E’ POSSIBILE “FAR EVOLVERE”

LE PROTEINE IN LABORATORIO

EVOLUZIONE GUIDATA

PROTEINE CON FUNZIONI OTTIMIZZATE O “NUOVE”

Selezione

Ricombinazione

Mutazione

VARIABILITA’ GENETICA

L’EVOLUZIONE NATURALE RICHIEDE TEMPO

IN LABORATORIO UN ESPERIMENTO DI EVOLUZIONE GUIDATA PUO’ ESSERE

COMPLETATO IN ALCUNI MESI

EVOLUZIONE GUIDATA - STRATEGIA GENERALE

IL PERCORSO SEGUITO DA UNA PROTEINA NEL CORSO DELLA SUA EVOLUZIONE PUO’ ESSERE DESCRITTO COME: Fitness landscape (scenario del successo evolutivo): descrive le possibilità che si presentano ad una data proteina in termini di fitness. Per esplorare queste possibilità la sequenza della proteina deve variare all’interno di uno…. Spazio di sequenza: La complessità della diversità dei sistemi proteici:

20n

E’ MOLTO DIFFICILE ESPLORARE TUTTE LE POSSIBILITA’ IN UN TEMPO RAGIONEVOLE

LA VARIABILITA’ DELLA POPOLAZIONE DI PROTEINE DA OTTENERE DI SOLITO E’ LIMITATA DA RAGIONI OGGETTIVE

STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA

Complessità (genotipo)

Espressione

Identificazione del fenotipo

PRINCIPALI STRATEGIE DI ESPRESSIONE

Requisito essenziale: associazione genotipo-fenotipo

•  librerie di espressione in procarioti ed eucarioti (cell display)

•  librerie di espressione su batteriofagi (phage display)

Problemi: efficienza di introduzione del DNA nelle cellule

• librerie di espressione su ribosomi (ribosome display)

- mRNA tradotti in vitro su ribosomi - arresto della traduzione indotto - la proteina viene esposta sulla superficie del ribosoma

Problemi: valido soprattutto per proteine con proprietà di legame

IDENTIFICAZIONE DEI CLONI

SELEZIONE IN VIVO

SCREENING

SCREENING

Alcune proprietà misurabili: -torbidità -pH -Assorbanza/fluorescenza -Calore

CONFRONTO TRA STRATEGIE DI IDENTIFICAZIONE

METODO VANTAGGI LIMITI --------------------------------------------------------- SELEZIONE (connessione attività-vitalità cellulare)

selezione dei positivi falsi positivi (vitali ma non ottimali)

-----------------------------------------------------------------------------------

      eliminazione di varianti misura indiretta non volute enzimatica

-----------------------------------------------------------------------------------       saggi su popolazioni complessità della

molto vaste (ca. 1010) manipolazione ----------------------------------------------------------------------------------- SCREENING (cloni individuali - spesso richiesti substrati cromogenici o fluorogenici)

saggio di attività diretto complessità della manipolazione

-----------------------------------------------------------------------------------    saggi in condizioni saggi su popolazioni non vaste

non naturali (ca. 105 se automatico -----------------------------------------------------------------------------------      valutazione di più parametri precisione abbassa la resa -----------------------------------------------------------------------------------

CHE VUOL DIRE POPOLAZIONE COMPLESSA?

IN REALTA’ I VALORI CHE SI RAGGIUNGONO SONO INFERIORI (20-40%)

METODI PER CREARE UNA POPOLAZIONE COMPLESSA

•  ceppi ad elevata frequenza di mutagenesi •  mutageni chimici •  PCR a bassa fedeltà (error-prone)

- attività 3’->5’ esonucleasica -  MnCl2 - - sbilanciamento dei precursori -  numero di cicli aumentato - pH

*Problemi: preferenza di mutazioni A<->G e T<->C bassa probabilità di sostituzioni multiple vicine

MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI ESTESE minore livello di complessità ma su tutta la sequenza

•  Random Insertion deletion mutagenesis (RID): tagli casuali con Cs(IV)-EDTA

•  Frammenti del gene originario sono sostituiti da oligonucleotidi sintetici contenenti:

- singole posizioni casuali - più posizioni casuali - sottoframmenti semi-casuali

*Oligonucleotidi: sintesi automatica in fase solida (codoni di stop evitati --> solo G o C in terza posizione

MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI LIMITATE Maggiore livello di complessità locale

In generale i risultati migliori si ottengono inserendo poche mutazioni per volta in cicli successivi

Directed Evolution

Mutazioni

Moltissimi Geni Mutati

Identificazione della

proprietà voluta

Gene originale

Proteine

STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE GUIDATA

MOLTE MUTAZIONI LETALI

PER EVITARE LE VARIANTI NON FUNZIONALI SI PUÒ SFRUTTARE IL LAVORO GIÀ FATTO DALLA EVOLUZIONE NATURALE!

In natura

In laboratorio

RICOMBINAZIONE

•  DNA shuffling: frammentazione + PCR

•  StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR

•  Random-priming: primers casuali + PCR

UTILIZZA LA VARIABILITA’ GIA’ PRESENTE IN REGIONI SEPARATE DI UNA SEQUENZA (O PIU’ SEQUENZE)

RICOMBINAZIONE

SU GENE SINGOLO

SU GENI MULTIPLI DI UNA FAMIGLIA PROTEICA

Incroci di molecole

LO SPAZIO DI SEQUENZA ESPLORATO E’ MOLTO DIVERSO

CEFALOSPORINASI

Identità

Singolo ciclo

ANCHE I RISULTATI SONO DIVERSI!

INTERFERONI = AGENTI ANTIVIRALI E ANTITUMORALI

20 GENI NON-ALLELICI DUPLICATI CON ELEVATA IDENTITA’ DI SEQUENZA (85-98%)

DNA SHUFFLING SU IFN-alfa2a

L’EVOLUZIONE GUIDATA HA PRODOTTO RISULTATI IMPORTANTI

PROTEINE PRIMORDIALI = PROTEINE “TUTTOFARE”

PROTEINE MODERNE= PROTEINE SPECIALIZZATE

COSA CI SUGGERISCE?

GLI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA HANNO AVUTO MENO SUCCESSO DEL PREVISTO

SI TROVA QUELLO CHE SI CERCA!

MIGLIORARE LE FUNZIONI ESISTENTI E’ PIU’ FACILE CHE TROVARE FUNZIONI NUOVE

I PIU’ RECENTI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA SONO CONCETTUALMENTE DIVERSI

E FORSE PIU’ SIMILI ALLA EVOLUZIONE NATURALE

POPOLAZIONE VARIA, “ROBUSTA” E CON

QUALITA’ NASCOSTE

SELEZIONE

NUOVE FUNZIONI

MUTAZIONI NEUTRALI

NO SELEZIONE

NUOVA FUNZIONE

GENE ORIGINALE