ISTOLOGIA - biot3.altervista.orgbiot3.altervista.org/metodi istologia_17.pdf · paraffin wax Remove...
Transcript of ISTOLOGIA - biot3.altervista.orgbiot3.altervista.org/metodi istologia_17.pdf · paraffin wax Remove...
tessuto epiteliale al microscopio ottico
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
come si ottiene, a partire da
tessuti biologici, un’immagine come quella precedente?
Problema 1
• la luce del microscopio può attraversare solo
materiale di spessore molto ridotto
La preparazione di materiale istologico
• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi
Problema 2
• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli
La preparazione di materiale istologico
• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione con aldeidi
– Inclusione
– Congelamento
Problema 3
• i tessuti sono normalmente quasi incolori e
privi di contrasto
La preparazione di materiale istologico
• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato
• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica
sequenza dei passaggi in una
tipica procedura istologica
1. fissazione di un campione di tessuto
2. congelamento o inclusione del pezzo
3. taglio al microtomo
4. montaggio su vetrino
5. “bagni” in soluzioni di coloranti
6. disidratazione e coverslipping
FISSAZIONE
• SCOPO
Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura delle cellule
dalle alterazioni conseguenti la morte cellulare
• COME SI OTTIENE
Trattamento chimico dei tessuti che porta alla precipitazione delle
proteine, tramite la formazione di legami chimici
• una rapida interruzione dei processi vitali della cellula
• inattivazione di enzimi litici
INCLUSIONE
• SCOPO
Fornire consistenza e resistenza al tessuto in modo che
possa essere tagliato in fette sottili (3-10 micron)
• COME SI OTTIENE
Si ottiene tramite l’inclusione in PARAFFINA (MO) che si ottiene tramite la penetrazione della paraffina in tutti gli
spazi intercellulari e anche nelle cellule
INCLUSIONE
• PROCEDURA
- I frammenti sono posti in soluzioni acquose a
concentrazioni di alcool crescenti, in modo da disidratare il
tessuto
- passaggio in un solvente della paraffina: XILOLO o
BENZOLO
- passaggio in paraffina liquida
50 %
ethanol70 %
ethanol95 %
ethanol
100 %
ethanol
benzene/
xyleneparaffin
wax
Remove the water & replace with wax-solventEmbed the oriented specimen in molten wax
Miscible with ethanol;
dissolves wax
Fresh
tissue
10% Formalin fixative
label
INCLUSIONE IN PARAFFINA
La paraffina è liquida a 55-60° C. Solidifica a temperatura ambiente
ISTOLOGIA
TAGLIO
• Preparazione di fettine sottili di tessuto (3-10 micron)
tramite il MICROTOMO
METODI PARTICOLARI DI FISSAZIONE-TAGLIO
• Il tessuto viene congelato e tagliato con il criostato alla
temperatura desiderata
• CRIOSTATO: microtomo posto in un frigorifero
• Generalmente si ha una riduzione degli artefatti
ISTOLOGIA
TAGLIO AL MICROTOMO
TESSUTO
INCLUSO IN
PARAFFINA
LAMA
SEZIONI
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
RECUPERO DELLE SEZIONI
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
SEZIONI NON COLORATE
VETRINO
PORTAOGGETTO
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
lo striscio
di sangue
Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche
più diffuse, consente lo
studio microscopico
delle cellule del sangue
e si distingue dal
protocollo “generico” appena delineato
perché, ovviamente,
non richiede il taglio
del tessuto.
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
ATTENZIONE AGLI
ARTEFATTI
GLI ARTEFATTI POSSONO ESSERE DOVUTI A:
• fissazione – cambiamenti ne lla s tru ttu ra de l te s s u to o de lla ce llu la
p rodotti da l fis s a tivo
• inclusione – ecces s ivo ca lore de lla res ina (o il p roces s o d i
conge lamento) pos s ono caus are d is tors ion i
• taglio - può danneggiare la s ezione
- orien tamento de l tag lio
ORIENTAMENTO DEL
TAGLIO
ISTOLOGIA
RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI SEZIONI
•CORDONE SOLIDO
TUBULO
LAMINA
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
COLORAZIONE
SCOPO
- aumentare il contrasto dei diversi costituenti del tessuto per:
favorirne la osservazione
- identificare costituenti chimici specifici dei tessuti (istochimica)
COME SI OTTIENE
Dopo il taglio le sezioni sono raccolte su un vetrino portaoggetto
Estrazione della paraffina con solventi della paraffina (xilolo o benzolo)
Idratazione delle sezioni tramite passaggio in soluzioni contenenti
concentrazioni sempre più basse di alcool
( alcool acqua)
Trattamento delle sezioni con coloranti (sciolti in soluzioni acquose)
COLORANTI• i COLORANTI si comportano come molecole acide o basiche
• una base rilascia OH-; un acido rilascia H3O
+
• i coloranti formano legami ionici con le molecole del tessuto
• coloranti basici (+) legano molecole basofile (-)
• coloranti acidi (-) legano molecole acidofile(+)
COLORANTI
coloranti basici (+)
• includono ematossilina, blu di toluidina e blu di metilene
• colorano glicosamminoglicani (GAG), RNA, DNA (-)
coloranti acidi (-)
• includono eosina, fucsina acida
• colorano proteine citoplasmatiche (+)
Miscele coloranti
COLORAZIONI ISTOLOGICHE
Ematos s ilina-eos ina (H & E) è una de lle co lorazioni p iù comuni
Hematoxylin is a bas ic dye (+)
s ta ins ac id ic s ubs tances (e .g . nuc le ic ac ids )
Eos in is an ac id ic dye (-) s ta ins bas ic
s ubs tances (e .g . p ro te ins in cytoplas m)
ISTOLOGIAISTOLOGIA
Basofilia dei
nuclei (acidi)
Acidofilia
del
citoplasma
COLORAZIONE AZAN-
MALLORY
Fibre
Collagene
blu
Nuclei
rosso
Citoplasma
rosa
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA
METACROMASIA
• Alcuni coloranti legando alcuni composti chimici forniscono loro una colorazione
diversa da quella del colorante stesso.
• ES.: BLU DI TOLUIDINA colora in rosso i proteoglicani acidi della cartilagine
ISTOLOGIA
Istologia
“funzionale”• Colture cellulari
• Coloranti vitali
• Istochimica
• Immunoistochimica
• Immunofluorescenza
L’istologia moderna non
si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti
morfologici e strutturali
di base di cellule e
tessuti.
Esistono numerose
tecniche che consentono
di rispondere a quesiti
sulla composizione
specifica di un tessuto
correlata alle sue
funzioni
Istochimica
• L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti
Mentre nella biochimica tradizionale il
materiale biologico viene studiato
tipicamente “in provetta”,la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su
sezioni di tessuto, consentendo di
identificare i costituenti in situ.
ISTOCHIMICA
Cellule del tratto digerente secernenti muco (H&E; PAS-H)
ISTOLOGIA
Istochimica
• LIPIDI
Sudan Nero, Sudan III (coloranti solubili nei grassi)
• CARBOIDRATI
Reazione Acido-Periodico di Shiff (PAS) che colora di rosso amido, glicogeno, mucopolisaccaridi
• DNA
Reazione di Feulgen che colora di rosso in modo selettivo il DNA
ISTOCHIMICA: IDENTIFICAZIONE
DI ENZIMI
• Si sfrutta l’attività enzimatica di proteine dei tessuti• Si fornisce il substrato specifico per un enzima
enzima
SUBSTRATO PRODOTTO (colorato)
ESEMPIO: METODO GOMORI-TAKAMATSU per la FOSFATASI
Glicerofosfato + Ca2+ Fosfato di calcio
• Si possono evidenziare
ENZIMI IDROLITICI: fosfatasi, ATPasi, lipasi
OSSIDASI: perossidasi
DEIDROGENASI: lattico deidrogenasi
ISTOCHIMICA-IDENTIFICAZIONE DI
ENZIMI: PEROSSIDASI
neuroni
ISTOLOGIA
immunocitochimica
ISTOLOGIA
Microtubuli nella cellula in interfase
Immunofluorescenza con anticorpi anti-tubulina
ISTOLOGIA
immunocitochimica
ISTOLOGIA
Il
micro-
scopio
ottico
MICROSCOPIO Ottico MICROSCOPIO elettronico
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
L’Immagine è osservata direttamente dall’occhio
Ingrandimento fino a 1.500X
Potere risolutivo = 0,2 mm Potere risolutivo = 1 nm (0,001 mm.)
Preparazione del campione richiede Preparazione del campione richiede
se congelato solo 20 min almeno 1 giorno
DIFFERENZE TRA MO e TEM
L’immagine si forma su uno schermo fluorescente
Ingrandimento fino a 2.000.000X
Microscopia elettronica
• Preparazione del tessuto
– Fissazione in glutaraldeide
– Postfissazione in tetrossido di osmio
– Disidratazione con alcol
– Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche dure (epon, araldite)
• Taglio all’ultramicrotomo– Sezioni di 20-40 nm
• Aumento del contrasto
– Coloranti elettronici: metalli pesanti come acetato di uranile o citrato di piombo
Microscopio elettronico
a scansione
• Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione
• Consente di valutare il rilievo degli
oggetti
• Usata per lo studio delle superfici
cellulari
globuli
rossi
Microscopio a
scansione:
superficie dei
globuli rossi
ISTOLOGIA
ISTOLOGIA