La cardiologia preventiva nella pratica clinica

Le basi: genetica

ANMCO - Corso Intramurale

Firenze 22-24 ottobre, 2001

Eloisa Arbustini, IRCCS San Matteo, Pavia

Le malattie cardiovascolari rappresentano la più importante causa di morbidità e mortalità

• Cardiopatia ischemica: acuta e cronica

• Scompenso

• Aritmie

• Ipertensione

• Stroke

• Vasculopatie periferiche

1950-53

1960-62

1993

years males females

63.6

67.2

74.1

67.2

72.3

80.5

ISTAT Italian populationlife expectancy at birth

La genetica classica: si rivolge alla trasmissione dei tratti/caratteri:

anamnesi familiaremisura di parametri biochimici

Per cardiopatia ischemica

Per vasculopatia aterosclerotica

Per fattori di rischio:

Colesterolemia, glicemia, ipertensione, omociteinemia, ipercoagulabilità

Familiarità evidence-based

• Deve essere documentata: – Da report ancora disponibili– Da diagnosi ottenute in ambiente ospedaliero– Da referti autoptici

Se non è documentata o attendibile è opportuno segnalarne l’incertezza

Familiarità Evidence-based• Nonni: dati sulle cause di decesso devono essere

documentati

• Genitori:– Contestualizzare il periodo degli eventi riferiti, la

sede in cui sono stati osservati o si sono verificati, chi e come li ha diagnosticati

• Fratelli/sorelle:– Molto più attendibile rispetto a quella dei genitori,

anche se solo riferita

Costruire l’albero geneaologico: tradurre graficamente la storia della

famiglia• E’ graficamente utile

• E’ appropriata una rappresentazione grafica di malattie multifattoriali in modo analogo a quello delle malattie monogeniche?

• Non esitono malattie multifattoriali definibili autosomiche dominanti o recessive o legate all’X, o matrilineari come le malattie monogeniche

Costruire l’albero genealogico

• Esistono malattie metaboliche monogeniche che correttamente possono essere rappresentate con alberi classici:

• FH

• Alcune forme di diabete

• Ipertensione arteriosa in sindromi precise

L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici

Coppie di fratelli

?

?

Paziente deceduto in ospedale con diagnosi accertata di infartoall’età di 51 anni

Deceduto a domicilio improvvisamente

a 62 anni

Paziente di 49 anniChe si presenta con Angina instabile

L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici

?

?

Paziente deceduto in ospedale con diagnosi accertata di infartoall’età di 51 anni

Deceduto a domicilio improvvisamente

a 62 anni

Paziente di 49 anniChe si presenta con Angina instabile

Ipertensione

NIDDM

Ipertensione

Fumo

?

?

“morto di cuore”Abbastanza giovane

Morto di ca polmonareMa soffriva di cuore Aveva il

colesterolo

Hanno il colesterolo

I cugini vivono in un’altra cittàNon ci vediamo da tempo

L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici

IMA

SCC POST-ISCHEMICO

30aa SD 26aa,Rottura di cuore

38aa, ictus

Fenotipo del nonno: alto,magro, con le mani lunghe, aveva tutti i vasi chiusi

Dissecazione Ao a 59 aaIpercolesterolemia a 61 aa

59aa 55aa

cancro

IMA a 56 aa

Iperomocisteinemia con mut. MTHFR

IMA; 48aa

SD; 53aaIMA; 48aa

La familiarità può essere derivata da entrambi i genitori

Genetica molecolare

• Geni

• Analisi

• Sequenza

• Varianti alleliche

• “polimorfismi”: >1%

• Distribuzione nella popolazione

Malattie monogeniche vs malattie multifattoriali, complesse

• In una malattia monogenica, il difetto è suff. per causare il fenotipo

• In una malattia multifattoriale devono combinarsi gli effetti prodotti da più fattori genetici e da fattori esogeni/ambientali: ciascun fattore è contributore ma non suff. a generare il fenotipo

Genes and CAD

• RAS

• Coagulation cascade

• Cholesterol

• Diabetes

• Inflammations

• Adrenergic receptors

• Hypertension

• aging

La maggior parte degli studi disponibili è di

tipo caso-controllo• Primo studio: Cambien 1992: polimorfismo

ACE ID controlla circa il 50% dei livelli circolanti di ACE

• Da quel primo studio, centinaia di altri studi condotti sul genotipo ID del gene dell’ACE

• Nessuno è risultato conclusivo

• L’argomento è ancora oggetti di ricerca

Metabolismo lipidico

• Malattie monogeniche: ipercolesterolemia familiare da difetto del recettore LDL

• Dislipidemie combinate

• Difetti legati alle lipoproteine

• Lp(a)

Metabolismo lipidico

Fattori geneticamente determinati

Fattori esogeni: dieta, stili di vita

Ipercolesterolemia familiare

INTERMEDIATE PHENOTYPE:> LDL cholesterol

Ultimate phenotype CAD

GenotypesLDL cholesterol:

Apo-B, Apo-E

Exogenous factorsdiet, life style

LDL cholesterol: gene variants

• Apo-B gene– XbaI, EcoRI, in CAD– MspI: OR 1.18; 95%CI: 1.01-1.39

(Atherosclerosis, 1998;141:167-75

• Apo-E gene– Polimorphisms 2, 3, 4:

• 2 <ApoE, total cholesterol, and HDL Cholesterol

• 3 frequent allele, intermediate levels

• 4 > ApoE, Total Cholesterol, and HDL Cholesterol

ApoE Isoforms: isoelectic focusing E2(0), E3(+1), E4(+2)

Epsilon2: --->Arg158CysLys156GlnArg145CysArg136Ser

Epsilon4: Arg158Cys

ApoE: Epsilon4 - Risk of CAD

• Independent on age and LDL cholesterol

• OR: from 1.26 in metanalysis of 6355 pts to 2.74 in a small japanese population

• In families and twins: low HDL cholesterol: 35-50% genetic contribution and risk of early CAD

ApoE gene Polymorphisms

• CAD• Alzheimer S

• Creutzfeld-Jacob S

• Familial amyloidotic polyneuropathy

• Down Syndrome

• Vascular dementia

• Age-related memory decline

• Autosomal dominant amyotrophic lateral sclerosis

• Schizophrenia

• Hungtington D

• Fetal Iodin Deficiency disorder (endemic cretinism9

You are epsilon 4:Make your choice

Paraoxonase

• Paroxonase: shows clear-cut mendelian polymorphism, is an arylesterase,

• arylesterase activity, measured with phenylacetate as substrate, is determined by the same locus as paraoxonase.

• both activities are expressed by a single enzyme.

• Protects against CAD by destroying proinflammatory oxidized lipids in LDL

• Disorders:

– Cystic fibrosis

– Detoxification of organophosphate insecticides

– CAD

Paraoxonase deficient mice

• Unable to prevent LDL oxidation in cocoltured cell model of the arterial wall

• Effects on both LDL and HDL isolated from PON 1 KO mice

Gln191Arg

Met54Leu

- 108 regulatory region

Paraoxonase genotypes ---> different enzymatic activity:Gln191Arg: rapid hydrolization, lower activity (22.8%),

> vulnerability to toxic agents

Linkage disequilibrium

ACE/AMI/ID

ACE/CAD/ID/ n =18.325

ACE/AMI/ n = 11050

ACE/fam.CAD/ n = 1709

APOE/CAD/Clin.

APOE/CAD/Angio

gene cases/#of studies

ctls/# of studies

OR 95%CI

3394

9 studies

5 studies

5497 1.26

1.32

1.45

2.76

1.26

1.11

1.15-1.39

1.21-1.45

1.29-1.62

1.09-2.58

1.13-1.41

0.88-1.40

META-ANALYSIS ACE I/D AND APOE

Costi/benefici

*es. ACE I/D49.959 in meta-analisi(J Hypertension 1997)

costi tecnici estrazione DNA e genotipo con doppia copia di primers per DD: £ 30.000/caso

£1.500.000.000

Arch Intern Med 2001 Jul 9;161(13):1589-94

Hyperhomocystinemia: a risk factor or a consequence of coronary heart disease?

Knekt P, et al.

This prospective study does not support the hypothesis that a high concentration of serum homocysteine is a risk factor

for coronary events in a population free of heart disease. However, it does suggest that mild hyperhomocystinemia predicts

secondary coronary events in men with heart disease, possibly as a consequence of atherosclerotic changes.

J Am Coll Cardiol 2001 Jun 1;37(7):1858-63

A randomized double-blind placebo-controlled trial of the effect of homocysteine-lowering

therapy with folic acid on endothelial function in patients with coronary artery disease.

Thambyrajah J et al.

Homocysteine: sulfur-containig, non- proteinogenic AA biosynthesized from methionine:•To be remethylated to methionine•To enter the Cys biosynthetic pathway•To be released into extracellular medium

protein damage

Homocysteine Induces Expression and Secretion of Monocyte Chemoattractant Protein-1

and Interleukin-8 in Human Aortic Endothelial Cells

Circulation 2001;103:2717

Homocysteine Induces Expression and Secretion of Monocyte Chemoattractant Protein-1

and Interleukin-8 in Human Aortic Endothelial Cells

Circulation 2001;103:2717

Hyperhomocysteinemia• Folate and cobalamine deficiency

• Pregnancy complications

• Rheumatoid artritis

• CRF, dyalisis, renal transplant

• Inflammatory bowel disease

• Diabetes mellitus and Insulin resistance syndrome

• Neuronal tube defects

• Mental disorders

• Cognitive impairment in elderly

• Psoriasis

• Tumors

• CV diseases

VII

VIIa

VIIa / TF

TF XI

XIa

T

IX IXa

VIII VIIIaT

IXa / VIIIa

X Xa

Va VT

Xa / Va

IIIIa

fibrinogeno

fibrinaMT

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Polimorfismo f. VII

Iacoviello L, N Engl J Med 1998;338:79-85

R 353 Q: RR / RQ / QQRegione ipervariabile 4: H7H7 / H6H7/ H6H6 / H7H5 / H6H5

0 diminuito 1 aumentato 10

rischio di IMA

RQH6H6

RRH6H7

RQH6H7

RRH7H7

RQH7H7

QQH7H7

140

120

100

80

60

40

20

0

f. V

II a

ct.

RR QQ H6H6 H7H7

*** **

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

C C

*

*

*

RGD*

*N N

PlA1 PlA2

(Leu 33 Pro)

Pena Penb

(Arg 143 Glu)

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

dodecapeptide (294 - 314)

*Baka Bakb

(Ser 843 Ile)

CA(Arg 489 Glu)

Sr(Arg 636 Cys)

Gp IIb/IIIa

MoPro 406 Ala

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Metanalisi dell’associazione tra polimorfismo PlA2 e IMA

Zhu MM Am J Cardiol 2000; 86:1000-1005

confronto studi pz OR pooled (95% CI) p

Pl A2A2/A1A2 vs PlA1A1 25 10.638 1.06 (0.97-1.16) 0.2

Pl A2A2 vs Pl A1A1 20 7.444 0.89 (0.68-1.17) 0.5

Pl A2A2 vs Pl A1A2/A1A1 20 9.987 0.88 (0.67-1.15) 0.4

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

PAI-1

4 G ACACGTGGGGACTCAGattivatore - 672 aumento della

velocità di trasmissione

5 G ACACGTGGGGGACTCAGattivatore - 672 normale

velocità di trasmissione

REPRESSORE

le citochine infiammatorie o i lipidi plasmatici (TGC, VLDL), in presenzadel genotipo 4G/4G, aumentano ulteriormente la produzione di PAI-1

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Metanalisi del polimorfismo 4G/5G del PAI-1

Iacoviello L. Thromb Haem 1998;80:1029-30

Studi retrospettivi caso-controlloin popolazioni a basso rischio

Studi prospettici caso-controlloin popolazioni a basso rischio

Studi retrospettivi caso-controlloin popolazioni ad alto rischio

totale

0 1 2 3 4M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Varianti alleliche in geni codificanti per citochine,

mediatori della flogosi• crescente ruolo delle citochine e dei mediatori

della risposta infiammatoria nella patogenesi della cardiopatia ischemica

• TNF, TNFreceptor, IL8, RANTES, MCP1, etc.

• Ogni gene codificante per un fattore di flogosi è un potenziale candidato.

L’aterosclerosiè una malattia infiammatoria

Chemokines

I meccanismi biologici che la governano sono quelli della flogosi

La complessa rete del sistema di interazione cellulare nella flogosi

MCP-1 gene regulatory region at -2518. 1: MWM; 2: G/G; 3: A/G; 4: A/A.

RANTES pm region. 1:MWM; 2: R -403 A/A; 3: R -403 G/A; 4: R -403 G/G; 5; R -28 G/G; 6; R -28 C/G; 7: R -28 C/C;

Inflammation mediators

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Extracellular

2AR: small MW ligands bind to sites within the hydrophobic core formed by TM -helices. Belongs to a major subfamily of CPCR: signal transduction

Genotype Frequency Distributions and Allele Frequencies of the Ser49Gly and Gly389Arg Polymorphisms of the ß1-Adrenergic Receptor Gene in Controls

and Hypertensives Categories

Controls (n=265), n (%) Hypertensives (n=292), n (%) P

Arg389Gly Arg/Arg 134 (50.6) 192 (65.8) 0.0012 Gly/Arg 110 (41.5) 86 (29.5) ... Gly/Gly 21 (7.9) 14 (4.8) ... Arg 378 (71.3) 470 (80.5) 0.0003 Gly 152 (28.7) 114 (19.5) ...Ser49Gly Ser/Ser 193 (72.8) 199 (68.2) ... Ser/Gly 66 (24.9) 81 (27.7) ... Gly/Gly 6 (2.3) 12 (4.1) 0.31 Ser49 452 (85.3) 479 (82) ... Gly49 78 (14.7) 105 (18) 0.14

Genetica e IpertensioneRicerca di Geni Candidati

5. ADDUCINA (ADD)

– Proteina eterodimerica della membrana cellulare che regola il trasporto ionico agendo sull’actina del citoscheletro: favorisce il legame spectrina-actina mediato dalla calcio-calmodulina.

– Subunità (ADD1, 4p16.3) e subunità (ADD2, 2p14-p13).

– Cusi D et al., Lancet 1997: linkage tra locus ADD1 e ipertensione essenziale.

– Schork NJ et al., Am J Hypertens 2000; Bray MS et al., Am J Hypertens 2000; Ranade K et al., Am J Hypertens 2000; Province MA et al., Am J Hypertens 2000; Barlassina C et al., Am J Hypertens 2000; Boerwinkle E. Am J Hypertens 2000; Bianchi G and Cusi D. Am J Hypertens 2000: influenza del polimorfismo Gly460Trp di ADD1 sui livelli di pressione arteriosa e sulla presenza di ipertensione arteriosa in popolazione di diverse etnie: suggerita associazione della variante allelica 460Trp con ipertensione in alcune popolazione e in altre no.

A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Genetica e Ipertensione

Risultati promettenti da studi di linkage e di associazione ma necessarie ulteriori indagini.Inconsistenza e difficile riproducibilità di alcuni risultati confermano ulteriormente la complessità del disordine.

A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Genetica e Ipertensione

IPERTENSIONE ARTERIOSA=

MALATTIA “DELLE ARTERIE”

DANNO D’ORGANO

FENOTIPO INTERMEDIOcome indice importante di diagnosi precoce

A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

From single studies done in small and large series to meta-

analyses

Strategies: small series --> better clinical definition

Power: > large series, multicentric studies: ratial, ethnical differences

OR for CAD and stroke: factor II (G20210A and AA genotypes).

OR for CADand stroke for factor V (G1691A and AA genotypes).

factor VII (353RQ and QQ genotypes).

GP IIIa (PIA1/A2 and A2/A2 genotypes).

MTHFR (677TT genotypes).

SNIPS and CADAJC, 2001

From genotyping to functional studies

Experimental setting to understand the potential links among different

risk factors

Protein studies

• Sequencing

• Domains

• Modelling

• Interactions

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7 transmebrane motif receptor (beta receptors)

Chain A

Chain B

Chain C

Ligands

Ligands

TNF R associated factor 2 in complex with a 17-residue cd40 peptide

Chain: L ( 36 residues ) - [K&S: 1 helix ] Chain: H ( 150 residues ) - [K&S: 3 helices, 7 strands ] Chain: E ( 109 residues ) - [K&S: 3 helices, 5 strands ] Chain: F ( 11 residues ) Chain: J ( 36 residues ) - [K&S: 1 helix ] Chain: K ( 259 residues ) - [K&S: 5 helices, 13 strands ] Chain: G ( 11 residues ) Chain: M ( 36 residues ) - [K&S: 3 helices ] Chain: N ( 259 residues ) - [K&S: 5 helices, 12 strands ] Chain: I ( 11 residues ) - [K&S: 1 helix ]

Thrombin complex with fibrinopeptide alpha (residues 7 - 16) (three complexes - one with epsilon-thrombin and two with alpha-thrombin)

Main-chain trace Chain: A ( 357 residues ) - [K&S: 11 helices, 15 strands ] Chain: P ( 15 residues ) - [K&S: 1 strand ]

* Ligands (shown as all atoms) Ligand: SEO

Human plasminogen activator inhibitor-2.

Genetic + environmental factors or gender

• Genotypes in smokers

• Genotypes in females

• Genotypes in more than one gene + life style

• Aims: to test the reciprocal effects

Interazione tra polimorfismi genici e fattori esogeni ambientali

es.*beta-chain fibrinogen + HP infezione

* NOS genotype + fumo

Same gene polymorphisms increase the risk for a series of

different disorders

RAS LDLr Hcys Beta2AR TNF

ApoE Ils

Hundreds of SNPS

Future

• Pharmacogenetics

• Genotype guided treatments

• Genotype-bsed trials

• Individual genetic risk

MICROARRAY TECHNOLOGY

Gene expression analysisMutation screening GeotypingProtein studies Antibody study

DNA CHIPS

The term DNA Chip refers to miniaturised arrays of nucleic acid segments anchored on glass supports no larger than a microscope slide.- cDNA microarrays- Oligonucleotide microarrays

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

TECHNICAL FOUNDATIONS

The field has evolved from Edwin Southern one quarter of century ago:labelled nucleic acid molecules could be used to interrogate nucleic acid molecules attached to a solid support.

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

MICROCHIP:Affymetrix

MICROCHIP:Nanogen

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

MEDWAY ADVANCE 2000 - I

DEPOSITION OF PRE-SYNTHESIZED OLIGONUCLEOTIDES

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

C6 aminolink

C18 spacer

TGCATATAGAGACGAGAAGGGG

TGCATATAGAGACGAGAAGGGG

TGCATATAGAGACGAGAAGGGG

TGCATATAGAGACGAGAAGGGG

C C T TGG A A

G/G G/A A/A

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

cell culture or tissue sample

total RNA isolation

DNP and Biotin cDNA

co-hybridization

TSA fluorescence detection

imaging and data analysis

Expression profiling

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

MICROARRAY:expression profiling

Non affected Affected

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Application of Microarrays

1) Gene Expression and Discovery (Which genes are expressed and to what magnitude?)

2) Predicting gene function

3) Linking cell pathways

4) “Fingerprint” of celluar or disease phenotype

5) Drug discover and drug target validation

MICROARRAY: expression profiling

Melanoma vs. normal

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Per maggiori informazioni

• Le diapositive del corso extramurale ANMCO di epidemiologia genetica svoltosi a Roma il 13 e 14 ottobre 2001 sono consultabili al sito dell’ANMCO

• Area Genetica presso: aree@anmco.it