa-coll o)
ATM in GENE-PARE
�46 paz ca mammella• 3/3 G 3-4 reazione sottocutanea avevano
varianti ATM missense vs 3/43 G 1-2• 5557G-A variante in ATM:
ED50 52Gy vs 61 Gy�Paz ca prostata• 10/16 con risposta avversa avevano
varianti ATM missense vs 3/21senza variazioni nella sequenza ATM
RadGenomics
In 284 pazienti con ca mammario sono stati identificati 25 SNPs marker per reazione cutanea acuta e 22 per effetti a 3-6 mesi
Polimorfismi e risposta tumorale
• 210 paz con ca esofageo
• Varianti XRCC1 nel DNA estratto dal tessuto tumorale associate a risposta patologica incompleta
Wu X et al, 2006
Genetica di popolazioni HapMap
• Una mappa di aplotipi del genoma umano descrive i pattern comuni delle variazioni di sequenza del DNA umano in 269 campioni di 4 popolazioni
• HapMap potrebbe essere una risorsa chiave per identificare geni correlati a malattie e risposta alle terapie
Nature, 2005
High-throughput whole genomeSNP arrays
E’ stato stimato che sono necessari più di 30.000 pazienti per ottenere il potere statistico necessario a identificare correlazioni significative con la radiosensibilità clinica
SINERGIA FRA RADIAZIONI IONIZZANTI E FARMACI
Tipo di farmaco
Farmaco e dosi di RT e modalità di somministrazione
Sequenza dei trattamenti
Meccanismi di interazione:
- a livello molecolare(nuove lesioni o inibizione del riparo)
- a livello cellulare(cooperazione citocinetica,
sincronizzazione nella fase G2/M)- a livello tessutale
(riossigenazione, incremento uptakefarmaco, inibizione di ripopolamento o angiogenesi, ridistribuzione nel ciclo,..)
Oltre 20 agenti attivi impiegati con la RT
5-Fluorouracile (5-FU)Platinum (cDDP, 1-OHP)
Antracicline (ADR, EpiDX)Tassani (Paclitaxel, Docetaxel)
Gemcitabina (GEM)Camptotecina (CPT-11, RFS-2000)
Facilitazione del danno iniziale da radiazioni
- incorporazione del farmaco nel DNA(5-FU)
- formazione di intra e interstrandcross-links(cisplatino)
5-FLUOROURACILE
- deve essere presente dopo ogni esposizione ai raggi X
- la durata dell’esposizione deve essere lunga almeno quanto un
intero ciclo cellulare
5-FLUOROURACILE
A causa della breve emivita del 5-FU nell’uomo (10-15 min), questi prerequisiti possono essere
soddisfatti solo con l’infusione continua del farmaco concomitante
alle radiazioni
Cisplatino
Radiofacilitazione chimica:
formazione intracellulare di radicali liberi reattivi o alterazione dell’attività di legame dei
complessi delplatino al DNA durante l’irraggiamento radiation (sia nelle cellule
ipossiche che ossigenate)
alte dosi prima delle radiazioni
Cisplatino
Radiofacilitazione biochimica :
più importante meccanismo nel trattamento di pazienti neoplastici
aumentata tossicità indotta dalle radiazioni per l’inibizione dei meccanismi cellulari coinvolti
nella riparazione del danno
concomitante alla RT
Schema di trattamentoSchema di trattamento
Radioterapia Radioterapia iperfrazionataiperfrazionata ::100 cGy X 3/day
or 150 cGy X 2/day
PVI:PVI:CDDP: 5 mg/m 2/day
+5-FU: 200 mg/m 2/day
DOSE / TARGET:DOSE / TARGET:50-51 Gy pelvi
+19.5-20 Gy vescica
Risposta al trattamentoRisposta al trattamento
MCV + :MCV + :CR: 84.2%CR: 84.2%PR: 15.8%PR: 15.8%
MCV MCV -- ::CR: 96.4%CR: 96.4%PR: 3.6%PR: 3.6%
TotalTotalCR: 89.4%CR: 89.4%PR: 10.6%PR: 10.6%
Months706050403020100
Cum
ulat
ive
prop
orti
onsu
rviv
ing
1.0
.9
.8
.7
.6
.5
.4
.3
.2
.1
0.0
FIVE-YEAR CYSTECTOMY FREE SURVIVAL
Tirindelli Danesi, et al, 2004
Months
706050403020100
1.0
.9
.8
.7
.6
.5
.4
.3
.2
.1
0.0
Cum
ulat
ive
prop
orti
onsu
rviv
ing
FIVE-YEAR DISEASE FREE SURVIVAL
Tirindelli Danesi, et al, 2004
Months
120100806040200
1.0
.9
.8
.7
.6
.5
.4
.3
.2
.10.0
75.0
58.5
46.6
73.1
54.9
38.6
Cum
ulat
ive
prop
orti
onsu
rviv
ing
Disease specific survivalOverall survivalBladder intact survival
DISEASE SPECIFIC, OVERALL AND BLADDER INTACT SURVIVAL
Tirindelli Danesi, et al, 2004
GEMCITABINA
inibisce la sintesi del DNA induce arresto in fase S
abbassa la soglia per l’apoptosi indotta da radiazioni
riduce il riparo del DNA
DER in vitro 1.1 – 3.0
Citotossicità tessuto-dipendente in vivo
GEM
I tessuti normali recuperano più rapidamente di quelli tumorali
Milas, Cancer Res 1999
Citotossicità in funzione della dose di farmaco, frazionamento e
timing
Basse dosi per frazione concomitanti alla RT sono più
efficaciPiù elevato DER con regimi settimanali o bisettimanali
24 h prima della RT
Giorni di trattamento
Protocolli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 G G G G
2 RX RX RX RX RX RX RX RX RX RX
3 RX RX RX RX
4 G RX RX G + RX RX RX G + RX RX RX G + RX RX
5 G RX G RX G RX G RX
G = Gemcitabina
RX = raggi X
1501005000
10
20
30
Gem + RX (2 Gy x 10)Gem
Dosi Gemcitabina (mg/kg/frazione)
TG
T4
(gio
rni)
504030201000
10
20
30
40
50
RX 10 frazioni RX 4 frazioniGem + RX 10 frazioniGem + RX 4 frazioni
Dose raggi X (Gy)
TG
T4
(gi
orni
)
Gli studi su modelli animali possono fornire informazioni significative sulle modalità di
trattamenti combinati, in particolare per definire la tossicità
sui tessuti normali e la dose iniziale di farmaco nei protocolli
clinici di fase I
Ricerca traslazionale
• Colpire più vie di segnale• Cooperazione biologica• Cooperazione cinetica• Protezione tessuti normali• Nuova impostazione trial clinici fase I
(end-points aggiuntivi associati con il meccanismo molecolare dell’interazione)