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tessuto epiteliale al microscopio ottico

ISTOLOGIA

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come si ottiene, a partire da

tessuti biologici, un’immagine come quella precedente?

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Problema 1

• la luce del microscopio può attraversare solo

materiale di spessore molto ridotto

La preparazione di materiale istologico

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

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Problema 2

• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli

La preparazione di materiale istologico

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione con aldeidi

– Inclusione

– Congelamento

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Problema 3

• i tessuti sono normalmente quasi incolori e

privi di contrasto

La preparazione di materiale istologico

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

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sequenza dei passaggi in una

tipica procedura istologica

1. fissazione di un campione di tessuto

2. congelamento o inclusione del pezzo

3. taglio al microtomo

4. montaggio su vetrino

5. “bagni” in soluzioni di coloranti

6. disidratazione e coverslipping

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FISSAZIONE

• SCOPO

Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura delle cellule

dalle alterazioni conseguenti la morte cellulare

• COME SI OTTIENE

Trattamento chimico dei tessuti che porta alla precipitazione delle

proteine, tramite la formazione di legami chimici

• una rapida interruzione dei processi vitali della cellula

• inattivazione di enzimi litici

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INCLUSIONE

• SCOPO

Fornire consistenza e resistenza al tessuto in modo che

possa essere tagliato in fette sottili (3-10 micron)

• COME SI OTTIENE

Si ottiene tramite l’inclusione in PARAFFINA (MO) che si ottiene tramite la penetrazione della paraffina in tutti gli

spazi intercellulari e anche nelle cellule

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INCLUSIONE

• PROCEDURA

- I frammenti sono posti in soluzioni acquose a

concentrazioni di alcool crescenti, in modo da disidratare il

tessuto

- passaggio in un solvente della paraffina: XILOLO o

BENZOLO

- passaggio in paraffina liquida

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50 %

ethanol70 %

ethanol95 %

ethanol

100 %

ethanol

benzene/

xyleneparaffin

wax

Remove the water & replace with wax-solventEmbed the oriented specimen in molten wax

Miscible with ethanol;

dissolves wax

Fresh

tissue

10% Formalin fixative

label

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INCLUSIONE IN PARAFFINA

La paraffina è liquida a 55-60° C. Solidifica a temperatura ambiente

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TAGLIO

• Preparazione di fettine sottili di tessuto (3-10 micron)

tramite il MICROTOMO

METODI PARTICOLARI DI FISSAZIONE-TAGLIO

• Il tessuto viene congelato e tagliato con il criostato alla

temperatura desiderata

• CRIOSTATO: microtomo posto in un frigorifero

• Generalmente si ha una riduzione degli artefatti

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TAGLIO AL MICROTOMO

TESSUTO

INCLUSO IN

PARAFFINA

LAMA

SEZIONI

ISTOLOGIA

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RECUPERO DELLE SEZIONI

ISTOLOGIA

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SEZIONI NON COLORATE

VETRINO

PORTAOGGETTO

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lo striscio

di sangue

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche

più diffuse, consente lo

studio microscopico

delle cellule del sangue

e si distingue dal

protocollo “generico” appena delineato

perché, ovviamente,

non richiede il taglio

del tessuto.

ISTOLOGIA

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ATTENZIONE AGLI

ARTEFATTI

GLI ARTEFATTI POSSONO ESSERE DOVUTI A:

• fissazione – cambiamenti ne lla s tru ttu ra de l te s s u to o de lla ce llu la

p rodotti da l fis s a tivo

• inclusione – ecces s ivo ca lore de lla res ina (o il p roces s o d i

conge lamento) pos s ono caus are d is tors ion i

• taglio - può danneggiare la s ezione

- orien tamento de l tag lio

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ORIENTAMENTO DEL

TAGLIO

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RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI SEZIONI

•CORDONE SOLIDO

TUBULO

LAMINA

ISTOLOGIA

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COLORAZIONE

SCOPO

- aumentare il contrasto dei diversi costituenti del tessuto per:

favorirne la osservazione

- identificare costituenti chimici specifici dei tessuti (istochimica)

COME SI OTTIENE

Dopo il taglio le sezioni sono raccolte su un vetrino portaoggetto

Estrazione della paraffina con solventi della paraffina (xilolo o benzolo)

Idratazione delle sezioni tramite passaggio in soluzioni contenenti

concentrazioni sempre più basse di alcool

( alcool acqua)

Trattamento delle sezioni con coloranti (sciolti in soluzioni acquose)

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COLORANTI• i COLORANTI si comportano come molecole acide o basiche

• una base rilascia OH-; un acido rilascia H3O

+

• i coloranti formano legami ionici con le molecole del tessuto

• coloranti basici (+) legano molecole basofile (-)

• coloranti acidi (-) legano molecole acidofile(+)

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COLORANTI

coloranti basici (+)

• includono ematossilina, blu di toluidina e blu di metilene

• colorano glicosamminoglicani (GAG), RNA, DNA (-)

coloranti acidi (-)

• includono eosina, fucsina acida

• colorano proteine citoplasmatiche (+)

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Miscele coloranti

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COLORAZIONI ISTOLOGICHE

Ematos s ilina-eos ina (H & E) è una de lle co lorazioni p iù comuni

Hematoxylin is a bas ic dye (+)

s ta ins ac id ic s ubs tances (e .g . nuc le ic ac ids )

Eos in is an ac id ic dye (-) s ta ins bas ic

s ubs tances (e .g . p ro te ins in cytoplas m)

ISTOLOGIAISTOLOGIA

Basofilia dei

nuclei (acidi)

Acidofilia

del

citoplasma

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COLORAZIONE AZAN-

MALLORY

Fibre

Collagene

blu

Nuclei

rosso

Citoplasma

rosa

ISTOLOGIA

ISTOLOGIA

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METACROMASIA

• Alcuni coloranti legando alcuni composti chimici forniscono loro una colorazione

diversa da quella del colorante stesso.

• ES.: BLU DI TOLUIDINA colora in rosso i proteoglicani acidi della cartilagine

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Istologia

“funzionale”• Colture cellulari

• Coloranti vitali

• Istochimica

• Immunoistochimica

• Immunofluorescenza

L’istologia moderna non

si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti

morfologici e strutturali

di base di cellule e

tessuti.

Esistono numerose

tecniche che consentono

di rispondere a quesiti

sulla composizione

specifica di un tessuto

correlata alle sue

funzioni

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Istochimica

• L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti

Mentre nella biochimica tradizionale il

materiale biologico viene studiato

tipicamente “in provetta”,la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su

sezioni di tessuto, consentendo di

identificare i costituenti in situ.

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ISTOCHIMICA

Cellule del tratto digerente secernenti muco (H&E; PAS-H)

ISTOLOGIA

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Istochimica

• LIPIDI

Sudan Nero, Sudan III (coloranti solubili nei grassi)

• CARBOIDRATI

Reazione Acido-Periodico di Shiff (PAS) che colora di rosso amido, glicogeno, mucopolisaccaridi

• DNA

Reazione di Feulgen che colora di rosso in modo selettivo il DNA

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ISTOCHIMICA: IDENTIFICAZIONE

DI ENZIMI

• Si sfrutta l’attività enzimatica di proteine dei tessuti• Si fornisce il substrato specifico per un enzima

enzima

SUBSTRATO PRODOTTO (colorato)

ESEMPIO: METODO GOMORI-TAKAMATSU per la FOSFATASI

Glicerofosfato + Ca2+ Fosfato di calcio

• Si possono evidenziare

ENZIMI IDROLITICI: fosfatasi, ATPasi, lipasi

OSSIDASI: perossidasi

DEIDROGENASI: lattico deidrogenasi

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ISTOCHIMICA-IDENTIFICAZIONE DI

ENZIMI: PEROSSIDASI

neuroni

ISTOLOGIA

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immunocitochimica

ISTOLOGIA

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Microtubuli nella cellula in interfase

Immunofluorescenza con anticorpi anti-tubulina

ISTOLOGIA

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immunocitochimica

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Il

micro-

scopio

ottico

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MICROSCOPIO Ottico MICROSCOPIO elettronico

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L’Immagine è osservata direttamente dall’occhio

Ingrandimento fino a 1.500X

Potere risolutivo = 0,2 mm Potere risolutivo = 1 nm (0,001 mm.)

Preparazione del campione richiede Preparazione del campione richiede

se congelato solo 20 min almeno 1 giorno

DIFFERENZE TRA MO e TEM

L’immagine si forma su uno schermo fluorescente

Ingrandimento fino a 2.000.000X

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Microscopia elettronica

• Preparazione del tessuto

– Fissazione in glutaraldeide

– Postfissazione in tetrossido di osmio

– Disidratazione con alcol

– Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche dure (epon, araldite)

• Taglio all’ultramicrotomo– Sezioni di 20-40 nm

• Aumento del contrasto

– Coloranti elettronici: metalli pesanti come acetato di uranile o citrato di piombo

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Microscopio elettronico

a scansione

• Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione

• Consente di valutare il rilievo degli

oggetti

• Usata per lo studio delle superfici

cellulari

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globuli

rossi

Microscopio a

scansione:

superficie dei

globuli rossi

ISTOLOGIA

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