FilmArray system versus RT-PCR method in meningitidis and sepsis management: an example

of routine-emergency integration

Relatore: D.ssa Loria Bianchi, PhD

U.O. Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche- Sezione Microbiologia, Ospedale S.Jacopo, Pistoia

14 ottobre, 2014

Elenco dei microrganismi responsabili di meningiti acute

Rapidità della diagnosi di meningite e prognosi del paziente

Meno gravi delle forme batteriche, di regola a decorso acuto, con risoluzione completa della sintomatologia

Meningite virale

Sono a liquor limpide, asettiche, iniziano con una pleiocitosi con presenza di PMN, seguita poi da aumento di linfociti

Più alta incidenza nei bambini e giovani adulti. Diagnosi: importante per escludere una meningite batterica

Meningite batterica

Postumi come sordità, cecità, paresi, ritardo mentale sono caratteristici delle forme batteriche ed assenti in quelle virali

•Haemophilus influenzae tipo b: bassa mortalità (3%) ma causa di deficit intellettivi in oltre il 30% dei bambini colpiti

•Meningite pneumococcica: alto tasso di letalità (12%), ma solo raramente lascia esiti nei sopravvissuti

Meningite batterica • Aspetto: torbido • Globuli bianchi 1000-5000/µl • Neutrofili % > 80% • Glucosio < 34 mg/dl • R gluliquor/glusiero ≤ 0.23l

Meningite virale • Aspetto: limpido

• Linfomonociti 100-1000/ µl • Glucosio 40-80 mg/dl •R gluliquor/glusiero >0.4

In presenza di cellularità liquorale > 6-200 Leucociti/mm3 le caratteristiche dell’esame chimico-fisico hanno un VPP di meningite infettiva maggiore dell’ 80% ( 3% dei casi)

ALGORITMO DIAGNOSTICO BASATO SUL RISULTATO DELL’ESAME CHIMICO FISICO

In presenza di un liquor : • Limpido • Incolore • Lieve e moderata pleiocitosi: 6-200 Leucociti/mm3 : 27% dei casi

totali (65/240) Prevalenza di PMN (> 60%) si esegue pannello batterico e successivamente pannello virale (12% dei casi) Prevalenza di cellule mononucleate (> 80%) si esegue il pannello virale (15% dei casi ) Presenza di pleiocitosi con PMN < 60% e cellule mononu- cleate < 80%) viene eseguito si il pannello virale che quello batterico (73% dei casi)

VPP DELL’ESAME CHIMICO-FISICO IN PRESENZA DI LIEVE E MODERATA PLEIOCITOSI

Obiettivi

Valutare: 1. sensibilità e specificità della tecnologia FilmArray (TFA:

applicazione “off label” della metodica) su LCR rispetto alle metodiche «tradizionali» e all’RT-PCR

2. il valore predittivo negativo (VPN) della RT-PCR e della

tecnologia TFA su campioni di liquor, sangue e liquidi cavitari (pleurico, peritoneale, pericardico, articolare) con validazione clinica della metodica

3. l’efficacia nella gestione della sepsi calcolando il Turn Around

Time (TAT) rispetto alle metodiche tradizionali

Casistica

Metodologia impiegata

240 campioni di LCR raccolti dal 2009-2014 180 campioni di sangue raccolti dal 2012-2014 9 liquidi cavitari

• Esame chimico fisico LCR : valutazione macroscopica: volume, aspetto, colore valutazione microscopica: conta delle cellule e differenziazione

• Esami biochimici (liquor/siero) ed ematologici: glicemia, elettroliti (Na, K, Cl), enzimi epatici (transaminasi, gamma-GT, etc), proteine totali, albumina, emocromo, PT, PTT;

• Esami microbiologici: estrazione degli antigeni solubili, esame colturale (piastre di agar cioccolato e sangue, etc in CO2), emocoltura (Becton Dikinson)

• Esami molecolari: Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCT) Tecnologia FilmArray (TFA)

Tecnologia FilmArray

Microrganismi e fattori di resistenza valutati con TFA e RT-PCR su LCR e sangue

0

2

4

6

8

10

12

N. meningitidis L. monocytogenes E. coli S. pneumoniae H. influenzae K. pnuemoniae Streptococcogruppo B

N°

pat

oge

ni r

ileva

ti

CONFRONTO TRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEI LIQUOR

Antigeni solubili Batterioscopico Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA

LIQUOR Antigeni solubili Batterioscopico

Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA

N. casi

Sensibilità

N. casi

Sensibilità N.

casi Sensibilit

à N.

casi Sensibilit

à N.

casi Sensibilit

à N.

casi Sensibilit

à N. meningitidis 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 3 100,00% 1 33,33%

L. monocytogenes - - 5 71,43% 4 57,14% 5 71,43% 7 100,00% 4 57,14% E. coli 0 0,00% 1 25,00% 1 14,29% 2 28,57% 4 100,00% 3 75,00%

S. pneumoniae 5 45,45% 5 45,45% 5 71,43% 5 71,43% 11 100,00% 8 72,73% H. influenzae 1 20,00% 1 20,00% 2 28,57% 1 14,29% 5 100,00% 3 60,00%

K. pneumoniae - - 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 1 100,00% 1 100,00% Streptococco gruppo

B 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 0 0,00%

Totale positivi 7 29,17% 13 40,63% 13 40,63% 15 46,88% 32 100% 20 62,50% VPP 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% VPN 89,27% 91,63% 91,63% 92,44% 100,00% -

CONFRONTO FRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEL SANGUE

SENSIBILITÀ E VPN DELLE METODICHE PER LA RICERCA DI PATOGENI NEL SANGUE

RISULTATI SANGUE Emocoltura RT-PCR TFA

Patogeno N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità

N. meningitidis 1 50,00% 2 100,00% 1 50,00%

S. pneumoniae 7 87,50% 8 100,00% 3 37,50%

H. influenzae 4 80,00% 4 80,00% 1 20,00%

E. coli 6 85,71% 5 71,43% 2 28,57%

K. pneumoniae 2 100,00% 1 50,00% 1 50,00%

S. agalactiae 3 100,00% 3 100,00% 1 33,33%

C. albicans 2 100,00% - - 2 100,00%

C. parapsilosis 1 100,00% - - 1 100,00%

Enterococco 5 100,00% - - 2 40,00%

S. aureus 8 100,00% 8 100,00% 4 50,00%

S. marcences 1 100,00% - - 0 0,00%

P. aeruginosa 7 100,00% 7 100,00% 4 57,14%

A. baumannii 1 100,00% - - 1 100,00%

S. capitis 1 100,00% - - - -

P. mirabilis 2 100,00% - - 1 50,00%

Salmonella spp. 1 100,00% - - - -

Totale positivi 52 92,86% 38 67,86% 24 42,86%

Totale germi rilevabili 56 92,86% 42 90,48% 54 44,44%

VPN 96,88% 87,32% 79,49%

CONCLUSIONI (1)

Su LCR, la RT-PCR è la metodica più sensibile (sensibilità e VPN del 100%); inoltre, rilevando il patogeno nella matrice primaria (LCR/sangue) si riduce il TAT (2h e 20’) rispetto all’esame colturale e all’emocoltura.

Su sangue, l’emocoltura è la metodica più sensibile (92,86%) con il più elevato VPN (96.88%) e rimane il «gold» standard nella gestione della sepsi. L’RT-PCR è di grande aiuto per la rapidità di risposta (TAT= 2h e 20 min) anche se ha il limite del ridotto numero di patogeni rilevabili

Su sangue, la TFA deve incrementare la resa estrattiva per aumentare sensibilità (42.66%) e VPN (44.44%) non adeguati per il management della sepsi.

CONCLUSIONI (2)

Su LCR la TFA ha sensibilità più elevata (65%) rispetto al batterioscopico Gram ed estrazione degli antigeni solubili. La facilità di allestimento (2-4 min operatore), di interpretazione del test e il suo TAT di 1h la rendono, quindi, la tecnica più efficace nella gestione del liquor in urgenza

ESAME CHIMICO-FISICO LCR

PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA

Negativo

* in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiologia **colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)

Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)

• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**

Positivo

Pannello batterico

• FilmArray (Pannello BCDI)

• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**

• FilmArray (Pannello BCDI)

Negativo

Pannello virale:

HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster

???

Positivo

Collaboratori Dr. Roberto Giannecchini Dr. Fabiano Santoni Dr. Roberto Toscano Dr. Leonardo Rizzi D.ssa Rosalba Gori D.ssa Cappelli Donatella D.ssa Margherita Niccolai D.ssa Patrizia Lencioni Un grazie particolare a: D.ssa Zaleida Napoli Dr. Swan Donati Dr. Riccardo Lari: Responsabile Area Diagnostica di Laboratorio

Grazie anche a tutto il personale tecnico della microbiologia e

non solo!!

???

ESAME CHIMICO-FISICO LCR

Positivo Negativo

*RT-PCR batterico se LCR arrivato festivo/notturno ** in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiolobia ***colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)

Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)

se LCR festivo/notturno

• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***

• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***

Pannello batterico

Pannello virale:

HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster

PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA

N.meningitidis S.pneumoniae L. monocytogenes E.Coli S-agalactiae H.Influenzae K.pneumoniae

Pannello batterico:

Sensibilità delle metodiche colturali e molecolari per la ricerca di patogeni nei liquidi cavitari

LIQUIDI CAVITARI Casi positivi rilevati con:

ESAME

COLTURALE RT-PCR TFA

Liquidi peritoneali (n=4)

E. coli 2 2 1

K. pneumoniae 1 1 1

P. aeruginosa 1 1 1

Liquidi pleurici (n=4)

S. pneumoniae 1 2 1

K. pneumoniae (KPC) 1 1 1

H. influenzae 0 1 0

Liquidi articolari (n=1)

S. aureus 1 1 1

Totale positivi 7 9 6

Sensibilità 77,78% 100% 66,67%

Kit Produttore Patogeno Target bp

EusepScreen

Adulti Eurospital

N. meningitidis ctrA (capsule polysaccharide

export outer membrane

protein) -

S. pneumoniae lytA (N-acetomuramoyl-L-

alanine amidase) -

H. influenzae

bexA (involved in the

synthesis of the

polysaccharide capsule

structure)

-

Adenovirus L4 (hexon assembly protein) -

EusepScreen

Lattanti Eurospital

K. pneumoniae phoE (outer membrane

phospoporin protein E) -

E. coli uidB (glucuronide transporter) -

S. agalactiae sip (streptococcal surface

immunogenic protein) -

L. monocytogenes iap (invasion associated

protein) -

HSV1 HSV2 VZV R-

gene Argene

HSV1 US7 116

HSV2 US2 123

VZV gp19 114

ENTEROVIRUS R-

gene Argene Enterovirus 5' UTR 146

CMV HHV6,7,8 R-

gene Argene

CMV ppUL83 283

HHV6 U57 116

HHV7 U42 123

HHV8 ORF26 146

EBV R-gene Argene EBV BXLF1 (thymidine kinase) 169