tessuto epiteliale al microscopio ottico

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

come si ottiene, a partire da

tessuti biologici, un’immagine come quella precedente?

Problema 1

• la luce del microscopio può attraversare solo

materiale di spessore molto ridotto

La preparazione di materiale istologico

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

Problema 2

• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli

La preparazione di materiale istologico

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione con aldeidi

– Inclusione

– Congelamento

Problema 3

• i tessuti sono normalmente quasi incolori e

privi di contrasto

La preparazione di materiale istologico

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

sequenza dei passaggi in una

tipica procedura istologica

1. fissazione di un campione di tessuto

2. congelamento o inclusione del pezzo

3. taglio al microtomo

4. montaggio su vetrino

5. “bagni” in soluzioni di coloranti

6. disidratazione e coverslipping

FISSAZIONE

• SCOPO

Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura delle cellule

dalle alterazioni conseguenti la morte cellulare

• COME SI OTTIENE

Trattamento chimico dei tessuti che porta alla precipitazione delle

proteine, tramite la formazione di legami chimici

• una rapida interruzione dei processi vitali della cellula

• inattivazione di enzimi litici

INCLUSIONE

• SCOPO

Fornire consistenza e resistenza al tessuto in modo che

possa essere tagliato in fette sottili (3-10 micron)

• COME SI OTTIENE

Si ottiene tramite l’inclusione in PARAFFINA (MO) che si ottiene tramite la penetrazione della paraffina in tutti gli

spazi intercellulari e anche nelle cellule

INCLUSIONE

• PROCEDURA

- I frammenti sono posti in soluzioni acquose a

concentrazioni di alcool crescenti, in modo da disidratare il

tessuto

- passaggio in un solvente della paraffina: XILOLO o

BENZOLO

- passaggio in paraffina liquida

50 %

ethanol70 %

ethanol95 %

ethanol

100 %

ethanol

benzene/

xyleneparaffin

wax

Remove the water & replace with wax-solventEmbed the oriented specimen in molten wax

Miscible with ethanol;

dissolves wax

Fresh

tissue

10% Formalin fixative

label

INCLUSIONE IN PARAFFINA

La paraffina è liquida a 55-60° C. Solidifica a temperatura ambiente

ISTOLOGIA

TAGLIO

• Preparazione di fettine sottili di tessuto (3-10 micron)

tramite il MICROTOMO

METODI PARTICOLARI DI FISSAZIONE-TAGLIO

• Il tessuto viene congelato e tagliato con il criostato alla

temperatura desiderata

• CRIOSTATO: microtomo posto in un frigorifero

• Generalmente si ha una riduzione degli artefatti

ISTOLOGIA

TAGLIO AL MICROTOMO

TESSUTO

INCLUSO IN

PARAFFINA

LAMA

SEZIONI

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

RECUPERO DELLE SEZIONI

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

SEZIONI NON COLORATE

VETRINO

PORTAOGGETTO

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

lo striscio

di sangue

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche

più diffuse, consente lo

studio microscopico

delle cellule del sangue

e si distingue dal

protocollo “generico” appena delineato

perché, ovviamente,

non richiede il taglio

del tessuto.

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

ATTENZIONE AGLI

ARTEFATTI

GLI ARTEFATTI POSSONO ESSERE DOVUTI A:

• fissazione – cambiamenti ne lla s tru ttu ra de l te s s u to o de lla ce llu la

p rodotti da l fis s a tivo

• inclusione – ecces s ivo ca lore de lla res ina (o il p roces s o d i

conge lamento) pos s ono caus are d is tors ion i

• taglio - può danneggiare la s ezione

- orien tamento de l tag lio

ORIENTAMENTO DEL

TAGLIO

ISTOLOGIA

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI SEZIONI

•CORDONE SOLIDO

TUBULO

LAMINA

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

COLORAZIONE

SCOPO

- aumentare il contrasto dei diversi costituenti del tessuto per:

favorirne la osservazione

- identificare costituenti chimici specifici dei tessuti (istochimica)

COME SI OTTIENE

Dopo il taglio le sezioni sono raccolte su un vetrino portaoggetto

Estrazione della paraffina con solventi della paraffina (xilolo o benzolo)

Idratazione delle sezioni tramite passaggio in soluzioni contenenti

concentrazioni sempre più basse di alcool

( alcool acqua)

Trattamento delle sezioni con coloranti (sciolti in soluzioni acquose)

COLORANTI• i COLORANTI si comportano come molecole acide o basiche

• una base rilascia OH-; un acido rilascia H3O

+

• i coloranti formano legami ionici con le molecole del tessuto

• coloranti basici (+) legano molecole basofile (-)

• coloranti acidi (-) legano molecole acidofile(+)

COLORANTI

coloranti basici (+)

• includono ematossilina, blu di toluidina e blu di metilene

• colorano glicosamminoglicani (GAG), RNA, DNA (-)

coloranti acidi (-)

• includono eosina, fucsina acida

• colorano proteine citoplasmatiche (+)

Miscele coloranti

COLORAZIONI ISTOLOGICHE

Ematos s ilina-eos ina (H & E) è una de lle co lorazioni p iù comuni

Hematoxylin is a bas ic dye (+)

s ta ins ac id ic s ubs tances (e .g . nuc le ic ac ids )

Eos in is an ac id ic dye (-) s ta ins bas ic

s ubs tances (e .g . p ro te ins in cytoplas m)

ISTOLOGIAISTOLOGIA

Basofilia dei

nuclei (acidi)

Acidofilia

del

citoplasma

COLORAZIONE AZAN-

MALLORY

Fibre

Collagene

blu

Nuclei

rosso

Citoplasma

rosa

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

METACROMASIA

• Alcuni coloranti legando alcuni composti chimici forniscono loro una colorazione

diversa da quella del colorante stesso.

• ES.: BLU DI TOLUIDINA colora in rosso i proteoglicani acidi della cartilagine

ISTOLOGIA

Istologia

“funzionale”• Colture cellulari

• Coloranti vitali

• Istochimica

• Immunoistochimica

• Immunofluorescenza

L’istologia moderna non

si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti

morfologici e strutturali

di base di cellule e

tessuti.

Esistono numerose

tecniche che consentono

di rispondere a quesiti

sulla composizione

specifica di un tessuto

correlata alle sue

funzioni

Istochimica

• L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti

Mentre nella biochimica tradizionale il

materiale biologico viene studiato

tipicamente “in provetta”,la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su

sezioni di tessuto, consentendo di

identificare i costituenti in situ.

ISTOCHIMICA

Cellule del tratto digerente secernenti muco (H&E; PAS-H)

ISTOLOGIA

Istochimica

• LIPIDI

Sudan Nero, Sudan III (coloranti solubili nei grassi)

• CARBOIDRATI

Reazione Acido-Periodico di Shiff (PAS) che colora di rosso amido, glicogeno, mucopolisaccaridi

• DNA

Reazione di Feulgen che colora di rosso in modo selettivo il DNA

ISTOCHIMICA: IDENTIFICAZIONE

DI ENZIMI

• Si sfrutta l’attività enzimatica di proteine dei tessuti• Si fornisce il substrato specifico per un enzima

enzima

SUBSTRATO PRODOTTO (colorato)

ESEMPIO: METODO GOMORI-TAKAMATSU per la FOSFATASI

Glicerofosfato + Ca2+ Fosfato di calcio

• Si possono evidenziare

ENZIMI IDROLITICI: fosfatasi, ATPasi, lipasi

OSSIDASI: perossidasi

DEIDROGENASI: lattico deidrogenasi

ISTOCHIMICA-IDENTIFICAZIONE DI

ENZIMI: PEROSSIDASI

neuroni

ISTOLOGIA

immunocitochimica

ISTOLOGIA

Microtubuli nella cellula in interfase

Immunofluorescenza con anticorpi anti-tubulina

ISTOLOGIA

immunocitochimica

ISTOLOGIA

Il

micro-

scopio

ottico

MICROSCOPIO Ottico MICROSCOPIO elettronico

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L’Immagine è osservata direttamente dall’occhio

Ingrandimento fino a 1.500X

Potere risolutivo = 0,2 mm Potere risolutivo = 1 nm (0,001 mm.)

Preparazione del campione richiede Preparazione del campione richiede

se congelato solo 20 min almeno 1 giorno

DIFFERENZE TRA MO e TEM

L’immagine si forma su uno schermo fluorescente

Ingrandimento fino a 2.000.000X

Microscopia elettronica

• Preparazione del tessuto

– Fissazione in glutaraldeide

– Postfissazione in tetrossido di osmio

– Disidratazione con alcol

– Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche dure (epon, araldite)

• Taglio all’ultramicrotomo– Sezioni di 20-40 nm

• Aumento del contrasto

– Coloranti elettronici: metalli pesanti come acetato di uranile o citrato di piombo

Microscopio elettronico

a scansione

• Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione

• Consente di valutare il rilievo degli

oggetti

• Usata per lo studio delle superfici

cellulari

globuli

rossi

Microscopio a

scansione:

superficie dei

globuli rossi

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA