Manuela Miuzzo3, Fabio Munari3, Mattia Vicario 1, Nadia Cavallarin1, Jessica Grigoletto2,

Dino Paladin3 and Alessandro Negro1

Dipt. di Scienze Sperimentali Veterinarie1, Dipt. di Farmacologia e Anestesiologia2, Università di Padova, DOTT DINO PALADIN3 Padova.

atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaM R G S H H H H H H G M A S M T G G Q QatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccagagcaaatggctacaaatgtgM G R D L Y D D D D K D P E Q M A T N VaactgttccagccctgagcgacacacaagaagttatgattacatggaaggaggggatataN C S S P E R H T R S Y D Y M E G G D IagagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtacctgaggatcgataaaagaggcaaaR V R R L F C R T Q W Y L R I D K R G KgtaaaagggacccaagagatgaagaataattacaatatcatggaaatcaggacagtggcaV K G T Q E M K N N Y N I M E I R T V Agttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaattctatcttgcaatgaacaaggaa V G I V A I K G V E S E F Y L A M N K EggaaaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgtaacttcaaagaactaattctgG K L Y A K K E C N E D C N F K E L I LgaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggggaaatgtttE N H Y N T Y A S A K W T H N G G E M FgttgccttaaatcaaaaggggattcctgtaagaggaaaaaaaacgaagaaagaacaaaaaV A L N Q K G I P V R G K K T K K E Q Kacagcccactttcttcctatggcaataacttaa

T A H F L P M A I T -

Espressione e produzione di proteine da DNA ricombinante di interesse scientifico e biotecnologico

STRUTTURA DEL KGF

�194 AA, 22.509 Da

�Singola catena polipeptidica

�Peptide segnale per la

secrezione (N-term)

�7 foglietto-beta (C-term)

�Nessun ponte disolfuro

MHKWILTW ILP TLLYRS CFHIICLVGTIS L ACNDMTP EQMATNVNCS S P ERHTRS YDYMEGGDIRVRRLFCRTQW YLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVES EFYLAMNKEGKLYAKKE CNEDCNFKELILENHYNTYAS AKWTHNGGEMFVALNQKGIP VRGKKTKKEQKTAHFLP MAIT

PROPRIETA’ KGF

�Stabilità lim itata in soluzione acquosa

�Ridotta resistenza al calore

�Sensibile a proteasi di E.coli

�Soggetto a ossidazione dellecisteine

�Tossico per i batteri

S YDYME G G DIRVR RLF CRTQ W YLRID KR GKVKG TQ E MKNNYNIME I RT VAVG IVAI KG VE S E F YLAMNKE GKLYA KK ECNE DCNFKE LILE NHYNTYAS A KW THNG G E MF VALNQKG IP VR GKK T KK E QKTAHF LP MAIT

APPLICAZIONI COMMERCIALI DEL KGF

�Produzione pelle artificiale nel trattamento di ustioni

�Riduzione dei danni alle mucose causati dalla cura oncologica (Palifermina)

�Matrice di affinità per anticoagulanti

Riparazione tissutale

KGF

kDa

2 4

3 6

2 92 4

3 6

2 9

A B

1 giorno

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

conc. KGF

Eu

con

te

3 giorni

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

conc. KGF

Eu

con

te

5 giorni

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

conc. KGF

Eu

cont

e

10 giorni

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

conc. KGF

Eu

co

nte

Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) è una proteina appartenente alla famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti ed ha il ruolo di maggiore mediatore della proliferazione delle cellule epiteliali. Le sue potenziali applicazioni in campo clinico e farmacologico richiedono grandi quantità di proteina attiva a bassi costi. Il KGF, infatti, puòessere impiegato per la riparazione tissutale in numerosi tessuti ed organi, per la produzione di pelle artificiale nel trattamento di grandi ustionati e per la sopravvivenza delle cellule epiteliali delle mucose ai danni causati dalla curachemioterapica.L’espressione del KGF in forma ricombinante, tuttavia, non porta a rese soddisfacenti tanto da rendere necessario l’uso di anticorpi per la rilevazione della proteina stessa. Le difficoltànell’espressione derivano dalle caratteristiche di tossicità e instabilità del KGF.A questo scopo è stato creato un vettore di espressione che aumenti i livelli di KGF prodotto inEscherichia coli attraverso l’ottimizzazione dei codoni e per l’espressione si è utilizzato un plasmide (pRSETB) basato sul promotore del fago T7 RNA polimerasi dipendente e la purificazione èstata condotta tramite cromatografia di affinità per ioni metallici. La proteina purificata all’omogeneicità presenta il peso molecolare atteso ed èbiologicamente attiva

Sistema T7 per l’espressione del KGF in E. coli Vettore di espressione impiegato per E. coli

Sequenza nucleotidica ed amminoacidica del KGF umanoOttimizzazione codoni per E.coli

Espressione del KGF in E. coliA) Lisato batterico totaleB) Western-blot

Determinazione del peso molecolare mediante spettroscopia di massaPeso molecolare teorico calcolato 21961.9KFG purificato dopo colonna Ni 2+-NTA

Determinazione dell’attività biologica.Colture primarie di cheratinociti umani sonostate incubate con KGF. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante saggiodi incorporazione di BrDU

Purificazione per affinitàin colonna Ni 2+-NTA