Post on 05-Mar-2021
ELETTROFORESI
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico.
Anioni → ANODO (+) Cationi → CATODO (-)
ELETTROFORESI
Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico.
Anioni → ANODO (+) Cationi → CATODO (-)
f
qEv
ELETTROFORESI
Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico.
formaviscosità
dimensioniporimolecola
Anioni → ANODO (+) Cationi → CATODO (-)
v = velocità di migrazioneμ = mobilità elettroforeticaE = gradiente di voltaggio del campo elettricoq = carica della particellaf = coefficiente frizionale del mezzo
f
qEv
Migrazioneinversamenteproporzionalealla dimensionedelle particelle
ELETTROFORESI
ELETTROFORESITecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie
all’applicazione di un campo elettrico.
formaviscosità
dimensioniporimolecola
Anioni → ANODO (+) Cationi → CATODO (-)
v = velocità di migrazioneμ = mobilità elettroforeticaE = gradiente di voltaggio del campo elettricoq = carica della particellaf = coefficiente frizionale del mezzo
f
qEv
Migrazioneinversamenteproporzionalealla dimensionedelle particelle
E
vμ
Mobilità elettroforetica Velocità di Migrazione (cm/sec) per unità di campo (Volt/cm)
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
ELETTROFORESI E RAPPORTO CARICA-MASSACharge-to-mass ratiothis ratio significantly affects the mobility of a macromolecule through a solution whendriven by an electric field (two molecules of identical mass but different charge will moveat different rates in an electric field).Since at neutral pH, the majority of the net charge on DNA is derived from the negativelycharged phosphate groups in the DNA backbone, as DNA increases in size, the totalcharge increases at the same rate. The resulting charge-to-mass ratio therefore remainsconstant, and DNA fragments of different sizes all move at about the same rate in anelectric field. For separation of the fragments according to size, it is necessary to force thefragments to migrate through a molecular sieve or matrix of many small pores that allowsthe smaller fragments to move faster than the larger fragments.
Charge-to-mass ratioaffects the mobility of a macromolecule(two molecules of identical mass but different charge will move at different ratesSince at neutral pH, the majority of the net charge on DNA is derived from the negativelycharged phosphate groups in the DNA backbone, as DNA increases in size, the totalcharge increases at the same rate. The resulting charge-to-mass ratio therefore remainsconstant, and DNA fragments of different sizes all move at about the same rate in anelectric field. For separation of the fragments according to size, it is necessary to force thefragments to migrate through a molecular sieve or matrix of many small pores that allowsthe smaller fragments to move faster than the larger fragments.
ELETTROFORESI E RAPPORTO CARICA-MASSA
Charge-to-mass ratiothis ratio significantly affects the mobility of a macromolecule through a solution whendriven by an electric field (two molecules of identical mass but different charge will moveat different rates in an electric field).At neutral pH, the majority of the net charge on DNA is derived from the negativelycharged phosphate groups in the DNA backbone. As DNA increases in size, the totalcharge increases at the same rate. The resulting charge-to-mass ratio therefore remainsconstant. DNA fragments of different sizes all move at about the same rate in an electricfield. For separation of the fragments according to size, it is necessary to force thefragments to migrate through a molecular sieve or matrix of many small pores that allowsthe smaller fragments to move faster than the larger fragments.
ELETTROFORESI E RAPPORTO CARICA-MASSA
Charge-to-mass ratioaffects the mobility of a macromolecule through a solution when driven by an electric field(two molecules of identical mass but different charge will move at different rates)At neutral pH, the majority of the net charge on DNA is derived from the negativelycharged phosphate groups in the DNA backbone: As DNA increases in size, the totalcharge increases at the same rate. The resulting charge-to-mass ratio remains constant,and DNA fragments of different sizes all move at about the same rate in an electric field.
For separation of the fragments according to size, it is necessary to force the fragments tomigrate through a molecular sieve or matrix of many small pores that allows the smallerfragments to move faster than the larger fragments.
Rapporto carica massa costante
Necessario un "setaccio" per separare per dimensioni
ELETTROFORESI E RAPPORTO CARICA-MASSA
GEL DI AGAROSO
• Forma una matrice semisolida avente pori di dimensionediversa in funzione della concentrazione utilizzata• Maggiore è la [agarosio], più piccoli sono i pori nel gel.
Agarosio: polimero lineare estratto da un’alga marina, la cui struttura di base è:
D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattopiranoso
Legame O-glicosidico
GEL DI AGAROSO
• Forma una matrice semisolida avente pori di dimensionediversa in funzione della concentrazione utilizzata• Maggiore è la [agarosio], più piccoli sono i pori nel gel.
Agarosio: polimero lineare estratto da un’alga marina, la cui struttura di base è:
Si forma unreticolo tridimensionale
D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattopiranoso
Legame O-glicosidico
GEL DI AGAROSO
• Forma una matrice semisolida avente pori di dimensionediversa in funzione della concentrazione utilizzata• Maggiore è la [agarosio], più piccoli sono i pori nel gel.
Agarosio: polimero lineare estratto da un’alga marina, la cui struttura di base è:
Il DNA che possiede carica negativa apH neutro, migrerà verso l’anodo (polo +)
D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattopiranoso
Legame O-glicosidico
NATURA CHIMICA DEL GEL DI AGAROSO
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
NATURA CHIMICA DEL GEL DI AGAROSO
Fra i polimeri di agaroso si formano ponti H
Diametro pori:Da 50 a >200 nm
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
0.8% Agaroso -barbital
1mm -20V/cm
7cm
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Da cosa dipende la VELOCITÀ DI MIGRAZIONE
DIMENSIONE DEL DNA
CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
CONFORMAZIONE DEL DNA
VOLTAGGIO APPLICATO circa 5 Volt/cm (distanza anodo-catodo)
PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO
COMPOSIZIONE E FORZA IONICA DEL TAMPONE
La velocità di migrazione del DNA all’interno di un gel di agarosio èinfluenzata da numerosi parametri:
V =Log10 bp
KRelazione di proporzionalità diretta tra pb e PM:- molecole grandi migrano lentamente- molecole piccole migrano velocemente(il parametro K varia al variaredella concentrazione di agarosio nel gel)
DIMENSIONE DEL DNA
V =Log10 bp
KRelazione di proporzionalità diretta tra pb e PM:- molecole grandi migrano lentamente- molecole piccole migrano velocemente(il parametro K varia al variaredella concentrazione di agarosio nel gel)
DIMENSIONE DEL DNA
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Trascinamento di molecole prive di carica
Cariche negative superficie supporto
Cationi tampone
Stoppini – Biochimica applicata – Capitolo 9
Trascinamento di molecole prive di carica
Cariche negative superficie supporto
Cationi tampone
Agaroso alta endosmosi se impuro - Solfati
CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
Dire
zion
e m
igra
zion
e
[agarosio]%p/v
0.30.60.70.91.21.52.0
5.000 – 60.0001.000 – 20.000800 – 10.000500 – 7.000400 – 6.000200 – 3.000100 – 2.000
Range diseparazione (bp)
CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
Dire
zion
e m
igra
zion
e
[agarosio]%p/v
0.30.60.70.91.21.52.0
5.000 – 60.0001.000 – 20.000800 – 10.000500 – 7.000400 – 6.000200 – 3.000100 – 2.000
Range diseparazione (bp)
[agarosio]%p/v
0.30.60.70.91.21.52.0
5.000 – 60.0001.000 – 20.000800 – 10.000500 – 7.000400 – 6.000200 – 3.000100 – 2.000
Range diseparazione (bp)
CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
Dire
zion
e m
igra
zion
e
log μ = log μ0 – KRT
μ0 = mobilità libera del DNA
KR è il coefficiente di ritardo(costante legata alle proprietà del gel e a dimensione/forma delle molecole sottoposte a migrazione)
Relazione lineare tra il logaritmodella mobilità elettroforetica (μ)e la concentrazione del gel (T).
CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
[agarosio]%p/v
0.30.60.70.91.21.52.0
5.000 – 60.0001.000 – 20.000800 – 10.000500 – 7.000400 – 6.000200 – 3.000100 – 2.000
Range diseparazione (bp)
E
vμ
Mobilità elettroforetica Velocità di Migrazione (cm/sec) per unità di campo (Volt/cm)
CONFORMAZIONE DEL DNA
DNA lineare, circolare e superavvolto dello stesso peso molecolarehanno diversa velocità di migrazione
Mig
razion
e
log μ = log μ0 – KRTμ0 = mobilità libera del DNAKR è il coefficiente di ritardo(costante legata alle proprietà del gel
e a dimensione/forma delle molecole)
CONFORMAZIONE DEL DNA
Mig
razion
e
DNA lineare, circolare e superavvolto dello stesso peso molecolarehanno diversa velocità di migrazione
CONFORMAZIONE DEL DNA
Mig
razion
e
DNA lineare, circolare e superavvolto dello stesso peso molecolarehanno diversa velocità di migrazione
CONFORMAZIONE DEL DNA
Mig
razion
e
- La forma CIRCOLARE migra più lentaperché è la più “ingombrante” e "fatica" di più a muoversi all’interno dei pori del gel.
- La forma LINEARE si colloca a metà(la forma lineare è, ad esempio, quella che si ritrova come prodotto di digestione di un plasmide o nella PCR).
- La forma SUPERAVVOLTA migra più veloceperché è più compatta.
DNA lineare, circolare e superavvolto dello stesso peso molecolarehanno diversa velocità di migrazione
Proporzionalità diretta a bassi voltaggi (5 V/cm)v = E.q
f
COMPOSIZIONE IN BASI
NON influenza la migrazione
VOLTAGGIO APPLICATO
Tuttavia…
la potenza generata viene dissipata sotto forma di calore
Proporzionalità diretta a bassi voltaggi (5 V/cm)
VOLTAGGIO APPLICATO
C = i2 R tC = calore dissipatoi = intensità di correnteR = resistenza elettricat = tempo
Tuttavia…
la potenza generata viene dissipata sotto forma di calore
EFFETTO JOULE
v = E.qf
COMPOSIZIONE IN BASI
NON influenza la migrazione
EFFETTO JOULE ED ELETTROFORESI
C = i2 R t
RISVOLTI PRATICI DELL’EFFETTO JOULE
+ ghiaccio1) 2) DDP ≤ di 5 Volt/cm
RISVOLTI PRATICI DELL’EFFETTO JOULE
+ ghiaccio 2) DDP ≤ di 5 Volt/cm1)
3) Dispersione NON omogenea del calore
TEMPERATURA NON OMOGENEA NEL GEL
3)
La T ha effetto su µ.
Lo stesso campione migra diversamente per effetto Joule
PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO
• Colorante fluorescente (intercalante)che consente di visualizzare il DNA
• Assorbimento negli U.V. ed emissionenel visibile (590 nm, arancione).
• Riduce la velocità di migrazione dicirca il 15%
Bromuro di etidio
PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO
Bromuro di etidio
• Colorante fluorescente (intercalante)che consente di visualizzare il DNA
• Assorbimento negli U.V. ed emissionenel visibile (590 nm, arancione).
• Riduce la velocità di migrazione dicirca il 15%
U.V.
Sensibilità 5 ng DNA
BROMURODI ETIDIO
Senza intercalante il DNANON è visibile a occhio nudo
Forza ionica molto ridotta → condu vità ele rica bassa → migrazione lenta
Forza ionica elevata → condu vità alta → si genera una gran quan tà di calore che può sciogliere il gel e denaturare il DNA.
Il più comune tampone utilizzato è il TAE.
COMPOSIZIONE E FORZA IONICA DEL TAMPONE
Buffer TAETRIS + Acido acetico glaciale + EDTA
- Conduzione elettrica- Uniformità forza ionica e pH, uguale per gel e corsa. v = E.q
f
Perché è importante la costanza del pH?
Preparazione di un gel di agarosio Preparare una quantità di buffer sufficiente per la preparazione del gel e per la corsa elettroforetica –nella cella il bufferdeve coprire completamente la superficie del gel- Utilizzare lo stesso buffer per gel e corsa in quanto piccole differenze diforza ionica o pH potrebbero interferire con la mobilità del DNA. Preparare il tray della cella elettroforetica scegliendo il pettine appropriato; il pettine determina le dimensioni dei pozzettinei quali saranno caricati i campioni Sciogliere un’opportuna quantità di agarosio in un adeguato volume di buffer e riscaldare la soluzione fino a quandoapparirà trasparente Aggiungere il bromuro di etidio Versare il gel nel supporto e lasciarlo solidificare Quando il gel sarà solidificato porlo nella cella immerso nel buffer ed estrarre il pettine Caricare i campioni precedentemente preparati con un opportuno tracciante, che serve come indicatore di corsa(es: orange), ed addensante (es. glicerolo), che consentire al campione di depositarsi nel pozzetto di caricamento Chiudere la cella con l’apposito coperchio e collegarla al generatore di corrente Al termine della corsa estrarre il gel dal supporto e osservarlo ai raggi UV
Preparazione di un gel di agarosio Preparare una quantità di buffer sufficiente per la preparazione del gel e per la corsa elettroforetica –nella cella il bufferdeve coprire completamente la superficie del gel- Utilizzare lo stesso buffer per gel e corsa in quanto piccole differenze diforza ionica o pH potrebbero interferire con la mobilità del DNA. Preparare il tray della cella elettroforetica scegliendo il pettine appropriato; il pettine determina le dimensioni dei pozzettinei quali saranno caricati i campioni Sciogliere un’opportuna quantità di agarosio in un adeguato volume di buffer e riscaldare la soluzione fino a quandoapparirà trasparente Aggiungere il bromuro di etidio Versare il gel nel supporto e lasciarlo solidificare Quando il gel sarà solidificato porlo nella cella immerso nel buffer ed estrarre il pettine Caricare i campioni precedentemente preparati con un opportuno tracciante, che serve come indicatore di corsa(es: orange), ed addensante (es. glicerolo), che consentire al campione di depositarsi nel pozzetto di caricamento Chiudere la cella con l’apposito coperchio e collegarla al generatore di corrente Al termine della corsa estrarre il gel dal supporto e osservarlo ai raggi UV
Esistono particolari gel di agarosio che rispondono a diverse necessità:Minigel: si tratta di piccoli gel poco concentrati utilizzati per analizzare in tempi brevi piccole quantità di DNA.Gel di agarosio alcalino: viene utilizzato soprattutto per l’analisi di molecole a singolo filamento e spesso per analizzare icDNA.Low-melting-temperature gel: si tratta di gel costituiti da agarosio modificato chimicamente per sciogliersi e gelificare abasse temperature. Tale proprietà è utile per poter meglio recuperare il DNA ed utilizzarlo per altre analisi quali digestionienzimatiche. In questo caso si può excidere la banda relativa al frammento di DNA di interesse ed incubarla direttamentecon la mix di reazione a 37°C (temperatura a cui agiscono la maggior parte degli enzimi di restrizione). A tale temperatura ilgel utilizzato torna fluido e libera il DNA nella soluzione dove può essere liberamente digerito dall’enzima.
Cella elettroforetica per corsa orizzontale
EXCISIONE DEI CAMPIONI DA GEL DI AGAROSODopo separazione per elettroforesi, è possibile estrarre i frammenti di DNA per successivi utilizzi (es. clonaggio)
Bisturi «Gel extraction tool»
Basso tempo di esposizione agli UV per non danneggiare il DNA!!
1 2 3
Dopo separazione per elettroforesi, è possibile estrarre i frammenti di DNA per successivi utilizzi (es. clonaggio)
Bisturi «Gel extraction tool»
Basso tempo di esposizione agli UV per non danneggiare il DNA!!
1 2 3
EXCISIONE DEI CAMPIONI DA GEL DI AGAROSO
Dopo separazione per elettroforesi, è possibile estrarre i frammenti di DNA per successivi utilizzi (es. clonaggio)
Bisturi «Gel extraction tool»
Basso tempo di esposizione agli UV per non danneggiare il DNA!!
1 2 3
In commercio diversi kit per estrazione e purificazione (es. da enzimi, sali, agaroso, bromuro dietidio, ecc.) di frammenti di DNA (anche fino a 10 kB) da digestioni enzimatiche o PCR, conrecupero del campione di DNA fino all’80%
EXCISIONE DEI CAMPIONI DA GEL DI AGAROSO
oppure
Dopo separazione per elettroforesi, è possibile estrarre i frammenti di DNA per successivi utilizzi (es. clonaggio)
Bisturi «Gel extraction tool»
Basso tempo di esposizione agli UV per non danneggiare il DNA!!
1 2 3
In commercio diversi kit per estrazione e purificazione (es. da enzimi, sali, agaroso, bromuro dietidio, ecc.) di frammenti di DNA (anche fino a 10 kB) da digestioni enzimatiche o PCR, conrecupero del campione di DNA fino all’80%
Estrazione, purificazione e controllo qualità della bande
EXCISIONE DEI CAMPIONI DA GEL DI AGAROSO
oppure
ELETTROFORESI DI ACIDI NUCLEICI
- Gel: La > parte dei campioni di DNA comunemente analizzata perelettroforesi è più grande di una proteina, perciò l’agarosio risulta ilsistema di elezione.
Agaroso 0.3%: doppie eliche da 5.000 a 60.000 bpAgaroso 2%: doppie eliche da 100 a 3.000 bp
ELETTROFORESI DI ACIDI NUCLEICI
- Gel: La > parte dei campioni di DNA comunemente analizzata perelettroforesi è più grande di una proteina, perciò l’agarosio risulta ilsistema di elezione.
Agaroso 0.3%: doppie eliche da 5.000 a 60.000 bpAgaroso 2%: doppie eliche da 100 a 3.000 bp
- Campione: il DNA come prodotto di PCR, in forma di vettore, come campione digerito (es. vettore + inserto), ecc.
ELETTROFORESI DI ACIDI NUCLEICI
- Gel: La > parte dei campioni di DNA comunemente analizzata perelettroforesi è più grande di una proteina, perciò l’agarosio risulta ilsistema di elezione.
Agaroso 0.3%: doppie eliche da 5.000 a 60.000 bpAgaroso 2%: doppie eliche da 100 a 3.000 bp
- Campione: il DNA come prodotto di PCR, in forma di vettore, come campione digerito (es. vettore + inserto), ecc.
- Tracciante: orange, blu di bromofenolo, xilen-cianolo. Aggiunto al campione come indicatore del fronte elettroforetico, assieme ad un addensante.
ELETTROFORESI DI ACIDI NUCLEICI
- Gel: La > parte dei campioni di DNA comunemente analizzata perelettroforesi è più grande di una proteina, perciò l’agarosio risulta ilsistema di elezione.
Agaroso 0.3%: doppie eliche da 5.000 a 60.000 bpAgaroso 2%: doppie eliche da 100 a 3.000 bp
- Campione: il DNA come prodotto di PCR, in forma di vettore, come campione digerito (es. vettore + inserto), ecc.
- Tracciante: orange, blu di bromofenolo, xilen-cianolo. Aggiunto al campione come indicatore del fronte elettroforetico, assieme ad un addensante.
- Marcatore di dimensioni: DNA fagici o plasmidi frammentati per restrizione enzimatica. Per confrontare migrazione/dimensione dei campioni
Restrizione enzimaticaPuò servire per determinare la presenza di una mutazione all’interno di unaregione di DNA amplificata per PCR.La mutazione può inserire o sopprimere un sito di restrizione, evento sfruttatoper discriminare tra DNA normale e DNA mutato.
La quantità di enzima richiesto per digerire 1 µg di DNA di fago λ in1 ora a XX°C in un volume di reazione di 50 µL.
Unità enzimatica per un enzima di restrizione
Restrizione enzimaticaPuò servire per determinare la presenza di una mutazione all’interno di unaregione di DNA amplificata per PCR.La mutazione può inserire o sopprimere un sito di restrizione, evento sfruttatoper discriminare tra DNA normale e DNA mutato.
Unità enzimatica per un enzima di restrizione
Dettaglio sperimentale:Attenzione alla star activity!!(L’enzima taglia il DNA a livello di siti simili, ma non identici, a quelli riconosciuti)
La quantità di enzima richiesto per digerire 1 µg di DNA di fago λ in1 ora a XX°C in un volume di reazione di 50 µL.
Normale360 bp
Mutazione290 bp 70 bp
Restrizione enzimatica
Unità enzimatica per un enzima di restrizione
Può servire per determinare la presenza di una mutazione all’interno di unaregione di DNA amplificata per PCR.La mutazione può inserire o sopprimere un sito di restrizione, evento sfruttatoper discriminare tra DNA normale e DNA mutato.
La quantità di enzima richiesto per digerire 1 µg di DNA di fago λ in1 ora a XX°C in un volume di reazione di 50 µL.
Normale360 bp
Indigerito360 bp
Mutazione290 bp 70 bp
Eterozigote360 bp 290 bp 70 bp
Restrizione enzimatica
Unità enzimatica per un enzima di restrizione
Può servire per determinare la presenza di una mutazione all’interno di unaregione di DNA amplificata per PCR.La mutazione può inserire o sopprimere un sito di restrizione, evento sfruttatoper discriminare tra DNA normale e DNA mutato.
La quantità di enzima richiesto per digerire 1 µg di DNA di fago λ in1 ora a XX°C in un volume di reazione di 50 µL.
A B C D E F G H I L
Agaroso 2%
Marcatore di PM
360 bp
Restrizione enzimatica
A B C D E F G H I L
Agaroso 2%
Marcatore di PM
360 bp
Agaroso 2.5%
bp
242331404
Mutazione
Normale
Restrizione enzimatica
A B C D E F G H I L
Agaroso 2%
Marcatore di PM
360 bp
Agaroso 2.5%
bp
242331404
Mutazione
Normale
Restrizione enzimatica
Eterozigote Omozigote
Normale
Concentrazionifinali
Volumi(μl)
25 μl
Concentrazioniiniziali
500 ng/μL10X100%20 U/μL
100 ng/μL1X1%5 U/camp.
52.50.250.2517
C1 x V1 = C2 x V2Per i calcoli:
Oppure: si ragiona sui rapporti di concentrazione dei reagenti tenendo in considerazione il volume finale
DNABufferBSAEnzimaH2O
Reagenti
Tempo di digestione: X oreTemperatura: X °C
Protocollo di digestione con enzimi di restrizione
Concentrazionifinali
Volumi(μl)
25 μl
Concentrazioniiniziali
500 ng/μL10X100%20 U/μL
100 ng/μL1X1%5 U/camp.
52.50.250.2517
C1 x V1 = C2 x V2Per i calcoli:
Oppure: si ragiona sui rapporti di concentrazione dei reagenti tenendo in considerazione il volume finale
DNABufferBSAEnzimaH2O
Reagenti
Tempo di digestione: X oreTemperatura: X °C
Protocollo di digestione con enzimi di restrizione