PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

Anamnesi e sintomi forniscono il primo indizio per la diagnosi di un’infezione virale.

I risultati ottenuti in laboratorio consentono di:

1) confermare la diagnosi mediante l’identificazione dell’agente eziologico virale

2) definire il decorso della malattia

3) monitorare la malattia dal punto di vista epidemiologico

4) indirizzare il medico per la gestione del paziente

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PROCEDURE DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI DI INFEZIONI VIRALI

1)Osservazione al microscopio elettronico del virus

2) Isolamento e identificazione

3) Dimostrazione di componenti virali (proteine, enzimi, acidi nucleici)

4) Valutazione della risposta immunitaria umorale (sierologia)

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4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE

Importanti per:

1.infezioni acute in soggetti immunocompetenti

2.diagnosi di infezioni dovute a virus di difficile isolamento

3.Infezioni in cui la R.I. coincide con comparsa dei sintomi (Rosolia, Epatite A ecc.)

4.virus che causano malattie a lento decorso dopo la sieroconversione (HIV, HTLV-I, virus della rabbia)

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4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE

Importanti ancora per:

5. scopi epidemiologici

6. valutazione del decorso di un’infezione

7. infezione 1aria o reinfez. (f. acuta o cronica)

Non applicabile:

1. quando i sintomi sono precedenti alla R.I. (diagnosi retrospettiva non utile al paziente)

2. in soggetti immunodepressi occorre valutare caso per caso

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CRITERI X DIAGNOSTICARE INFEZIONE PRIMARIA (acuta o recente):

Diagnosi classica su doppio campione siero

1. SIEROCONVERSIONE (dimostrazione di avvenuta sintesi di Acspecifici tra siero acuto e siero convalescente)

2. AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI(>= 4X) tra siero acuto e convalescente

Diagnosi rapida su unico campione (classe Ig)

DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE(presenza transitoria dall’inizio a poche

settimane dopo l’infezione)

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DIAGNOSI di INFEZIONE SECONDARIA (reinfezione o riattivazione):

diagnosi classica su doppio campione siero

AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI(>= 4X) tra siero acuto e convalescente

diagnosi rapida su unico campione (classe Ig)

DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE(assenza o presenza appena rilevabile)

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Tipico Profilo Sierologico dopo Infezione Acuta

Notare che in una reinfezione, le IgM possono essere assenti o presenti transitoriamente a basso livello

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Il decorso di un’infezione può essere determinato valutando un PROFILO SIEROLOGICO (presenza e titolo di Ac diversi diretti contro Ag virali diversi)

Es. Mononucleosi infettiva da EBV

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Es. epatite acuta da HBV

* Possibilità di risultati falsi positivi o falsi negativi

* Formazione di i.c. in circolo (es. Epatite B) che impediscono di evidenziare di Ac

* Possibilità di reazioni crociate tra virus differenti

LIMITI DELLA SIEROLOGIA

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I saggi SIEROLOGICI

Utilizzati per la determinazione, identificazione e quantificazione di antigeni virali e anticorpi in un

campione

Basati sulla formazione di I.C. L’avvenuto legame Ag-Ac è evidenziato tramite diverse modalità di rilevazione:

•Inibizione dell’Emoagglutinazione (IEA)•Neutralizzazione•Fissazione del complemento

•Immunofluorescenza•Test ELISA•Immunoblot (Western Blot)

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LE REAZIONI SIEROLOGICHE

Caratteristiche

• Riconoscimento specifico Ag –Ac (I.C.)

• Rilevano, dirett. o indirettamente, la formazione di un I.C.

• 2 reagenti: un siero (anticorpi) e un antigene (ad es. proteine virali).

Almeno uno dei due deve essere a concentrazione nota

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LE REAZIONI SIEROLOGICHE

Applicazioni

• Disponendo di un antigene noto è possibile dimostrare in quel siero la presenza di anticorpi specifici per quell’antigene

• Disponendo di un siero contenente un anticorpo noto è possibile dimostrare in quel materiale la presenza di un antigene riconosciuto dall’anticorpo

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Reazione di Emoagglutinazione

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EmoagglutinazioneFase 1:Diluizioni seriali del virus vengono incubate con una quantità fissa di G.R.

virus agglutinante virus non agglutinante

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EmoagglutinazioneFase 2: Se il virus agglutina, i G.R. sedimentano formando un ampia area. Diversamente formano un sedimento compatto

virus agglutinante virus non agglutinante

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Emoagglutinazione

Fase 2: In sintesi

virus agglutinante virus non agglutinante

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Emoagglutinazione

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Inibizione dell’Emoagglutinazione

Principio:

Se in un siero sono presenti Ac contro un virus agglutinante, quando lo metto a contatto con il virus, questo perde la sua capacità e l’ulteriore aggiunta di G.R. non provoca agglutinazione.

Se il siero non contiene Ac contro il virus, questo è libero di agglutinare i G.R.

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Inibizione dell’Emoagglutinazione

Il titolo anticorpale corrisponde alla più alta diluizione in cui si

osserva ancora inibizione dell’EA

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Test di NEUTRALIZZAZIONE

Basata sulla proprietà degli anticorpi neutralizzanti di interferire e bloccare l’infettività del virus (di solito bloccano il legame con il recettore)

Un set di anticorpi viene mescolato ad una preparazione virale; l’infettività del virus viene misurata su cellule indicatori.

Permette la definizione dei diversi sierotipi di un virus:( HSV1 e HSV2, Poliovirus 1, 2 e 3, Coxsackie A e B)

Utile sia in diagnostica che per lo sviluppo di vacciniDr. Massimo Giorgi unipi -2008

Test di NEUTRALIZZAZIONE

dopo 5 giorni

cellule KB

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Presenza di Ac nel siero Assenza di Ac nel siero

Complemento fissato Complemento libero

Fissazione del complementoIMPORTANTE: occorre scomplementare il siero del paziente

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Fissazione del Complemento

Fissazione del Complemento in Micropiastra. Le righe 1 e 2 sono ottenute con campioni di siero rispettivamente in fase acuta e convalescente. (usate diluzioni 1 a 2 dei sieri). L’incremento del titolo è significativo e indica una recente infezione.

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Test ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• Struttura del supporto di matrice inerte dove avviene il test ELISA

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Test ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• 1° step: si aggiunge il siero del paziente

Si forma l’immunocomplessoDr. Massimo Giorgi unipi -2008

Test ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

2° step: A) Ab α IgG (IgM) umane se si ricercano gli Ab

B) Ab α Ag specifico se si ricercano gli Ag virali

Questi Ab sono coniugati con un enzima che catalizza una reazione colorimetrica (di solito una perossidasi)

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Test ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

3° step: aggiunta del cromogeno, substrato della reazione catalizzata dalla perossidasi.

L’intensità della colorazione è proporzionale alla quantità di Ab (o Ag) specifici presenti nel siero.

La lettura è effettuata tramite uno fotometro a lunghezza d’onda determinata (tra 450 e 650 nm)

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Virologia Applicata E.A.

TEST ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

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ELISA for HIV antibodyELISA for HIV antibody

Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity

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IMMUNOFLUORESCENZA per la ricerca degli Ab

• Come principio è analoga al test ELISA

Si legge al microscopio a fluorescenza a data λ

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IMMUNOBLOT (Western Blot)

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Western BlotWestern Blot

HIV-1 Western BlotHIV-1 Western Blot• Lane1: Positive ControlLane1: Positive Control• Lane 2: Negative Lane 2: Negative

ControlControl• Sample A: NegativeSample A: Negative• Sample B: Sample B:

IndeterminateIndeterminate• Sample C: PositiveSample C: Positive

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