Post on 03-May-2015
Identificare le proteine che sono in grado di interagirecon il prodotto del gene di interesse in modo specifico:
1) Co-immunoprecipitazione
2) Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito”-Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): leproteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatoreIl sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteineche si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, cheagisce in cis, solitamente una sequenza di DNASistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere unRNA o una molecola proteica
I sistemi “a doppio Ibrido”e a “singolo ibrido”in lievito
Phage Display
1) Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene diuna proteina fagica di rivestimento. Il gene modificatoe`espresso come proteina di fusione, che viene incorporatanel virione e risulta visibile sulla superficie del fago.
Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi-ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina
Phage display
Manipolazione genetica degli animali
-Studio della funzione genica-Modelli animali per le malattie
Oocita fecondatoCellule staminali embrionali (ES, post-zigotichenessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)
Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei
Le cellule ES modificategeneticamente costituiscono un mezzoper trasferire DNA estraneo o mutazionispecifiche nella linea germinale del topo
La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puòinattivare un predeterminato gene cromosomico all’internodi una cellula integra“Hit and run”
Vettori di inserzione
La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni
“Tag and exchange”Vettori di sostituzione
HPRT+ TK-
TK esternoalla regionedi omologia
HPRT-
Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di undato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto
Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1
Sistemi di ricombinazione sito-specifica
CRE-loxP del batteriofago P1
CRE Causa di recombinazionemedia la ricombinazione fra due sequenze loxPcon lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa
Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP
loxP loxP
Gene trapping
Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimentoin un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere
espresso
Clonazione animale
Anthony J. F. GRIFFITHS et al.
GENETICA
sesta edizione
Cap 11Isolamento e Manipolazione del gene
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Metodi con cuisi puo’ introdurrein una cellula DNA estraneo
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Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere trasformato
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Ingegneria genetica delle piante
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200kb
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Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto-si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindiViene ereditato come un carattere mendeliano semplice
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Ingegneria genetica degli animali
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Gene targetingKnockout
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Produzione diun topo knockout
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Terapia genica
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