Post on 30-Jul-2020
La biologia molecolare
in ambito micologico
ORLANDO PETRINI, BREGANZONA
ORLANDO@PETRININET.CH
1
Agenda
Il problema
Biologia molecolare e genetica
DNA e genoma
Sequenze
L’orologio molecolare
La genomica
La proteomica
La PCR
Tassonomia polifasica… e i problemi da risolvere
2
Il problema
una classificazione affidabile deve tener
conto contemporaneamente degli aspetti
filogenetici (legati all’evoluzione genetica degli
organismi nel tempo)
fenotipici (che descrivono la morfologia e la
fisiologia dei taxa esaminati)
ecologici (ad es. micorriza quale carattere
tassonomico)
3
Agenda
Il problema
Biologia molecolare e genetica
DNA e genoma
Sequenze
L’orologio molecolare
La genomica
La proteomica
La PCR
Tassonomia polifasica… e i problemi da risolvere
4
Il DNA
Acido desossiribonucleico
Contiene le informazioni genetiche necessariealla sintesi di proteine
È costituito da “mattoni”chiamati nucleotidi(deossiribonucleotidi)
Adenina (A)
Guanina (G)
Citosina (C)
Timina* (T)
Doppia catena polinucleotidica (A,T,C,G), antiparallela, orientata, complementare, spiralizzata, informazionale
18-Feb-2017
5
* nell’RNA uracile (U)
6
Il DNA
Replicazione (duplicazione) del DNA
AT
CG
AT
AT
C G
A T
C G
C G
CG
A T
CG
A T
CG C
AT AT
AT
C GC
C
C GG
ATA
A TA T
A TA T
CGCG
A TA T
ATAT
CGG
18-Feb-2017
7
Di I, Madprime, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2497221
Produzione di una copia del DNA
Il doppio filamento (“genitore”) di DNA serve da “stampo” per la sintesi di due nuovi filamenti (“figli”) di DNA
Enzimi coinvolti: diverse DNA polimerasi(enzimi di sintesi)
Il genoma
Probabilmente da “gene”+”cromosoma” (Oxford
Dictionary) o dal greco γίγνομαι (Hans Winkler, 1920)
Totalità (aploide) del DNA di una cellula
Esempio: l‘uomo
Genoma: 23 cromosomi („il libro dei caratteri“)
Ogni cromosoma („ un capitolo“) contiene 48-250 milioni di lettere
(A C G T), senza spazi
Il genoma è contenuto in ogni cellula (ma non nei glubuli rossi)
8
Il genoma in cifre 9
Genoma:
Virus: ca. 10‘000 = ca.10 µm
Batterio ca. 1‘000‘000 = ca.1 mm
Uomo ca. 1‘000‘000‘000 = ca.1 m
1 libro di ca. 600 pagine
1‘000 libri (una parete di scaffali
a sei ripiani lunga 8 m)
Grandezza del
genoma
Biologia molecolare e micologia
10
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Genome_Sizes.png
La stele di Rosetta
Biologia molecolare e micologia
11
DNA Proteine
RNA (acido ribonucleico): “il traduttore” – ruolibiologici di codifica, decodifica, regolazione edespressione dei geni.
RNA
Le proteine
Molecole costituite da catene di
amminoacidi
Funzioni
Catalisi di reazioni metaboliche
Sintesi (ad es. replicazione del DNA)
Risposta a stimoli
Trasporto di molecole
Differiscono tra di loro per la
sequenza di amminoacidi
18-Feb-2017Biologia molecolare e micologia
12
http://www.u-helmich.de/bio/cytologie/02/021/Proteine/Proteine29-34.html
Ponte
disulfuro
Legame
ionico
Il codice genetico
regole attraverso le quali viene “tradotta” l'informazione, codificata nel
materiale genetico (DNA), in proteine
Quasi tutti gli esseri viventi usano il medesimo codice genetico
Espressione genica:
Trascrizione: una sequenza di DNA, chiamata gene strutturale, è usata come
stampo per la creazione di un filamento complementare di RNA (acido
ribonucleico)
Traduzione: La sequenza di RNA si compone di gruppi non sovrapposti di tre
basi ciascuno, chiamati codoni. Ad ogni codone corrisponde uno specifico
amminoacido. La sequenza di codoni (o triplette di basi) è tradotta in una
sequenza di amminoacidi
Esistono 64 codoni
13
Codoni e amminoacidi 14
(Fonte: Wikipedia)
Perché un aminoacido è determinato da piùcodoni?
A. Per ridondanza, ma senza valore evolutivo
B. Per ridondanza, con valore evolutivo
C. Per sicurezza
D. Per ragioni matematiche
E. B e C
F. A e C
G. Nessuna ragione: complica solo la vita ai biochimici e ai micologi
15
Le sequenze beta tubulina
16
CGC = arginina
ma
arginina= CGT, CGC,
CGA, CGG, AGA, AGG
Similarità:
Manzoni e DanteNELMEZZODELCAMMINDINOSTRAVITAMIR
ITROVAIPERUNASELVAOSCURACHELADIRITTAVIAE
RASMARRITAAHIQUANTOADIRQUALERAECOSADURAE
STASELVASELVAGGIAEASPRAEFORTECHENELPENSI
ERRINOVALAPAURA
QUELRAMODELLAGODICOMOCHEVOLGEAME
ZZOGIORNOTRADUECATENENONINTERROTTEDIMONT
ITUTTOASENIEAGOLFIASECONDADELLOSPORGEREE
DELRIENTRAREDIQUELLIVIENQUASIAUNTRATTOAR
ISTRINGERSIEAPRE
17
Similarità tra 1° riga di Dante e 1° riga di Manzoni (32 caratteri): 6/32 = 18.75%
Replicazione (duplicazione) del DNA
AT
CG
AT
AT
C G
A T
C G
C G
CG
A T
CG
A T
CG C
AT AT
AT
C GC
C
C GG
ATA
A TA T
A TA T
CGCG
A TA T
ATAT
CGG
18-Feb-2017
18
Di I, Madprime, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2497221
Produzione di una copia del DNA
Il doppio filamento (“genitore”) di DNA serve da “stampo” per la sintesi di due nuovi filamenti (“figli”) di DNA
Enzimi coinvolti: diverse DNA polimerasi(enzimi di sintesi)
Le mutazioni
Il tipografo distratto:
QUELRAMODELLAGODICOMOCHEVOLGEAMEZZOGIORNOT
RADUECATENENONINTERROTTEDIMONTITUTTOASENIE
AGOLFIASECONDADELLOSPORGEREEDELRIENTRAREDI
QUELLIVIENQUASIAUNTRATTOARISTRINGERSIEAPRE
QUELRAMODELLAGODICOMOCHEVOLGEAMEZZOGIORNOT
RADUECATENEININTERROTTEDIMONTITUTTOASENIEA
GOLFIASECONDADELLOSPORGEREEDELRIENTRAREDIQ
UELLIVIENQUASIAUNTRATTOARISTRINGERSIEAPRE
QUELRAMODELLAGODICOMOCHEVOLGEAMEZZOGIORNOT
RADUECATENEBENINTERROTTEDIMONTITUTTOASENIE
AGOLFIASECONDADELLOSPORGEREEDELRIENTRAREDI
QUELLIVIENQUASIAUNTRATTOARISTRINGERSIEAPRE
19
… e l’enzima di sintesi (polimerasi)
distratto:
20
CGC =arginina
se durante la replicaT rimpiazza la seconda C:
CGT=arginina
se durante la replicaG rimpiazza la prima C:
GGC=glicina
L’orologio molecolare
Evoluzione:
Processo divergente
Numero di mutazioni: direttamente proporzionale al tempo
intercorso dalla divergenza delle sequenze (Zuckerkandl & Pauling, 1965)
È quindi possibile calcolare il tempo trascorso dal
momento in cui due sequenze hanno cominciato a
divergere
Ma: l‘orologio molecolare non è universale, perché geni
diversi hanno diversi tassi di mutazione
21
Mutazioni: sostituzioni, transizioni, trasversioni…
18-Feb-2017Biologia molecolare e micologia
22
Petulda - CC BY-SA 4.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=45586369
adenina guanina
citosina timina
Transizioni
Transizioni
TrasversioniTrasversioni
purine
pirimidine
Tipi di mutazioni
Sostituzioni:CTGGCG CTGGAG
Inserzioni:CTGGCG CTGGACTG
Delezioni:CTGGCG CTGG
Mutazioni “Frameshift”:CGC-CGT-CGT (Arginina-Arginina-Glicina) (C)GCC-GTC-GT(Alanina-Valina-??)
(pensando di nuovo a Manzoni : TRADUECATENENONINTERROTTEDIMONTI TRADUECATENEINTERROTTEDIMONTI)
23
Le mutazioni
A. Sono tutte visibili feneticamente
B. Accadono molto spesso
C. Molte volte non sono visibili feneticamente, solo nelle sequenze genetiche
D. Molte volte sono letali
E. Sono sempre importanti da un punto di vista fenetico
F. B e C
G. B e D
H. Nessuna risposta è giusta
I. Tutte le risposte A–G sono giuste 24
25Genomica e proteomica
proteine
cellula
batterica
DNA
genoma
proteoma
fingerprint
del DNA30 00 50 00 70 00 90 00 11 00 0 13 00 0
M ass (m /z )
21 17 .3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10 0
% In
te
ns
ity
V o y a g e r S p e c # 1 = > A d v B C ( 3 2 , 0 . 5 , 1 . 0 ) = > N F 0 . 7 [ B P = 4 4 2 3 . 9 , 2 1 1 7 ]
44
24
.2
94
76
.2
48
61
.0
88
23
.5
58
97
.8
62
71
.2
80
54
.3
66
29
.0
74
24
.9
12
27
1.4
47
38
.6
69
84
.6
83
83
.8
67
86
.7
65
33
.3
90
75
.2
31
32
.3
61
37
.3
72
09
.8
89
03
.3
86
10
.6
10
11
0.8
47
65
.4
10
97
5.2
40
26
.9
45
35
.6
33
11
.8
10
49
3.9
34
91
.4
96
11
.5
Fingerprint
di masse
Definizione e identificazione
di specie
La genomica
Studia il genoma (patrimonio genetico: l'insieme dei geni di
un organismo vivente)
Si occupa di
struttura, contenuto, funzione ed evoluzione del genoma
Si basa sulla bioinformatica per elaborare e visualizzare i dati
che produce
Caratterizza perfettamente un organismo
26
La proteomica
Studia il proteoma (l’insieme delle proteine di un organismo;
Wilkins, 1994)
Identifica le proteine e le associa con uno stato fisiologico
Permette di correlare il livello di proteine prodotte da una
cellula o tessuto con il suo stato fisiologico
Può essere usata per la caratterizzazione tassonomica di un
organismo
27
28
Linear and Reflectron MALDI-TOF MS
AXIMA-ConfidenceTM (Shimadzu) con
database SARAMISTM
Questo non è
uno spettrometro
MALDI-TOF…
~ 2
00
cm
Spettrometro di massa
MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight)
29
Raggio laser
Rilevatore
Analita ionizzato
+ ++++
++
++
+
+
+
+ ++
++
+
+
+
+
++
+
+
Matrice con ioni e particelle neutrali
Regione d’accelerazione
+
+++
Regione senza campo magnetico+
+
+
+
+
+
desorzione
ionizzazione
accelerazione
separazione
rilevamento
Piastra portamateriale
Matrice cristallizata e
analita+
30Identificazione
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
nsit
y
< < C : \ D o k u m e n t e u n d E in s t e llu n g e n \ m . e r h a r d \ E ig e n e D a t e ie n \ A n a g n o s T e c - d c \ Z w is c h e n a b la g e \ D o k u m e n t B a n n e r . t x t > > S p e c [ B P = 3
37
75
70
75
80
74
87
44
10
93
9
94
53
99
94
79
80
10
34
7
50
15
78
63
11
57
2
70
92
59
31
96
54
35
81
68
37
93
30
73
67
10
22
6
84
50
10
60
8
11
90
6
31Ricerca diretta nella banca dati,se necessario
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
nsit
y
< < C : \ D o k u m e n t e u n d E in s t e llu n g e n \ m . e r h a r d \ E ig e n e D a t e ie n \ A n a g n o s T e c - d c \ Z w is c h e n a b la g e \ D o k u m e n t B a n n e r . t x t > > S p e c [ B P = 3
37
75
70
75
80
74
87
44
10
93
9
94
53
99
94
79
80
10
34
7
50
15
78
63
11
57
2
70
92
59
31
96
54
35
81
68
37
93
30
73
67
10
22
6
84
50
10
60
8
11
90
6
MALDI-TOF MS ha funzionato con…
32
…Eudiaptomus… 33
Eudiaptomus gracilis
Eudiaptomus padanus
Eudiaptomus intermedius
34
Perera et al. Identification of aphid species using protein profiling and
matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.
Entomologia Experimentalis et Applicata 2005, 117:243-247.
MajaWilly
… insetti…
35
Perera et al. A novel approach to identify plant parasitic nematodes
using MALDI-TOF mass spectrometry. Rapid Comm Mass Spectrom
2005, 19:1454-1460.
… e nematodi…
… perchè i funghi dovrebbero essere
l‘eccezione???
36
Identificazione di Candida spp.
tramite MALDI-TOF MS37
C. glabrata
C. dubliniensis
C. albicans
C. tropicalis
C. krusei
C. parapsilosis
C. lusitaniae
C. guilliermondii
C. magnoliae
A) Biologia molecolare (ITS) B) MALDI-TOF
MALDI-TOF MS è un metodo che
A. Sostituisce molto bene le sequenze per studi filogenetici
B. Fornisce dati fenetici, come la morfologia
C. È usabile solo se esistono spettri di riferimento
D. I risultati sono sempre comparabili con quelli delle sequenze geniche
E. B e C
F. A e D
G. Nessuna risposta è giusta
38
Agenda
Il problema
Biologia molecolare e genetica
DNA e genoma
Sequenze
L’orologio molecolare
La genomica
La proteomica
La PCR
Tassonomia polifasica… e i problemi da risolvere
39
La PCR
Reazione a catena della polimerasi (Mullis 1983)
Moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici di cui si
conoscono le sequenze iniziali e terminali
Necessari: primer (”innesco”) – filamento di acido nucleico (18-20 basi)
che serve come punto d’innesco per la replicazione del DNA
Primer corti: poco specifici
Ricerca di primer in Internet: NCBI Primer-BLAST, www. geneious.com
Produce sequenze di geni ben definiti che possono essere usate per
lavori di filogenetica
40
https://youtu.be/iQsu3Kz9NYo
Agenda
Il problema
Biologia molecolare e genetica
DNA e genoma
Sequenze
L’orologio molecolare
La genomica
La proteomica
La PCR
Tassonomia polifasica… e i problemi da risolvere
41
Tassonomia polifasica:
classificare gli organismi con…
morfologia (forma, dimensione, colore,
peculiarità macroscopiche e microscopiche)
metodi biochimici
elettroforesi di proteine ed enzimi
analisi genetica (RFLP, sequenze)
proteomica
ecologia
…
42
La tassonomia polifasica
Definita da Colvell nel 1970 per la tassonomia
batterica
Sistema di classificazione che combina e sintetizza
tutta l’informazione disponibile
Produce una tassonomia completa, che
necessariamente diventa multifattoriale
In micologia questa filosofia ha fatto il suo ingresso
negli anni novanta
43
La tassonomia polifasica
Usa caratteri di:
ecologia
morfologia
fisiologia, citologia, cariologia
biochimica
biologia molecolare
E tenta di analizzare tutti i dati ottenuti
contemporaneamente
44
Metodi usati nella tassonomia
polifasica
Tutti i metodi tradizionali e moderni:
Microscopia
Tests fisiologici
Analisi ecologiche
Analisi degli isoenzimi
RAPDs, RFLP, AFLP, ISSR-PCR...
Sequenze geniche
Proteomica
45
Un breve riassunto 46
Aspergillus
18-Feb-2017
47
Analisi dei dati
Analisi „combinata“
Analisi statistiche
Analisi di clustering (Clustering classico, Block Clustering,
Fuzzy Clustering)
Analisi delle componenti principali e fattoriali
Non-metric MultiDimensional Scaling (MDS)
Metodi filogenetici
Analisi delle corrispondenze multiple (MCA)
48
Un esempio: Boletus spp.
(due gruppi diversi di campioni) 49
Petrini et al. (2009). Chemical elements in mushrooms: their potential
taxonomic significance. Mycol Progress 2009;8:171-80.
Mello et al. (2006). ITS primers for the identification of marketable boletes. J Biotechnol. 121;3: 318–329.
Problemi aperti:
Hypoxylon fuscum50
Petrini L et al. (1987). Host specificity of Hypoxylon fuscum: a statistical
approach to the problem. Sydowia 40: 227–234.
La tassonomia polifasica
A. È un metodo innovativo sviluppato da poco tempo
B. Permette di arrivare ad una tassonomia completa e in modo veloce
C. Vuole includere tutti I caratteri possibili nella costruzione di una tassonomia
completa
D. Non è ancora usata in micologia
E. È un metodo che richiede un lavoro multidisciplinare
F. A e C
G. C e F
H. È un’idea interessante ma inutile
51
Backup
52
53Flusso del lavoro
Acquisizionedegli spettri
Preparazione
materiale
Identificazione
barcode
Trasferimento dati
3000 5100 7200 9300 11400 13500
Mass (m/z )
1.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
te
ns
ity
V o y a g e r S p e c # 1 M C = > A d v B C ( 3 2 , 0 . 5 , 1 . 0 ) = > N F 0 . 7 [ B P = 9 7 4 0 . 9 , 1 0 2 6 9 ]
97
41
71
73
72
00
95
37
43
65
62
55
71
86
90
65
71
58
83
27
53
81
55
65
78
71
63
16
50
96
95
55
88
51
82
85
10
92
3
91
94
12
22
5
48
69
77
06
34
10
68
58
10
30
2
32
04
54
59
46
11
61
11
57
23
36
36
10
69
7
83
94
11
74
1
Trasferimento
spettri
(a)
(f)
(e)
(d)
(c)
(b)
LIMS/Middleware
Power Ionising Vacuum NegativePower Ionising Vacuum NegativePower Ionising Vacuum Negative
Identificazione di Candida spp.
– lo studio54
Standardizzazione
Treatment
A: 1µl cell suspension in 30 µl H2O,
70 µl 96% EtOH
B: 600 µl cell suspension (OD 0.8),
1400 µl 96% EtOH
C: 2 ml cell suspension (OD 0.8)
centrifuged, pellet re-suspended
in 100 µl 70% EtOH
D: 4 ml cell suspension (OD 0.8)
centrifuged, pellet re-suspended
in 100 µl 70% EtOH
E: 1200 µl cell suspension (OD 0.8)
and 2800 µl 96% EtOH
55
A
B
C
D
E